Name: dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19
Uploaded: 2022-02-16T15:00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19 at JoVE.com

Los autores desean agradecer al Rush Biomarker Development Core por el uso de sus instalaciones, al Biorepositorio Rush para la inscripción de sujetos y el procesamiento de bioespecímenes, y a los números de subvención sci16 (J.R.S. y J.A.B.) de la Iniciativa de la Red de Evaluación de Coronavirus de Chicago (Chicago CAN) de la Fundación Walder SCI16 (J.R.S. y J.A.B.) y 21-00147 (J.R.S. y J.A.B.) y un premio de la Fundación Swim Across America (J.A.B.).

Todos los sujetos se inscribieron con consentimiento informado por escrito con la aprobación completa de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Centro Médico de la Universidad de Rush bajo el protocolo ORA 20101207 con todas las pautas institucionales para la realización de investigaciones éticas observadas. La sangre se recolectó a través de flebotomía convencional en vacutainers de lavanda (K2EDTA) y se procesó con los protocolos recomendados. El plasma resultante se archivó a -80 °C hasta que se realizaron las evaluaciones.
1. Preparación de microesferas conjugadas con antígenos
<ol><li>Seleccione tres viales diferentes de microesferas magnéticas con regiones de cuentas únicas, registrando la identificación de la cuenta y la información del lote para cada vial utilizado. NOTA: Se seguirán los siguientes pasos para cada región distinta de la microesfera. Las microesferas son sensibles a la luz y deben protegerse de la exposición prolongada a la luz. Durante los pasos de lavado, tenga cuidado de no perturbar las microesferas. Si se le molesta, permita una segunda separación de 60 s.</li>
	<li>Vórtice el stock de microesferas durante 60 s y sonice durante 5 minutos antes de su uso para disociar las cuentas agregadas.</li>
	<li>Transfiera 1.0 x 106 perlas a un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1.5 ml.</li>
	<li>Inserte el tubo en un separador magnético y permita que la separación ocurra durante 60 s. Con el tubo todavía en el separador magnético, retire cuidadosamente el sobrenadante sin molestar la bolita de perlas.</li>
	<li>Retire el tubo del separador magnético, vuelva a suspender las perlas con 100 μL de agua de grado HPLC y vórtice durante 30 s. Coloque el tubo de nuevo en el separador magnético durante 60 s y, posteriormente, retire el sobrenadante. Repita este protocolo de lavado dos veces.</li>
	<li>Retire el tubo del separador magnético y resuspenda las microesferas lavadas en 90 μL de fosfato de sodio monobásico de 100 mM, pH 6.2 (tampón de activación) por vórtice durante 30 s.</li>
	<li>Añadir 10 μL de 50 mg/mL de Sulfo-NHS (diluido con Activation Buffer) a las microesferas y vórtice suavemente durante 10 s. Añadir 10 μL de solución de EDC de 50 mg/ml (diluida con activation buffer) y vórtice suavemente durante 10 s. Incubar microesferas durante 20 min a temperatura ambiente (RT) con un vórtice suave cada 10 min.</li>
	<li>Repita los pasos de lavado 1.4-1.5 con 50 mM MES, pH 5.0 (Coupling Buffer) en lugar de agua de grado LC/MS para un total de dos lavados.</li>
	<li>Retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las perlas con 100 μL de tampón de acoplamiento por vórtice durante 30 s seguido inmediatamente por la adición de la cantidad deseada de proteína.</li>
	<li>Lleve el volumen total a 150 μL con el búfer de acoplamiento. Mezclar la reacción de acoplamiento por vórtice durante 30 s e incubar durante 2 h por rotación en RT. NOTA: Para los ensayos definidos en este documento, se realizaron conjugaciones con las siguientes concentraciones de proteínas: Spike S1: 5 μg; Nucleocápside: 5 μg; Membrana: 12,5 μg.</li>
	<li>Repita el paso de lavado 1.4 con solución salina tamponada con fosfato (PBS)-1% albúmina sérica de cabra, 0.01% polisorbato-20 (tampón de enfriamiento) en lugar de agua de grado LC / MS para un total de dos lavados. Resuspend las microesferas lavadas en 100 μL de Quench Buffer que contiene 0,05% de azida de sodio por vórtice durante 30 s. NOTA: Permita que las cuentas se apaguen completamente durante al menos 6 h antes de proceder a cualquier otro procedimiento.</li>
	<li>Cuente el número de microesferas recuperadas utilizando un contador celular automatizado o un hemocitómetro. Registre la concentración de cuentas observada.</li>
	<li>Refrigere las microesferas acopladas a 4 °C en la oscuridad.</li>
</ol>2. Procedimientos
<ol><li>Rendimiento del ensayo (protocolo base)<ol>
<li>Resuspend las microesferas acopladas por vórtice durante 30 s y sonicate por ~60-90 s.</li>
		<li>Retire la cantidad requerida de cada coloide de perla del tubo respectivo y combine los coloides de perlas en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
		<li>Inserte el tubo en un separador magnético y permita que la separación ocurra durante 60 segundos. Con el tubo todavía en el separador magnético, retire cuidadosamente el sobrenadante sin molestar la bolita de perlas.</li>
		<li>Retire las perlas del separador, resuspenda las perlas con 100 μL de pbS-1% de albúmina sérica bovina, 0.01% de polisorbato-20 (tampón de ensayo) y vórtice durante 30 s. Coloque el tubo en un separador magnético y permita que se produzca la separación durante 60 s. Repita este protocolo de lavado (es decir, los pasos 2.1.3-2.1.4) dos veces</li>
		<li>Ajuste la concentración de la mezcla de microesferas de trabajo de 3 plex agregando un volumen apropiado de Tampón de ensayo para generar una concentración final de 100 microesferas por 1 μL para cada objetivo.</li>
		<li>Alícuota 12,5 μL de la mezcla de microesferas preparada en la etapa 2.1.5 en cada pocillo de una placa de 384 pocillos o 25 μL en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.</li>
		<li>Diluya las muestras de plasma/suero 500 veces en Assay Buffer. Prepare especímenes estándar de acuerdo con la titulación deseada.</li>
		<li>Agregue 12.5 μL de tampón de ensayo como muestra en blanco y agregue cada una de las muestras diluidas o estándar en cada pozo designado de una placa de muestra de 384 pocillos o 25 μL de la muestra en blanco diluida o estándar en cada pocillo de una placa de muestra de 96 pocillos.</li>
		<li>Cubra la placa con un sello o papel de aluminio e incube durante 1 h en RT en un agitador de placas a 700 rpm. NOTA: El esquema para las curvas de dilución se proporciona en la Tabla 1.</li>
		<li>Preparar una solución de anticuerpos anti-detección humana (soluciones secundarias de anticuerpos) a 4 μg/ml con Assay Buffer como se especifica en el paso 2.1.11.</li>
		<li>Preparar IgM antihumana de cabra, conjugada con Super Bright 436 (SB)/Cabra-anti-igA humana, ficoeritrina (PE) Anticuerpos de detección conjugada a 4 μg/ml; o IgM cabra-anti-humano, SB Conjugado/Cabra-anti-humano IgG, PE Anticuerpos de detección conjugada a 4 μg/mL. NOTA: Para un formato de placa de 384 pocillos, se requieren 12,5 μL/pocillo de la solución de anticuerpos secundaria preparada, y para un formato de placa de 96 pocillos, se requieren 25 μL/pocillo.</li>
		<li>Coloque la placa en un separador magnético, lave rápidamente e invierta con fuerza sobre un recipiente de riesgo biológico para eliminar el líquido de los pozos. Con la placa aún invertida, golpee con fuerza la placa contra un fajo grueso de papel.</li>
		<li>Lave cada pozo con 100 μL de Tampón de ensayo y retire el líquido mediante una inversión forzada sobre un recipiente de riesgo biológico, como se describió anteriormente. Repita estos pasos (2.1.12-2.1.13) para un total de dos lavados. Deseche todos los fajos de papel usados en un recipiente de riesgo biológico.</li>
		<li>Agregue 12.5 μL de la solución de trabajo de anticuerpos secundarios a cada pocillo de una placa de 384 pocillos o 25 μL a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Cubra la placa con un sello o papel de aluminio e incube durante 30 minutos a RT en un agitador de placas a 700 rpm.</li>
		<li>Repita los pasos de lavado 2.1.12-2.1.13</li>
		<li>Agregue 75 μL de tampón de ensayo en cada pozo de una placa de 384 pocillos o 100 μL en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Cubra la placa con un sello o papel de aluminio e incube durante 5 minutos a RT en un agitador de placas a 700 rpm.</li>
		<li>Analice 60 μL a través del analizador de instrumentos de acuerdo con el manual del sistema.</li>
	</ol></li>
	<li>Optimización del tiempo de incubación de la captura de muestras<ol>
<li>Realice los pasos de la sección 2.1 utilizando la duración de los tiempos de incubación de 30 min, 60 min y 120 min en el paso 2.1.9. NOTA: Las incubaciones se pueden realizar con placas distintas o haciendo una pausa en el paso 2.1.6 hasta el momento de proceder al paso 2.1.9. para alcanzar los tiempos de incubación deseados.</li>
		<li>Proceda con la lectura de la placa en el analizador utilizando 60 μL de la mezcla del ensayo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Optimización de la concentración secundaria de anticuerpos<ol>
<li>Realice este procedimiento como se detalla en la sección 2.1, con excepción de las concentraciones finales de reactivos en la solución secundaria de trabajo de anticuerpos (preparada en la etapa 2.1.10-2.1.11) modificada de la siguiente manera: Anticuerpos de detección de igM antihumanos (o conejos) de cabra, SB a 8, 4, 2, 1 y 0,5 μg/ml. IgA antihumano (o conejo) de cabra, anticuerpos de detección de PE-conjugados a 8, 4, 2, 1 y 0,5 μg/ml. IgG antihumano (o conejo) de cabra, anticuerpos de detección de PE-conjugados a 8, 4, 2, 1 y 0,5 μg/ml. IgG de cabra-anti-humano (o conejo), PE-conjugado/Cabra-anti-humano (o conejo) IgM, anticuerpos de detección sb-conjugados a 8, 4, 2, 1 y 0,5 μg/mL. IgA de cabra-anti-humano (o conejo), PE-conjugado/Cabra-anti-humano (o conejo) IgM, anticuerpos de detección sb-conjugados a 8, 4, 2, 1 y 0,5 μg/mL.</li>
		<li>Proceda con la lectura de la placa en el analizador utilizando 60 μL de la mezcla del ensayo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Optimización del tiempo de incubación de anticuerpos secundarios<ol>
<li>Realice este procedimiento como se detalla en la sección 2.1 con 15 min, 30 min, 60 min y 120 min de duración de incubación definida en el paso 2.1.14.</li>
		<li>Proceda con la lectura de la placa en el analizador utilizando 60 μL de la mezcla del ensayo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Evaluación de especímenes sujetos con ensayos optimizados de doble canal<ol>
<li>Recolectar muestras de plasma del sujeto (n = 4) en los días -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 y +120 en relación con la finalización de la administración de la vacuna Covid-19 (es decir, la segunda dosis). NOTA: El día 0 representa el punto de tiempo en el que se completó la vacunación.</li>
		<li>Realizar todos los ensayos utilizando el Protocolo Base (sección 2.1.) como ensayo de doble canal IgG/IgM o IgA/IgM.</li>
		<li>Normalice los resultados al valor máximo observado de intensidad fluorescente media (IMF) para cada inmunoglobulina y ensayo específicos.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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El Dr. Borgia es el inventor de la prueba serológica utilizada en este manuscrito que está pendiente de patente. El artículo se presenta de manera descriptiva solo sin análisis estadísticos presentados para evitar el sesgo potencial introducido por el conflicto del autor.

La apreciación de una respuesta inmune a la exposición al SARS-CoV-2, junto con la vigilancia del estado de infección basada en RT-PCR, ha sido bien descrita como una receta para aclarar el curso de la recuperación de Covid-19, para servir como un medio para identificar plasma convaleciente con valor terapéutico potencial y para encuestar las tasas de infección a escala poblacional10,11. Diferentes ejemplos para comprender la seroconversión en sujetos humanos incluyen matrices de proteínas (antígenos)12, inmunoblots13, construcciones inmunocromatográficas rápidas14 y ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA)15,16,17. Cada una de estas técnicas mencionadas anteriormente puede evaluar múltiples isotipos de inmunoglobulina individualmente con modificaciones menores. Estos procedimientos, sin embargo, no son capaces de ser reutilizados prácticamente para permitir el análisis paralelo de múltiples isotipos, como se presenta en este manuscrito, representando los factores de costo y rendimiento como limitaciones para su administración en una estrategia de prueba a escala poblacional. Varias de estas aplicaciones también brindan la oportunidad de concatenar niveles de múltiples antígenos en paralelo, ya sea tal como se presentan o en formatos alterados, como un ELISA multiplex18,19. Finalmente, la plataforma de inmunomadios ofrece la posibilidad de evaluar los niveles de múltiples antígenos en paralelo 20,21, pero se ha limitado a un solo epítopo (es decir, isotipo de inmunoglobulina) por ensayo a menos que, sin embargo, se emplee el instrumento reciente con capacidades de ensayo de "doble canal".
En este informe se enumeran protocolos que establecen la medición fiable de múltiples epítopos en un ensayo de inmunoperla utilizando el instrumento en modo 'dual-channel' en un estudio de caso de seroconversión de individuos vacunados contra el Covid-19. El método demostró una excelente precisión (valores de %CV típicamente <20%) utilizando diseños de ensayos manuales que pueden mejorarse con la integración de sistemas automatizados de laboratorio. La sensibilidad del ensayo y el rango dinámico para todos los analitos y epítopos seleccionados fueron adecuados para las evaluaciones de rutina. Aunque la falta de inmunorreactivos antiantígenos IgA e IgM disponibles comercialmente limitó la cuantificación al isotipo IgG, tal restricción no excluye la capacidad de ofrecer evaluaciones semicuantitativas o evaluaciones relativas a una muestra específica como calibrante22,23.
El ensayo de inmunoperad validado se asignó para investigar la seroconversión en una cohorte de individuos inmunizados con la vacuna Covid-19. En contraste con otras plataformas similares, la familia de instrumentación permite la prospección de la seroconversión en cientos de individuos por día en un flujo de trabajo manual y miles por día en un esquema automatizado. En general, estos hallazgos confirman que el enfoque de "doble canal" tiene una sensibilidad adecuada para la descripción de múltiples epítopos en paralelo para el ensayo idéntico y es viable en un contexto de multianalitos. Una diferencia en las sensibilidades a los canales 1 y 2, como se realiza con los fluoróforos ficoeritrina y Super Bright 436, respectivamente, puede justificar el diseño de un experimento específico para garantizar que se adquieran resultados analíticos viables para un experimento determinado. Es decir, la reserva del canal 1 para epítopos o analitos de menor prevalencia puede ser necesaria para mantener un rango dinámico del ensayo que incluya los valores observados de incógnitas. Más allá de esta consideración, el diseño del ensayo era obvio y debería ser fácilmente accesible para los laboratorios con capacidades analíticas limitadas. Ciertamente, esta consideración debe sopesarse al considerar la interferencia del canal 1 al canal 2, como señalamos para la Figura 5, por lo que la interferencia de isotipos de mayor abundancia puede causar errores analíticos engañosos para aquellos en abundancia mucho menor cuando se miden en un formato de doble canal. Este potencial de interferencia con situaciones con concentraciones de analitos muy diferentes puede representar una limitación significativa para el enfoque si no se maneja adecuadamente en la fase de diseño del ensayo.
En conclusión, se presentó un método para medir rápidamente los títulos de anticuerpos de los principales isotipos de inmunoglobulina asociados con una respuesta inmune a la infección o vacunación por Covid-19. La aplicación de este enfoque de manera longitudinal para evaluar la seroconversión puede proporcionar información que podría usarse mejor para manejar y / o monitorear el curso de la enfermedad o, alternativamente, guiar posibles programas de vacunas de refuerzo covid-19.

La medición simultánea de múltiples biomarcadores relacionados con la enfermedad en muestras biológicas permite obtener información descriptiva y predictiva sobre los procesos patológicos. Si bien los procedimientos inmunológicos convencionales de un solo analito, como los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), han sido la piedra angular de los análisis cuantitativos tanto en entornos clínicos como de investigación, estas técnicas pueden tener limitaciones sustanciales con respecto al rendimiento, la cantidad de muestra requerida para cada medición y la rentabilidad que limitan en gran medida el estudio de múltiples elementos biológicos que con frecuencia se entrelazan a lo largo del curso de la enfermedad1 . La tecnología de multiplexación basada en microesferas se ha convertido en una plataforma indispensable para las instalaciones de diagnóstico e investigación por su capacidad de combinar ensayos para mejorar el rendimiento del laboratorio, mitigar la escasez de muestras y reducir las pruebas repetitivas para maximizar el ahorro de costos 1,2,3,4. Recientemente, se ha introducido un mayor aumento de este poder de multiplexación con instrumentos que poseen capacidades de doble reportero. La función de doble reportero implementa dos canales fluorescentes para la detección, suministrando otra dimensión de multiplexación, lo que permite la detección de múltiples epítopos en el mismo analito.
El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) es el patógeno responsable de la actual pandemia de enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19)5. Si bien las pruebas de RT-PCR son cruciales para la confirmación de la infección al comienzo del curso de la enfermedad, los exámenes serológicos de los títulos de anticuerpos han demostrado ser imperativos para la crítica precisa y completa de los individuos con respecto a una exposición o recuperación previa; una respuesta a la inmunización; y/o una evaluación de la eficacia de la vacunación contra el Covid-19 6,7.
Este informe delinea los métodos para medir la seroconversión de múltiples antígenos virales del SARS-CoV-2 que utilizan un sistema de informes duales de lector multiplex basado en flujo. Específicamente, se describe la detección concurrente de dos subtipos de anticuerpos (configurados como IgG / IgM o IgA / IgM) para un panel de antígenos 3-plex del SARS-CoV-2 que incluye ensayos para glicoproteínas Spike S1, Nucleocápside y Membrana (también conocida como Matrix). Este enfoque proporciona una empresa ideal para la captura de la seroconversión longitudinal y aporta una herramienta valiosa en el arsenal contra la pandemia de Covid-19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well black side polystyrene microtiter plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12-565-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, heat shock fraction</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A-7888-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag)</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS8574735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA35391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Albumin, Fraction V Powder</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2514-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB205009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB204009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB403009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB202009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62999842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Analyzer</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>INTELLIFLEX-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-698-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex-C Microspheres, Region XXX</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>MC10XXX-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate aluminum sealing tape</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>07-200-683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate-20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-751-7328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-V08B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40591-V08H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40592-T62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-R0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb</td>
			<td>ProSci</td>
			<td>10-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>W-64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19

Las tecnologías multiplex para interrogar múltiples biomarcadores en concierto han existido durante varias décadas; sin embargo, los métodos para evaluar múltiples epítopos en el mismo analito siguen siendo limitados. Este informe describe el desarrollo y la optimización de un ensayo de inmunodamento multiplexado para pruebas serológicas de isotipos comunes de inmunoglobulina (por ejemplo, IgA, IgM e IgG) asociados con una respuesta inmune a la infección o vacunación por SARS-CoV-2. Los ensayos se realizaron utilizando un lector fluorescente multiplex basado en flujo con capacidad de doble canal. Las optimizaciones se centraron en el tiempo de captura de analitos, la concentración de anticuerpos de detección y el tiempo de incubación de anticuerpos de detección. Se establecieron características de rendimiento del ensayo analítico (por ejemplo, rango de ensayo (incluidos los límites inferior y superior de cuantificación); y precisión intra e interensayo) para la combinación de serotipos IgG/IgM o IgA/IgM en tándem utilizando el modo de "canal dual". Los tiempos de captura de analitos de 30 min para IgG, 60 min para IgM y 120 min para IgA fueron adecuados para la mayoría de las aplicaciones, proporcionando un equilibrio entre el rendimiento y el rendimiento del ensayo. Se observaron incubaciones óptimas de anticuerpos de detección a 4 μg/ml durante 30 min y se recomiendan para aplicaciones generales, dada la excelente precisión general (porcentaje de coeficiente de varianza (%CV) ≤ 20%) y los valores de sensibilidad observados. El rango dinámico para el isotipo IgG abarcó varios órdenes de magnitud para cada ensayo (Espiga S1, Nucleocápside y glicoproteínas de membrana), lo que admite evaluaciones de títulos robustos a un factor de dilución de 1:500 para aplicaciones clínicas. Finalmente, el protocolo optimizado se aplicó para monitorear la seroconversión de Spike S1 para sujetos (n = 4) que completaron un régimen de vacuna contra el SARS-CoV-2. Dentro de esta cohorte, se observó que los niveles de IgG de Spike S1 alcanzaron títulos máximos a los 14 días después de la administración de la segunda dosis, a una intensidad de señal mucho más alta (~ 40 veces) que los isotipos de IgM o IgA. Curiosamente, observamos tasas de desintegración del título de IgG Spike S1 altamente variables que dependían en gran medida del sujeto, lo que será el tema de estudios futuros.

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Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19

Este artículo describe un método conveniente para monitorear los cambios dinámicos en los títulos de anticuerpos para dos isotipos de inmunoglobulina simultáneamente (ya sea IgA, IgM o IgG) como resultado de una respuesta inmune a la infección por SARS-CoV-2 o la vacunación. Este 'Panel de Respuesta Inmune Covid-19 Multianalito' emplea tres inmunoensayos indirectos construidos sobre microesferas codificadas que se leen utilizando un lector multiplex basado en flujo con capacidad de 'doble canal'.

Monitoreo dinámico de la seroconversión mediante un ensayo de inmunodaxia multianalto para Covid-19

Multiplex technologies for interrogating multiple biomarkers in concert have existed for several decades; however, methods to evaluate multiple epitopes ...

El método que demostraremos hoy proporciona una solución de alto rendimiento para evaluar la seroconversión de anticuerpos asociados con infecciones por COVID-19 o la vacunación para análisis de rutina. Curiosamente, este enfoque nos permite evaluar múltiples epítopos en el mismo analito. Esto tiene numerosas aplicaciones en las ciencias biológicas, incluidos los estudios de señalización celular y el monitoreo de las respuestas inmunes.Demostrando esta técnica para usted hoy estará el Dr. Imad Tarhoni, un becario postdoctoral en mi laboratorio. Para comenzar, seleccione tres viales diferentes de las microesferas magnéticas con regiones de cuentas únicas y registre la identificación de la cuenta y la información del lote para cada vial utilizado. Luego, vórtice el stock de microesfera seleccionado durante 60 segundos y sonice durante cinco minutos.Transfiera 1.0 veces 10 a las seis perlas a un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1.5 mililitros e inserte el tubo en un separador magnético. para permitir la separación durante 60 segundos. Con el tubo todavía en el separador magnético, retire cuidadosamente el sobrenadante sin molestar la bolita de perlas.Retire el tubo del separador magnético y, a continuación, vuelva a suspender las perlas con 100 microlitros de agua y vórtice de grado HPLC durante 30 segundos. Nuevamente, coloque el tubo nuevamente en el separador magnético durante 60 segundos y posteriormente retire el sobrenadante. Repita el protocolo de lavado dos veces.Después del último lavado, retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las microesferas lavadas en 90 microlitros de tampón de activación, pH 6.2, por vórtice durante 30 segundos. A continuación, trate secuencialmente las microesferas con 10 microlitros de 50 miligramos por mililitro de anhidroxi-sulfosuccinamida y 10 microlitros de 50 miligramos por mililitro de solución de EDC por vórtice durante 10 segundos. Más tarde, incuba las microesferas durante 20 minutos a temperatura ambiente con un vórtice suave cada 10 minutos.Después de la incubación, lave las microesferas dos veces con MES de 50 milimolares o tampón de acoplamiento, pH 5.0, como se describió anteriormente. Repita el lavado dos veces. Una vez hecho esto, retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las perlas con 100 microlitros de tampón de acoplamiento por vórtice durante 30 segundos, seguido inmediatamente de agregar la cantidad deseada de proteína al tubo.Lleve el volumen total a 150 microlitros con tampón de acoplamiento y mezcle la reacción por vórtice durante 30 segundos. Luego, incuba el tubo durante dos horas por rotación a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave las microesferas dos veces con el tampón de enfriamiento PBS y resuspenda las microesferas lavadas en 100 microlitros de tampón de enfriamiento que contengan 0.05% de azida de sodio por vórtice durante 30 segundos.Cuente el número de microesferas recuperadas utilizando un contador celular automatizado y registre la concentración de cuentas observada. Para el rendimiento del ensayo, resuspender las microesferas acopladas por vórtice durante 30 segundos y sonicar durante 60 a 90 segundos. Luego, retire la cantidad requerida de cada coloide de cuentas del tubo respectivo y combine los coloides de cuentas en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros.A continuación, inserte el tubo en un separador magnético y permita la separación durante 60 segundos. Con el tubo todavía en el separador magnético, retire el sobrenadante sin molestar la bolita de perlas. Después de retirar las perlas del separador, vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de tampón de ensayo.Vórtice durante 30 segundos antes de colocar el tubo en un separador magnético durante 60 segundos para separar las perlas. Repita el lavado dos veces. A continuación, ajuste la concentración de la mezcla de microesferas de trabajo de tres plexos agregando un volumen apropiado de tampón de ensayo para generar una concentración final de 100 microesferas por un microlitro para cada objetivo.Alícuota 25 microlitros de la mezcla de microesferas en cada pozo de una placa de 96 pocillos. Diluya las muestras de plasma o suero 500 veces en tampón de ensayo y prepare muestras estándar de acuerdo con la titulación deseada. Agregue 25 microlitros de tampón de ensayo como muestra en blanco y agregue cada uno de los especímenes diluidos o estándar en cada pozo designado de una placa de muestra de 96 pocillos.Cuando haya terminado, cubra la placa con un sello o papel de aluminio para incubar durante una hora a temperatura ambiente en un agitador de placas ajustado a 700 rotaciones por minuto. Preparar una solución de anticuerpos de detección antihumanos o soluciones de anticuerpos secundarios a cuatro microgramos por microlitro con tampón de ensayo como se describe en el manuscrito. Coloque la placa en un separador magnético para lavarla rápidamente y luego invierta la placa con fuerza sobre un recipiente de riesgo biológico para eliminar el líquido de los pozos.Con la placa aún invertida, golpee con fuerza la placa contra un fajo grueso de papel. Luego, lave cada pozo con 100 microlitros de tampón de ensayo y retire el líquido mediante una inversión forzada sobre un recipiente de riesgo biológico. Repita el lavado dos veces.Después del último lavado, deseche todos los fajos de papel usados en un recipiente de riesgo biológico. A continuación, agregue 25 microlitros de solución secundaria de trabajo de anticuerpos a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y cubra la placa con papel de aluminio para incubar en un agitador de placas a 700 rotaciones por minuto. Después de 30 minutos de incubación, lave los pocillos de la placa dos veces con un tampón de ensayo como se demostró anteriormente.Luego, agregue 100 microlitros de tampón de ensayo en cada pozo de la placa de 96 pocillos. Cubra la placa con papel de aluminio e incube durante cinco minutos en un agitador de placas a temperatura ambiente. Analice una muestra de 60 microlitros a través del analizador de instrumentos de acuerdo con el manual del sistema.Para optimizar el tiempo de incubación de la captura de muestras, incube las placas durante una duración de 30, 60 y 120 minutos. Después de la incubación, analice 60 microlitros de la mezcla de ensayo en el analizador. Se evaluó una curva estándar de siete puntos basada en una serie de dilución en serie de 1:5 para el pico S1, los anticuerpos de membrana y la nucleocápside.La prueba de precisión intra-ensayo se realizó en la placa para evaluar la precisión del ensayo calculada como porcentaje de coeficiente de variación, desviación estándar y promedio. Para la precisión entre ensayos, se prepararon tres lotes distintos de los juegos de cuentas para cada ensayo. Se calcularon las variables de precisión del ensayo con las muestras estándar y de plasma humano.Los valores medios de intensidad fluorescente promedio a los 120 minutos de la incubación fueron óptimos para los títulos de IgG para el pico S1, la membrana y los anticuerpos de la nucleocápside, lo que indica una cinética de unión primaria rápida de anticuerpos. Las optimizaciones de la concentración secundaria de anticuerpos en el rendimiento de doble canal demostraron una amplia gama de señales en la medición lineal para todas las concentraciones. Las señales observadas de diferentes incubaciones temporales de los anticuerpos secundarios y los detalles sobre los cambios de señal para todos los tiempos de incubación se muestran aquí.En las evaluaciones de especificidad para los ensayos de doble canal, se observó una contaminación insignificante de la señal cruzada entre el canal en blanco y el canal de un solo informador. En la ilustración de los eventos de seroconversión después de la vacunación contra covid 19, los valores de Pico S1 IgA e IgM observados fueron aproximadamente 40 veces más bajos que los títulos de isotipo igG. Este método tiene implicaciones importantes para el monitoreo de la respuesta a las vacunas en individuos inmunocomprometidos.Nos permitirá determinar si estos pacientes realmente están siendo protegidos por esas vacunas.

Research

JoVE Journal

Medicine

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