Name: dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19
Uploaded: 2022-02-16T15:00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19 at JoVE.com

Yazarlar, tesislerinin kullanımı için Rush Biomarker Development Core'a, konu kaydı ve biyonumune işleme için Rush Biorepository'ye ve Walder Vakfı'nın Chicago Koronavirüs Değerlendirme Ağı (Chicago CAN) Girişimi hibe numaraları SCI16 (J.R.S. ve J.A.B.) ve 21-00147 (J.R.S. ve J.A.B.) ve Swim Across America Vakfı'ndan (J.A.B.) bir ödüle teşekkür etmek istiyor.

Tüm denekler, ORA protokolü uyarınca Rush Üniversitesi Tıp Merkezi'nin tam Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onayı ile yazılı bilgilendirilmiş onam ile kaydedilmiştir 20101207 etik araştırma yürütülmesi için tüm kurumsal kılavuzlar gözetilmiştir. Kan, geleneksel flebotomi yoluyla lavanta vakumlayıcılarına (K2EDTA) toplandı ve önerilen protokollerle işlendi. Elde edilen plazma, değerlendirmeler yapılana kadar -80 ° C'de arşivlendi.
1. Antijen konjuge mikrosferlerin hazırlanması
<ol><li>Kullanılan her şişe için benzersiz boncuk bölgelerine sahip üç farklı manyetik mikrosfer şişesi seçin, boncuk kimliğini ve lot bilgilerini kaydedin. NOT: Her farklı mikrosfer bölgesi için aşağıdaki adımlar izlenecektir. Mikrosferler ışığa duyarlıdır ve ışığa uzun süre maruz kalmaktan korunmalıdır. Yıkama adımları sırasında, mikrosferleri rahatsız etmemeye dikkat edin. Rahatsız edilirse, ikinci bir 60 s ayrımına izin verin.</li>
	<li>60 s için mikrosfer stoğunu vorteks edin ve toplanmış boncukları ayırmak için kullanmadan önce 5 dakika boyunca sonikat yapın.</li>
	<li>1,0 x 106 boncukları 1,5 mL düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerine aktarın.</li>
	<li>Tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayırmanın gerçekleşmesine izin verin. Tüp hala manyetik ayırıcıdayken, boncuk peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın, boncukları 100 μL HPLC sınıfı su ile yeniden askıya alın ve 30 s boyunca vorteks. Tüpü 60 s boyunca manyetik ayırıcıya geri yerleştirin ve daha sonra süpernatanı çıkarın. Bu yıkama protokolünü iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yıkanmış mikrosferleri 90 μL'de 100 mM Monobazik Sodyum Fosfat, pH 6.2 (Aktivasyon Tamponu) vorteks ile 30 s boyunca yeniden askıya alın.</li>
	<li>Mikrosferlere 10 μL 50 mg / mL Sulfo-NHS (Aktivasyon Tamponu ile seyreltilmiş) ekleyin ve 10 saniye boyunca yavaşça vorteks yapın. 10 μL 50 mg/mL EDC çözeltisi ekleyin (Aktivasyon Tamponu ile seyreltilmiş) ve 10 saniye boyunca yavaşça vorteks yapın. Mikrosferleri oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca her 10 dakikada bir yumuşak bir vorteks ile inkübe edin.</li>
	<li>LC/MS sınıfı su yerine 50 mM MES, pH 5.0 (Kaplin Tamponu) ile 1.4-1.5 yıkama adımlarını toplam iki yıkama için tekrarlayın.</li>
	<li>Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve boncukları 100 μL Kaplin Tamponu ile vorteks ile 30 s boyunca yeniden askıya alın ve ardından hemen istenen miktarda protein ekleyin.</li>
	<li>Kaplin Arabelleği ile toplam hacmi 150 μL'ye getirin. Vorteks ile kuplaj reaksiyonunu 30 sn boyunca karıştırın ve RT'de rotasyonla 2 saat inkübe edin. NOT: Burada tanımlanan tahliller için, konjugasyonlar aşağıdaki protein konsantrasyonları ile gerçekleştirilmiştir: Spike S1: 5 μg; Nükleokapsid: 5 μg; Membran: 12.5 μg.</li>
	<li>LC/MS sınıfı su yerine Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)-%1 Keçi Serumu Albümini, %0,01 Polisorbat-20 (Söndürme Tamponu) ile toplam iki yıkama için 1.4 numaralı yıkama adımını tekrarlayın. Yıkanmış mikrosferleri, vorteks tarafından% 0.05 sodyum azid içeren 100 μL Söndürme Tamponunda 30 saniye boyunca yeniden askıya alın. NOT: Başka bir prosedüre geçmeden önce boncukların en az 6 saat boyunca tamamen söndürmesine izin verin.</li>
	<li>Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak kurtarılan mikrosferlerin sayısını sayın. Gözlemlenen boncuk konsantrasyonunu kaydedin.</li>
	<li>Birleştirilmiş mikrosferleri karanlıkta 4 ° C'de soğutun.</li>
</ol>2. Prosedürler
<ol><li>Tahlil performansı (Temel protokol)<ol>
<li>Birleştirilmiş mikrosferleri 30 s için vorteks ile yeniden askıya alın ve ~ 60-90 s için sonikat yapın.</li>
		<li>Her bir boncuk kolloidinin gerekli miktarını ilgili tüpten çıkarın ve boncuk kolloidlerini yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.</li>
		<li>Tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayırmanın gerçekleşmesine izin verin. Tüp hala manyetik ayırıcıdayken, boncuk peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>Boncukları separatörden çıkarın, boncukları 100 μL PBS-1% sığır serum albümini,% 0.01 Polisorbat-20 (Tahlil Tamponu) ve 30 s vorteks ile yeniden askıya alın. Tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayırmanın gerçekleşmesine izin verin. Bu yıkama protokolünü (yani, 2.1.3-2.1.4 adımları) iki kez tekrarlayın</li>
		<li>Her hedef için 1 μL başına 100 mikrosferlik bir nihai konsantrasyon oluşturmak için uygun hacimde bir Tahlil Tamponu ekleyerek 3 pleks çalışma mikrosfer karışımının konsantrasyonunu ayarlayın.</li>
		<li>Adım 2.1.5'te hazırlanan mikrosfer karışımının Aliquot 12.5 μL'si, 384 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna veya 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 25 μL.</li>
		<li>Plazma/serum örneklerini Tahlil Tamponunda 500 kat seyreltin. Standart numuneleri istenen titrasyona göre hazırlayın.</li>
		<li>Boş numune olarak 12,5 μL Tahlil Tamponu ekleyin ve seyreltilmiş numunenin veya standardın her birini, 384 kuyucuklu bir numune plakasının belirlenmiş her bir kuyucuğuna veya boş, seyreltilmiş numunenin veya standardın 25 μL'sini 96 delikli bir numune plakasının her bir kuyucuğuna ekleyin.</li>
		<li>Plakayı alüminyum bir conta veya folyo ile örtün ve 700 rpm'ye ayarlanmış bir plaka çalkalayıcıda RT'de 1 saat boyunca inkübe edin. NOT: Seyreltme eğrileri için şematik Tablo 1'de verilmiştir.</li>
		<li>Adım 2.1.11'de belirtildiği gibi Tahlil Tamponu ile 4 μg / mL'de bir anti-insan tespit antikorları (ikincil antikor çözeltileri) çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Süper Parlak 436 (SB) / Keçi-anti-insan IgA, Fikoeritrin (PE) Konjugat 4 μg / mL'de antikorları tespit eder; veya Keçi-anti-insan IgM, SB Konjugat / Keçi-anti-insan IgG, PE Konjugat 4 μg / mL'de antikorları tespit eder. NOT: 384 delikli bir plaka formatı için, hazırlanan ikincil antikor çözeltisinin 12,5 μL/kuyucuğu gereklidir ve 96 delikli plaka formatı için 25 μL/kuyucuk gereklidir.</li>
		<li>Plakayı manyetik bir ayırıcıya yerleştirin, hızlı bir şekilde yıkayın ve sıvıyı kuyucuklardan çıkarmak için biyolojik tehlike kabının üzerine zorla ters çevirin. Plaka hala ters çevrilmişken, plakayı kalın bir kağıda karşı zorla dokunun.</li>
		<li>Her bir kuyucuğu 100 μL Tahlil Tamponu ile yıkayın ve daha önce açıklandığı gibi biyolojik tehlike kabı üzerinde kuvvetli bir şekilde ters çevirerek sıvıyı çıkarın. Toplam iki yıkama için bu adımları (2.1.12-2.1.13) tekrarlayın. Kullanılmış tüm kağıt parçalarını biyolojik tehlike kabına atın.</li>
		<li>384 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 12.5 μL ikincil antikor çalışma çözeltisi veya 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 25 μL ekleyin. Plakayı alüminyum bir conta veya folyo ile örtün ve 700 rpm'ye ayarlanmış bir plaka çalkalayıcıda RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>2.1.12-2.1.13 yıkama adımlarını tekrarlayın</li>
		<li>384 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 75 μL Tahlil Tamponu veya 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 μL ekleyin. Plakayı alüminyum bir conta veya folyo ile örtün ve RT'de 700 rpm'ye ayarlanmış bir plaka çalkalayıcıda 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Sistem kılavuzuna göre cihaz analizörü aracılığıyla 60 μL'yi analiz edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Numune yakalama inkübasyon süresinin optimizasyonu<ol>
<li>Adım 2.1.9'daki 30 dakika, 60 dakika ve 120 dakikalık kuluçka sürelerini kullanarak bölüm 2.1'deki adımları uygulayın. NOT: Kuluçkalar, farklı plakalarla veya adım 2.1.6'da adım 2.1.9'a geçme zamanına kadar duraklatılarak gerçekleştirilebilir. İstenilen kuluçka sürelerine ulaşmak.</li>
		<li>Üreticinin tavsiyelerine göre tahlil karışımının 60 μL'sini kullanarak analizör üzerindeki plaka okumaya devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sekonder antikor konsantrasyonunun optimizasyonu<ol>
<li>Bu prosedürü, aşağıdaki gibi değiştirilmiş sekonder antikor çalışma çözeltisindeki (Adım 2.1.10-2.1.11'de hazırlanan) reaktiflerin nihai konsantrasyonları hariç, bölüm 2.1'de ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde uygulayın: Keçi-anti-insan (veya tavşan) IgM, 8, 4, 2, 1 ve 0.5 μg / mL'de SB-konjugat tespit antikorları. Keçi-anti-insan (veya tavşan) IgA, 8, 4, 2, 1 ve 0.5 μg / mL'de PE-konjugat tespit antikorları. Keçi-anti-insan (veya tavşan) IgG, 8, 4, 2, 1 ve 0.5 μg / mL'de PE-konjugat tespit antikorları. Keçi-anti-insan (veya tavşan) IgG, PE-konjugat / Keçi-anti-insan (veya tavşan) IgM, 8, 4, 2, 1 ve 0.5 μg / mL'de SB-konjugat tespit antikorları. Keçi-anti-insan (veya tavşan) IgA, PE-konjugat / Keçi-anti-insan (veya tavşan) IgM, 8, 4, 2, 1 ve 0.5 μg / mL'de SB-konjugat tespit antikorları.</li>
		<li>Üreticinin tavsiyelerine göre tahlil karışımının 60 μL'sini kullanarak analizör üzerindeki plaka okumaya devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sekonder antikor inkübasyon süresinin optimizasyonu<ol>
<li>Bu prosedürü, bölüm 2.1'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, adım 2.1.14'te tanımlanan 15 dakika, 30 dakika, 60 dakika ve 120 dakikalık kuluçka süresi ile gerçekleştirin.</li>
		<li>Üreticinin tavsiyelerine göre tahlil karışımının 60 μL'sini kullanarak analizör üzerindeki plaka okumaya devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Konu numunelerin optimize edilmiş çift kanallı analizlerle değerlendirilmesi<ol>
<li>Covid-19 aşısı (yani ikinci doz) uygulamasının tamamlanmasına bağlı olarak -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 ve +120 günlerinde denek plazma örnekleri (n = 4) toplayın. NOT: 0. Gün, aşılamanın tamamlandığı zaman noktasını temsil eder.</li>
		<li>Temel Protokolü (bölüm 2.1.) kullanarak tüm tahlilleri IgG/IgM veya IgA/IgM çift kanallı tahlil olarak gerçekleştirin.</li>
		<li>Sonuçları, her bir spesifik immünoglobulin ve tahlil için gözlenen maksimum Medyan Floresan Yoğunluğu (MFI) değerine normalleştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+in+the+multiplex+era:+potentials+and+pitfalls.">ELISA in the multiplex era: potentials and pitfalls.</a> Proteomics - Clinical Applications. 9, 406-422 (2015).</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4084 (2012).</li><li>Powell, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere-based+immunoassay+increases+the+sensitivity+of+siv-specific+antibody+detection+in+serum+samples+and+mucosal+specimens+collected+from+rhesus+macaques+infected+with+SIVmac239.">A multiplex microsphere-based immunoassay increases the sensitivity of siv-specific antibody detection in serum samples and mucosal specimens collected from rhesus macaques infected with SIVmac239.</a> BioResearch Open Access. 2 (3), 171-178 (2013).</li><li>Volpetti, F., Garcia-Cordero, J., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+high-throughput+multiplexed+protein+quantitation.">A microfluidic platform for high-throughput multiplexed protein quantitation.</a> PLoS One. 10 (2), 0117744 (2015).</li><li>Rabi, F. A., Al Zoubi, M. S., Kasasbeh, G. A., Salameh, D. M., Al-Nasser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+and+coronavirus+disease+2019:+What+we+know+so+far.">SARS-CoV-2 and coronavirus disease 2019: What we know so far.</a> Pathogens. 9 (3), 231 (2020).</li><li>Asif, M., Xu, Y., Xiao, F., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+COVID-19,+vitality+of+emerging+technologies+and+preventive+measures.">Diagnosis of COVID-19, vitality of emerging technologies and preventive measures.</a> Chemical Engineering Journal. 423, 130189 (2021).</li><li>La Marca, A., Capuzzo, M., Paglia, T., Roli, L., Trenti, T., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+for+SARS-CoV-2+(COVID-19):+a+systematic+review+and+clinical+guide+to+molecular+and+serological+in-vitro+diagnostic+assays.">Testing for SARS-CoV-2 (COVID-19): a systematic review and clinical guide to molecular and serological in-vitro diagnostic assays.</a> Reproductive Biomedicine Online. 41 (3), 483-499 (2020).</li><li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limit+of+blank,+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation.">Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 29, 49-52 (2008).</li><li>Tarhoni, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+circulating+tumor-associated+autoantibodies+and+clinical+outcomes+in+advanced-stage+NSCLC+patients+receiving+PD-1/-L1+directed+immune+checkpoint+inhibition.">Relationship between circulating tumor-associated autoantibodies and clinical outcomes in advanced-stage NSCLC patients receiving PD-1/-L1 directed immune checkpoint inhibition.</a> Journal of Immunological Methods. 490, 112956 (2021).</li><li>Deeks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+tests+for+identification+of+current+and+past+infection+with+SARS-CoV-2.">Antibody tests for identification of current and past infection with SARS-CoV-2.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 6, 013652 (2020).</li><li>Mahalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+humoral+immune+responses+against+SARS-CoV-2+in+patients+with+COVID-19+disease+and+the+value+of+antibody+testing.">Landscape of humoral immune responses against SARS-CoV-2 in patients with COVID-19 disease and the value of antibody testing.</a> Heliyon. 7 (4), 06836 (2021).</li><li>Ruano-Gallego, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+antigen+microarray+for+simultaneous+IgG+and+IgM+detection+against+SARS-CoV-2+reveals+higher+seroprevalence+than+reported.">A multiplex antigen microarray for simultaneous IgG and IgM detection against SARS-CoV-2 reveals higher seroprevalence than reported.</a> Microbial Biotechnology. 14 (3), 1228-1236 (2021).</li><li>Shah, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+and+IgM+antibody+formation+to+spike+and+nucleocapsid+proteins+in+COVID-19+characterized+by+multiplex+immunoblot+assays.">IgG and IgM antibody formation to spike and nucleocapsid proteins in COVID-19 characterized by multiplex immunoblot assays.</a> BMC Infectious Diseases. 21 (1), 325 (2021).</li><li>Gambino, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+rapid+immunochromatographic+test+with+a+chemiluminescence+immunoassay+for+detection+of+anti-SARS-CoV-2+IgM+and+IgG.">Comparison of a rapid immunochromatographic test with a chemiluminescence immunoassay for detection of anti-SARS-CoV-2 IgM and IgG.</a> Biochemia Medica (Zagreb). 30 (3), 030901 (2020).</li><li>Algaissi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+and+N-based+serological+assays+reveal+rapid+seroconversion+and+induction+of+specific+antibody+response+in+COVID-19+patients.">SARS-CoV-2 S1 and N-based serological assays reveal rapid seroconversion and induction of specific antibody response in COVID-19 patients.</a> Scientific Reports. 10, 16561 (2020).</li><li>Chiereghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+evaluation+of+serological+assays+for+the+diagnosis+of+SARS-CoV-2+infection+and+COVID-19.">Recent advances in the evaluation of serological assays for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection and COVID-19.</a> Frontiers in Public Health. 8, 620222 (2020).</li><li>Nicol, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+SARS-CoV-2+serological+tests+for+the+diagnosis+of+COVID-19+through+the+evaluation+of+three+immunoassays:+Two+automated+immunoassays+(Euroimmun+and+Abbott)+and+one+rapid+lateral+flow+immunoassay+(NG+Biotech).">Assessment of SARS-CoV-2 serological tests for the diagnosis of COVID-19 through the evaluation of three immunoassays: Two automated immunoassays (Euroimmun and Abbott) and one rapid lateral flow immunoassay (NG Biotech).</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104511 (2020).</li><li>Butt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+multiplex+serology+to+serolomics-A+novel+approach+to+the+antibody+response+against+the+SARS-CoV-2+proteome.">From multiplex serology to serolomics-A novel approach to the antibody response against the SARS-CoV-2 proteome.</a> Viruses. 13 (5), 749 (2021).</li><li>Byrum, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=multiSero:+open+multiplex-ELISA+platform+for+analyzing+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+infection.">multiSero: open multiplex-ELISA platform for analyzing antibody responses to SARS-CoV-2 infection.</a> medRxiv. , (2021).</li><li>Dobano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+specific+multiplex+antibody+assays+to+quantify+immunoglobulins+m,+a,+and+g+against+SARS-CoV-2+antigens.">Highly sensitive and specific multiplex antibody assays to quantify immunoglobulins m, a, and g against SARS-CoV-2 antigens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 01731 (2021).</li><li>Schultz, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+multiplex+microsphere+immunoassay+using+dried+blood+spots+for+SARS-CoV-2+seroprevalence:+Application+in+first+responders+in+first+responders+in+Colorado,+USA.">Development and validation of a multiplex microsphere immunoassay using dried blood spots for SARS-CoV-2 seroprevalence: Application in first responders in first responders in Colorado, USA.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (6), 00290 (2021).</li><li>Beavis, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+EUROIMMUN+anti-SARS-CoV-2+ELISA+assay+for+detection+of+IgA+and+IgG+antibodies.">Evaluation of the EUROIMMUN anti-SARS-CoV-2 ELISA assay for detection of IgA and IgG antibodies.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan Americal Society for Clinical Virology. 129, 104468 (2020).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+performance+of+a+semi-quantitative+assay+for+SARS-CoV2+IgG+and+SARS-CoV2+IgM+antibodies.">Clinical performance of a semi-quantitative assay for SARS-CoV2 IgG and SARS-CoV2 IgM antibodies.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 510, 790-795 (2020).</li></ol>

Dr. Borgia, patent bekleyen bu makalede kullanılan serolojik testin mucididir. Makale, yalnızca yazar çatışmasının getirdiği potansiyel önyargıyı önlemek için sunulan istatistiksel analizler olmadan tanımlayıcı bir şekilde sunulmuştur.

SARS-CoV-2 maruziyetine karşı bir bağışıklık tepkisinin takdir edilmesi, enfeksiyon durumunun RT-PCR tabanlı sürveyansı ile birlikte, Covid-19'dan iyileşme sürecini açıklığa kavuşturmak, potansiyel terapötik değere sahip iyileşen plazmayı tanımlamak için bir araç olarak hizmet etmek ve enfeksiyon oranlarını popülasyon ölçeğinde araştırmak için bir reçete olarak iyi tanımlanmıştır10,11. İnsan deneklerde serokonversiyonun anlaşılmasına farklı örnekler arasında protein (antijen) dizileri 12, immünoblotlar 13, hızlı immünokromatografik yapılar14 ve enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA'lar) 15,16,17 sayılabilir. Yukarıda belirtilen bu tekniklerin her biri, çoklu immünoglobulin izotiplerini küçük modifikasyonlarla ayrı ayrı değerlendirebilir. Bununla birlikte, bu prosedürler, bu makalede sunulduğu gibi, çoklu izotiplerin paralel analizine izin vermek için pratik olarak yeniden tasarlanamaz, maliyet ve verim faktörlerini popülasyon tabanlı bir ölçek test stratejisinde uygulamaları için sınırlamalar olarak sunar. Bu uygulamaların birçoğu aynı zamanda çoklu antijen seviyelerini paralel olarak ya sunulduğu gibi ya da multipleks ELISA18,19 gibi değiştirilmiş formatlarda birleştirme fırsatı sunar. Son olarak, immünoboncuk platformu, çoklu antijen seviyeleriniparalel olarak 20,21'de değerlendirme imkanı sağlar, ancak 'çift kanallı' tahlil yeteneklerine sahip son cihaz kullanılmadıkça, tahlil başına tek bir epitop (yani, immünoglobulin izotipi) ile sınırlandırılmıştır.
Bu yazıda, Covid-19 aşılı bireylerin serokonversiyon vaka çalışmasında 'çift kanallı' modda alet kullanılarak bir immünoboncuk testinde çoklu epitopların güvenilir ölçümünü sağlayan protokoller sıralanmıştır. Yöntem, laboratuvar otomatik sistemlerinin entegrasyonu ile geliştirilebilecek manuel tahlil tasarımları kullanılarak mükemmel hassasiyet (%CV değerleri tipik olarak <%20) göstermiştir. Seçilen tüm analitler ve epitoplar için tahlil duyarlılığı ve dinamik aralık rutin değerlendirmeler için uygundu. Ticari olarak temin edilebilen anti-antijen IgA ve IgM immünoreaktiflerinin eksikliği, kantitasyonu IgG izotipine sınırlamış olsa da, böyle bir kısıtlama, kalibrant22,23 olarak belirli bir örneğe göre yarı kantitatif değerlendirmeler veya değerlendirmeler sunma yeteneğini engellemez.
Doğrulanmış immünoboncuk testi, Covid-19 aşısı ile aşılanmış bireylerin bir kohortunda serokonversiyonun araştırılması için tahsis edildi. Diğer benzer platformların aksine, enstrümantasyon ailesi, manuel bir iş akışında günde yüzlerce bireyde ve otomatik bir şemada günde binlerce kişide serokonversiyonun araştırılmasına izin verir. Genel olarak, bu bulgular 'çift kanallı' yaklaşımın, aynı tahlil için paralel olarak çoklu epitopların tanımlanması için uygun duyarlılığa sahip olduğunu ve multianalit bağlamında uygulanabilir olduğunu doğrulamaktadır. Sırasıyla fikoeritrin ve Süper Parlak 436 floroforlarla gerçekleştirilen kanal 1 ve kanal 2'ye duyarlılıklardaki bir fark, belirli bir deney için uygulanabilir analitik sonuçların elde edilmesini sağlamak için belirli bir deneyin tasarımını garanti edebilir. Yani, kanal 1'in epitoplar veya daha düşük prevalanslı analitler için ayrılması, bilinmeyenlerin gözlemlenen değerlerini içeren tahlilin dinamik bir aralığını korumak için gerekli olabilir. Bu düşüncenin ötesinde, tahlil tasarımı açıktı ve sınırlı analitik yeteneklere sahip laboratuvarlar için kolayca erişilebilir olmalıydı. Elbette, Şekil 5'te belirttiğimiz gibi, kanal 1'den kanal 2'ye girişim göz önüne alındığında bu husus tartılmalıdır, bu sayede daha yüksek bolluk izotiplerinden gelen girişim, çift kanallı bir formatta ölçüldüğünde çok daha düşük bollukta olanlar için yanıltıcı analitik hatalara neden olabilir. Son derece farklı analit konsantrasyonlarına sahip durumlarla bu girişim potansiyeli, tahlil tasarım aşamasında uygun şekilde ele alınmadığı takdirde yaklaşımda önemli bir sınırlama oluşturabilir.
Sonuç olarak, Covid-19 enfeksiyonuna veya aşılamaya karşı immün yanıt ile ilişkili majör immünoglobulin izotiplerinden antikor titrelerini hızlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunulmuştur. Bu yaklaşımı serokonversiyonun değerlendirilmesi için uzunlamasına bir şekilde uygulamak, hastalığın seyrini yönetmek ve / veya izlemek için daha iyi kullanılabilecek veya alternatif olarak potansiyel Covid-19 güçlendirici aşı programlarına rehberlik edebilecek bilgiler sağlayabilir.

Biyolojik örneklerde hastalıkla ilişkili çoklu biyobelirteçlerin eşzamanlı ölçümü, patolojik süreçlere tanımlayıcı ve öngörücü içgörüler sağlar. Enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA'lar) gibi geleneksel tek analitli immünolojik prosedürler, hem klinik hem de araştırma ortamlarında kantitatif analizlerin temel taşı olsa da, bu tekniklerin verim, her ölçüm için gereken numune miktarı ve hastalık seyri boyunca sıklıkla iç içe geçmiş çoklu biyolojik elementlerin çalışmasını büyük ölçüde sınırlayan maliyet etkinliği ile ilgili önemli sınırlamalarıolabilir1 . Mikrosfer tabanlı çoklama teknolojisi, laboratuvar verimini artırmak, numune kıtlığını azaltmak ve maliyet tasarrufunu en üst düzeye çıkarmak için tekrarlayan testleri azaltmak için tahlilleri birleştirme kabiliyeti nedeniyle hem teşhis hem de araştırma tesisleri için vazgeçilmez bir platform haline gelmiştir 1,2,3,4. Son zamanlarda, bu çoklama gücünün daha da arttırılması, çift muhabir yeteneklerine sahip araçlarla tanıtıldı. Çift raporlayıcı özelliği, algılama için iki floresan kanal uygular ve aynı analit üzerinde birden fazla epitopun algılanmasına izin veren başka bir çoklama boyutu sağlar.
Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2), mevcut koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisinden sorumlu patojendir5. RT-PCR testi, hastalık seyrinin başlangıcında enfeksiyon doğrulaması için çok önemli olsa da, antikor titrelerinin serolojik incelemelerinin, bireylerin önceki bir maruziyet veya iyileşme ile ilgili doğru ve eksiksiz eleştirileri için zorunlu olduğu kanıtlanmıştır; bağışıklamaya bir yanıt; ve/veya Covid-19 aşılama etkinliğinin değerlendirilmesi 6,7.
Bu rapor, akış tabanlı, multipleks okuyuculu çift raporlama sistemi kullanan çoklu SARS-CoV-2 viral antijenleri için serokonversiyonun ölçülmesi için yöntemleri tanımlamaktadır. Spesifik olarak, Spike S1, Nükleokapsid ve Membran (aka Matrix) glikoproteinleri için testler içeren 3 pleks SARS-CoV-2 antijenleri paneli için iki antikor alt tipinin (IgG / IgM veya IgA / IgM olarak yapılandırılmış) eşzamanlı tespiti açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, uzunlamasına serokonversiyonun yakalanması için ideal bir girişim sağlar ve Covid-19 pandemisine karşı cephanelikte değerli bir araç sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well black side polystyrene microtiter plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12-565-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, heat shock fraction</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A-7888-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag)</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS8574735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA35391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Albumin, Fraction V Powder</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2514-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB205009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB204009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB403009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB202009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62999842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Analyzer</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>INTELLIFLEX-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-698-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex-C Microspheres, Region XXX</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>MC10XXX-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate aluminum sealing tape</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>07-200-683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate-20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-751-7328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-V08B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40591-V08H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40592-T62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-R0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb</td>
			<td>ProSci</td>
			<td>10-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>W-64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19

Çoklu biyobelirteçleri uyum içinde sorgulamak için multipleks teknolojiler birkaç on yıldır mevcuttur; Bununla birlikte, aynı analit üzerindeki çoklu epitopları değerlendirme yöntemleri sınırlı kalmaktadır. Bu rapor, SARS-CoV-2 enfeksiyonuna veya aşılamasına karşı immün yanıt ile ilişkili yaygın immünoglobulin izotiplerinin (örneğin, IgA, IgM ve IgG) serolojik testi için çoklanmış bir immünoboncuk testinin geliştirilmesini ve optimizasyonunu açıklamaktadır. Analizler, çift kanal özelliğine sahip akış tabanlı, multipleks floresan okuyucu kullanılarak gerçekleştirildi. Optimizasyonlar, analit yakalama süresine, tespit antikor konsantrasyonuna ve tespit antikor inkübasyon süresine odaklanmıştır. Analitik tahlil performans özellikleri (örneğin, tahlil aralığı (kantitasyonun alt ve üst sınırları dahil); ve tahlil içi ve tahliller arası hassasiyet), 'çift kanallı' mod kullanılarak IgG / IgM veya IgA / IgM serotip kombinasyonu için birlikte oluşturulmuştur. IgG için 30 dakika, IgM için 60 dakika ve IgA için 120 dakika olan analit yakalama süreleri, çoğu uygulama için uygundu ve tahlil performansı ve verim dengesi sağladı. 30 dakika boyunca 4 μg / mL'de optimal tespit antikor inkübasyonları gözlenmiştir ve genel olarak mükemmel hassasiyet (yüzde varyans katsayısı (%CV) ≤% 20) ve gözlenen duyarlılık değerleri göz önüne alındığında, genel uygulamalar için önerilmektedir. IgG izotipinin dinamik aralığı, klinik uygulamalar için 1:500 seyreltme faktöründe sağlam titre değerlendirmelerini destekleyen her tahlil (Spike S1, Nükleokapsid ve Membran glikoproteinleri) için birkaç büyüklük sırasına yayılmıştır. Son olarak, optimize edilmiş protokol, SARS-CoV-2 aşı rejimini tamamlayan denekler (n = 4) için Spike S1 serokonversiyonun izlenmesine uygulandı. Bu kohort içinde, Spike S1 IgG seviyelerinin, ikinci doz uygulamasından sonraki 14 günde, IgM veya IgA izotiplerinden çok daha yüksek (~ 40 kat) sinyal yoğunluğunda maksimum titrelere ulaştığı gözlenmiştir. İlginçtir ki, büyük ölçüde konuya bağlı olan oldukça değişken Spike S1 IgG titre bozunma oranlarının gözlemlendiğini gözlemledik, bu da gelecekteki çalışmaların konusu olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19 at JoVE.com

Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19

Bu makalede, SARS-CoV-2 enfeksiyonuna veya aşılamasına karşı immün yanıttan kaynaklanan iki immünoglobulin izotipi (IgA, IgM veya IgG) için antikor titrelerindeki dinamik değişiklikleri izlemek için uygun bir yöntem açıklanmaktadır. Bu 'Multianalit Covid-19 İmmün Yanıt Paneli', 'çift kanallı' özelliğe sahip akış tabanlı bir multipleks okuyucu kullanılarak okunan kodlanmış mikrosferler üzerine inşa edilmiş üç dolaylı immünotahlil kullanır.

Covid-19 için Multianalit İmmünoboncuk Testi Kullanılarak Serokonversiyonun Dinamik İzlenmesi

Multiplex technologies for interrogating multiple biomarkers in concert have existed for several decades; however, methods to evaluate multiple epitopes ...

Bugün göstereceğimiz yöntem, COVID-19 enfeksiyonları veya rutin analizler için aşılama ile ilişkili antikorların sero-dönüşümünü değerlendirmek için yüksek verimli bir çözüm sunmaktadır. İlginç bir şekilde, bu yaklaşım aynı analit üzerinde birden fazla epitopu değerlendirmemizi sağlar. Bunun, hücre sinyalizasyon çalışmaları ve bağışıklık tepkilerinin izlenmesi de dahil olmak üzere biyolojik bilimlerde çok sayıda uygulaması vardır.Bugün sizin için bu tekniği gösteren, laboratuvarımda doktora sonrası bir araştırmacı olan Dr. Imad Tarhoni olacaktır. Başlamak için, benzersiz boncuk bölgelerine sahip manyetik mikrosferlerin üç farklı şişesini seçin ve kullanılan her şişe için boncuk kimliğini ve lot bilgilerini kaydedin. Ardından, seçilen mikrosfer stoğunu 60 saniye boyunca vorteksleyin ve beş dakika boyunca sonikleştirin.1,5 mililitrelik düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne altı boncuğa 1,0 kat 10 aktarın ve tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin. 60 saniye boyunca ayırmaya izin vermek için. Tüp hala manyetik ayırıcıdayken, boncuk peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın.Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın, ardından boncukları 100 mikrolitre HPLC sınıfı su ve vorteks ile 30 saniye boyunca yeniden askıya alın. Yine, tüpü 60 saniye boyunca manyetik ayırıcıya geri yerleştirin ve daha sonra süpernatanı çıkarın. Yıkama protokolünü iki kez tekrarlayın.Son yıkamadan sonra, tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yıkanmış mikrosferleri 90 mikrolitre aktivasyon tamponunda, pH 6.2'de, vorteks ile 30 saniye boyunca yeniden askıya alın. Daha sonra, mikrosferleri sırasıyla 10 saniye boyunca vorteks ile mililitre başına 10 mikrolitre 50 miligram anhidroksi-sülfosüksinamid ve mililitre EDC çözeltisi başına 10 mikrolitre 50 miligram ile muamele edin. Daha sonra, mikrosferleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca her 10 dakikada bir yumuşak bir vorteks ile inkübe edin.Kuluçkadan sonra, mikrosferleri daha önce açıklandığı gibi 50 milimolar MES veya kaplin tamponu, pH 5.0 ile iki kez yıkayın. Yıkamayı iki kez tekrarlayın. İşiniz bittiğinde, tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve boncukları vorteks tarafından 100 mikrolitre kaplin tamponu ile 30 saniye boyunca yeniden askıya alın, ardından derhal tüpe istenen miktarda protein ekleyin.Kaplin tamponu ile toplam hacmi 150 mikrolitreye getirin ve reaksiyonu vorteks ile 30 saniye boyunca karıştırın. Daha sonra, tüpü oda sıcaklığında döndürerek iki saat boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, mikrosferleri PBS söndürme tamponu ile iki kez yıkayın ve yıkanmış mikrosferleri, vorteks tarafından% 0.05 sodyum azid içeren 100 mikrolitre söndürme tamponunda 30 saniye boyunca yeniden askıya alın.Otomatik bir hücre sayacı kullanarak geri kazanılan mikrosferlerin sayısını sayın ve gözlemlenen boncuk konsantrasyonunu kaydedin. Tahlil performansı için, birleştirilmiş mikrosferleri vorteks ile 30 saniye boyunca yeniden askıya alın ve 60 ila 90 saniye boyunca sonikasyon yapın. Ardından, her bir boncuk kolloidinin gerekli miktarını ilgili tüpten çıkarın ve boncuk kolloidlerini yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.Ardından, tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayırmaya izin verin. Tüp hala manyetik ayırıcıdayken, boncuk peletini rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Boncukları ayırıcıdan çıkardıktan sonra, boncukları 100 mikrolitre tahlil tamponunda yeniden askıya alın.Boncukları ayırmak için tüpü 60 saniye boyunca manyetik bir ayırıcıya yerleştirmeden önce 30 saniye boyunca vorteks. Yıkamayı iki kez tekrarlayın. Daha sonra, her hedef için bir mikrolitre başına 100 mikrosferlik bir nihai konsantrasyon oluşturmak için uygun hacimli bir tahlil tamponu ekleyerek üç katlı çalışma mikrosfer karışımının konsantrasyonunu ayarlayın.Aliquot 25 mikrolitre mikrosfer karışımı 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna. Plazma veya serum örneklerini tahlil tamponunda 500 kat seyreltin ve istenen titrasyona göre standart numuneler hazırlayın. Boş numune olarak 25 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin ve seyreltilmiş numunelerin veya standardın her birini 96 kuyucuklu bir numune plakasının belirlenmiş her bir kuyucuğuna ekleyin.Tamamlandığında, dakikada 700 dönüşe ayarlanmış bir plaka çalkalayıcıda oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe etmek için plakayı alüminyum bir conta veya folyo ile örtün. Makalede açıklandığı gibi tahlil tamponu ile mikrolitre başına dört mikrogramda anti-insan tespit antikorları veya ikincil antikor çözeltilerinden oluşan bir çözelti hazırlayın. Hızlı bir şekilde yıkamak için plakayı manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve ardından sıvıyı kuyucuklardan çıkarmak için plakayı biyolojik tehlike kabının üzerine zorla ters çevirin.Plaka hala ters çevrilmişken, plakayı kalın bir kağıda karşı zorla dokunun. Daha sonra, her bir kuyucuğu 100 mikrolitre tahlil tamponu ile yıkayın ve sıvıyı biyolojik tehlike kabı üzerinde zorla ters çevirerek çıkarın. Yıkamayı iki kez tekrarlayın.Son yıkamadan sonra, kullanılmış tüm kağıt parçalarını biyolojik tehlike kabına atın. Daha sonra, 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 25 mikrolitre ikincil antikor çalışma çözeltisi ekleyin ve dakikada 700 dönüşte bir plaka çalkalayıcı üzerinde inkübe etmek için plakayı alüminyum folyo ile örtün. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, plakanın kuyucuklarını daha önce gösterildiği gibi tahlil tamponu ile iki kez yıkayın.Ardından, 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcı üzerinde beş dakika boyunca inkübe edin. 60 mikrolitrelik bir numuneyi cihaz analizörü aracılığıyla sistem el kitabına göre analiz edin.Numune yakalama inkübasyon süresinin optimizasyonu için, plakaları 30, 60 ve 120 dakikalık bir süre boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, analizör üzerindeki tahlil karışımının 60 mikrolitresini analiz edin. Spike S1, membran antikorları ve nükleokapsid için 1: 5 seri seyreltme serisine dayanan yedi noktalı standart bir eğri değerlendirildi.Tahlil içi hassasiyet testi, varyasyon, standart sapma ve ortalama yüzdesi katsayısı olarak hesaplanan tahlil hassasiyetini değerlendirmek için plaka üzerinde gerçekleştirilmiştir. Tahliller arası hassasiyet için, her tahlil için boncuk setlerinin üç ayrı partisi hazırlandı. Standart ve insan plazma örnekleri ile tahlilin hassasiyet değişkenleri hesaplandı.İnkübasyonun 120 dakikasındaki ortalama medyan floresan yoğunluk değerleri, spike S1, membran ve nükleokapsid antikorları için IgG titreleri için en uygundu ve bu da hızlı bir primer antikor bağlayıcı kinetik olduğunu gösteriyordu. Çift kanallı performanstaki ikincil antikor konsantrasyonu optimizasyonları, tüm konsantrasyonlar için doğrusal ölçümlerde çok çeşitli sinyaller göstermiştir. İkincil antikorların farklı zaman inkübasyonlarından gözlemlenen sinyaller ve tüm inkübasyon süreleri için sinyal değişimleri hakkındaki detaylar burada gösterilmiştir.Çift kanallı analizler için özgüllük değerlendirmelerinde, boşluk ve tek muhabir kanalı arasında ihmal edilebilir çapraz sinyal kontaminasyonu gözlenmiştir. COVID 19 aşılamasını takiben sero-dönüşüm olaylarının çiziminde, gözlenen ani S1 IgA ve IgM değerleri, IgG izotip titrelerinden yaklaşık 40 kat daha düşüktü. Bu yöntemin, bağışıklık sistemi baskılanmış bireylerde aşılara yanıtı izlemek için önemli etkileri vardır.Bu hastaların bu aşılarla gerçekten korunup korunmadığını belirlememize izin verecektir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

Kantitatif Görselleştirme ve Dinamik Termal Görüntüleme Deri Kanseri Tespiti

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Computerized Dynamic Posturography for Postural Control Assessment in Patients with Intermittent Claudication

Aralıklı topallama Hastalarda Postural Kontrol Değerlendirme için bilgisayarlı dinamik postürografi

Computerized dynamic posturography with the EquiTest is an objective technique for measuring postural strategies under challenging static and dynamic ...

Dynamic Lung Tumor Tracking for Stereotactic Ablative Body Radiation Therapy

Stereotaktik Ablatif Vücut Radyasyon Tedavisi için Dinamik Akciğer Tümör Takibi

Physicians considering stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) for the treatment of extracranial cancer targets must be aware of the sizeable ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

Bir Roman kullanarak Terleme İzleme Detaylı Protokol, Küçük Kablosuz Aygıt

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

Bölünmüş Luciferase Assay Sistemi Kullanarak HBx-DDB1 Etkileşiminin Inhibitörlerinin Belirlenmesi

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Evaluation of Capnography Sampling Line Compatibility and Accuracy when Used with a Portable Capnography Monitor

Taşınabilir Kapnografi Monitörü ile Kullanıldığında Kapnografi Örnekleme Hattı Uyumluluğunun ve Doğruluğunun Değerlendirilmesi

Capnography is commonly used to monitor patient&#8217;s ventilatory status. While sidestream capnography has been shown to provide a reliable assessment ...

Real-Time Dynamic Navigation System for the Precise Quad-Zygomatic Implant Placement in a Patient with a Severely Atrophic Maxilla

Ciddi atrofik maksillası olan bir hastada hassas dörtlü zigomatik implant yerleşimi için gerçek zamanlı dinamik navigasyon sistemi

Zygomatic implants (ZIs) are an ideal way to address cases of a severely atrophic edentulous maxilla and maxilla defects because they replace extensive ...

Dynamic Navigation for Dental Implant Placement

Dental İmplant Yerleşimi için Dinamik Navigasyon

In modern implantology, the application of surgical navigation systems is becoming increasingly important. In addition to static surgical navigation ...

A Surgical Model of Heart Failure with Preserved Ejection Fraction in Tibetan Minipigs

Tibet Minipiglerinde Korunmuş Ejeksiyon Fraksiyonlu Kalp Yetmezliğinin Cerrahi Modeli

More than half of heart failure (HF) cases are classified as heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) worldwide. Large animal models are ...

Dynamic Navigation in Endodontics: Guided Access Cavity Preparation by Means of a Miniaturized Navigation System

Endodontide Dinamik Navigasyon: Minyatür Navigasyon Sistemi ile Kılavuzlu Erişim Boşluğu Hazırlığı

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common ...