Name: monitoring protein aggregation kinetics in vivo using automated inclusion counting in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

نشكر مختبر موريموتو لسلالات C. elegans و Esmeralda Bosman على المساعدة في المجهر البؤري عالي الإنتاجية. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة بدء التشغيل من جامعة أوتريخت إلى T.S.

<ol>
	<li>Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+state+and+its+association+with+protein+misfolding+diseases.">The amyloid state and its association with protein misfolding diseases.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).</li><li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+amyloid+formation,+and+human+disease:+a+summary+of+progress+over+the+last+decade.">Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: a summary of progress over the last decade.</a> Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).</li><li>Knowles, T. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analytical+solution+to+the+kinetics+of+breakable+filament+assembly.">An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly.</a> Science. 326 (5959), 1533-1537 (2009).</li><li>Cohen, S. I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+amyloid-&#946;42+aggregates+occurs+through+a+secondary+nucleation+mechanism.">Proliferation of amyloid-&#946;42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9758-9763 (2013).</li><li>Meisl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+protein+aggregation+from+global+fitting+of+kinetic+models.">Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models.</a> Nature Protocols. 11 (2), 252-272 (2016).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+proteins+at+the+pathogenic+threshold+display+neuron-specific+aggregation+in+a+pan-neuronal+Caenorhabditis+elegans+model.">Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model.</a> Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Prahlad, V., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+regulates+the+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+misfolded+proteins.">Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14204-14209 (2011).</li><li>Nollen, E. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screening+strategy+identifies+novel+regulators+of+the+proteostasis+network.">A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network.</a> PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).</li><li>Brehme, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperome+subnetwork+safeguards+proteostasis+in+aging+and+neurodegenerative+disease.">A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease.</a> Cell Reports. 9, 1-16 (2014).</li><li>Calamini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+proteostasis+regulators+for+protein+conformational+diseases.">Small-molecule proteostasis regulators for protein conformational diseases.</a> Nature Chemical Biology. 8 (2), 185-196 (2012).</li><li>Sinnige, T., Stroobants, K., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+studies+of+protein+misfolding+and+aggregation+in+in+vivo+models+of+Alzheimer's+and+Parkinson's+diseases.">Biophysical studies of protein misfolding and aggregation in in vivo models of Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 49, 22 (2020).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model.">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7, 13023 (2016).</li><li>Sinnige, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+reveals+that+independent+nucleation+events+determine+the+progression+of+polyglutamine+aggregation+in+C.+elegans.">Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 202188118 (2021).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans.">Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>. FIJI/ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/downloads">https://imagej.net/downloads</a> (2012)</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions.">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li><li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+free,+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis.">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> BioTechniques. 42 (1), 71-75 (2007).</li><li>CellProfiler. Broad Institute Available from: <a target="_blank" href="https://cellprofiler.org/releases">https://cellprofiler.org/releases</a> (2021)</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>. Knowles group, University of Cambridge Available from: <a target="_blank" href="https://amylofit.com/amylofitmain/login/">https://amylofit.com/amylofitmain/login/</a> (2021)</li><li>Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+tissue-specific+proteostatic+decline+in+Caenorhabditis+elegans.">Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), (2021).</li><li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset.">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).</li><li>Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+enhances+the+heat+shock+response+and+decreases+polyglutamine+aggregation+in+an+HSF-1-dependent+manner+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 141-142, 1-4 (2014).</li><li>David, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+protein+aggregation+as+an+inherent+part+of+aging+in+C.+elegans.">Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans.</a> PLoS Biology. 8 (8), 47-48 (2010).</li><li>Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+sieve:+A+low-tech+instrument+and+methodology+for+sorting+small+multicellular+organisms.">Caenorhabditis sieve: A low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).</li><li>Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours.">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73 (2018).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+and+long-term+immobilization+in+a+hydrogel-microbead+matrix+for+high-resolution+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+and+other+small+organisms.">Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms.</a> PLoS One. 13 (3), 0193989 (2018).</li></ol>

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

تسهل الطريقة المعروضة هنا تحليلا كميا وغير متحيز لحركية تجميع البروتين في الكائن الحي النموذجي C. elegans. ويعتمد ذلك على أربعة عناصر رئيسية (الشكل 1): 1) الحفاظ على مجموعة متزامنة حسب العمر من الديدان الخيطية؛ و 1) الحفاظ على عدد من الديدان الخيطية المتزامنة مع تقدم العمر؛ و 1) الحفاظ على عدد من الديدان الخيطية المتزامنة مع العمر؛ و 1) الحفاظ على عدد من الديدان الخيطية المتزامنة 2) المجهر الفلوري في لوحات متعددة الآبار ؛ 3) العد الآلي للتضمين في CellProfiler ؛ 4) تركيب البيانات في AmyloFit. بالمقارنة مع العد اليدوي للشوائب في الحيوانات المتحركة بحرية أو من الصور المحفوظة26 ، فإن القياس الكمي في CellProfiler أسرع وأكثر حيازة. التقدم الرئيسي الآخر للبروتوكول هو الحصول على البيانات الحركية ، بدلا من النقاط الزمنية الفردية ، والتي توفر رؤى كمية في آلية التجميع عند ملاءمة البيانات مع نموذج رياضي.
يمكن استخدام العناصر الأربعة للبروتوكول كوحدات مستقلة يمكن تعديلها اعتمادا على التطبيق. يمكن أيضا الحفاظ على السكان المتزامنين مع العمر باستخدام 5-fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) لتعقيم الحيوانات. يؤثر هذا المركب على العمر الافتراضي والبروتيوستاسيس24,25 وهو مسرطن للغاية للمجرب ؛ ومع ذلك ، فإنه يمنع النقل اليدوي للديدان ، والتي يمكن أن تكون كثيفة العمالة عند التعامل مع أعداد كبيرة. البدائل الأخرى هي استخدام الطفرات المعقمة29 أو أجهزة الترشيح لفصل النسل30.
يمكن أيضا تعديل خطوة الفحص المجهري الفلوري ، على سبيل المثال ، باستخدام تكبيرات أعلى لمراقبة تراكم البروتين في الخلايا العصبية. قد يكون الفحص المجهري واسع المجال كافيا لمراقبة تراكم polyQ في خلايا العضلات عندما يكون الفرق النسبي بين الظروف أكثر أهمية من الأعداد المطلقة للشوائب. لا يزال من الممكن استخدام خط أنابيب CellProfiler في هذه الحالات ، على الرغم من أن الإعدادات للتعرف على الديدان والتضمينات ستحتاج إلى تعديلها من قبل المستخدم. إنتاجية هذه التقنية محدودة حاليا بسبب الحاجة إلى الانتقاء اليدوي للحيوانات في لوحة 384 بئرا. يمكن علاج هذا عن طريق استخدام أجهزة الموائع الدقيقة16. أزيد الصوديوم هو مخدر قاس نسبيا ، والذي يمكن استبداله بالتجميد البدني مع الهلاميات المائية أو الخرز28,29.
يعتمد التحليل في AmyloFit المعروض هنا على آلية تجميع تتكون من أحداث نووية مستقلة في الخلايا الفردية. في الحالات التي لا يتناسب فيها هذا النموذج ، يجب على المستخدم النظر في بديل مثل نموذج التجميع التعاوني الذي تم تطويره سابقا17. أحد القيود المفروضة على هذا النهج هو أن السلالات التي تعبر عن البروتين ذي الأهمية بتركيزات مختلفة يجب أن تكون متاحة ، على الرغم من أنه يمكن توليدها باستخدام طرق C. elegans الروتينية 24.
وإجمالا، يوفر هذا البروتوكول وسيلة للحصول على بيانات عالية الجودة لحركية تجميع البروتين في نظام نموذجي في الجسم الحي ، مما يسمح بإجراء تحليل مفصل لآليات التجميع17. على الرغم من أن الطريقة قد أثبتت لتجميع polyQ في الأنسجة العضلية C. elegans ، إلا أن التطبيقات المستقبلية للبروتوكول قد تشمل بروتينات وأنسجة أخرى وتأثيرات عوامل البروتيوستاسيس والجزيئات الصغيرة.

يحدث تراكم البروتينات غير المطوية في رواسب غير قابلة للذوبان في مجموعة واسعة من الأمراض. ومن الأمثلة المعروفة على ذلك تجميع β أميلويد وتاو في مرض الزهايمر ، α-سينوكلين في مرض باركنسون ، وهنتنغتين مع polyQ الموسع في مرض هنتنغتون 1,2. يرتبط سوء طي هذه الببتيدات المتعددة إلى ألياف أميلويد بالسمية وموت الخلايا بواسطة آليات لا تزال غير واضحة إلى حد كبير. سيكون توضيح آليات تكوين الأميلويد أمرا بالغ الأهمية لتطوير علاجات فعالة ، غير متوفرة حاليا.
تم إجراء تحقيقات مفصلة لتشكيل الأميلويد في المختبر بناء على قياسات التألق ثيوفلافين T ، مما أدى إلى فهم ميكانيكي لعملية التجميع وتأثير الجزيئات المثبطة3،4،5. ومع ذلك ، ليس من الواضح ما إذا كانت آليات التجميع نفسها صحيحة في البيئة المعقدة للخلايا الحية والكائنات الحية. الدودة الخيطية Caenorhabditis elegans هي كائن حي نموذجي مناسب لدراسة تراكم البروتين في الجسم الحي. لديها تشريح بسيط نسبيا ولكنها تتكون من أنسجة متعددة ، بما في ذلك العضلات والأمعاء والجهاز العصبي. وهي تتميز بشكل جيد وراثيا ، وأدوات التعديل الوراثي متاحة بسهولة. علاوة على ذلك ، لديها وقت جيل قصير من ~ 3 أيام وعمر إجمالي من 2-3 أسابيع. على هذا النحو ، يمكن فحص تجميع البروتين عبر عمر الحيوان على نطاق زمني مناسب تجريبيا. وأخيرا، فإن الديدان الخيطية شفافة بصريا، مما يتيح تتبع تجميع البروتينات ذات العلامات الفلورية في الحيوانات الحية.
تم استغلال هذه الميزات من C. elegans سابقا للتحقيق في تجميع بروتينات polyQ كنموذج لأمراض توسع Huntington وغيرها من أمراض توسع polyQ. فوق العتبة المسببة للأمراض من 35-40 بقايا الجلوتامين ، يمكن ملاحظة بروتينات polyQ الموسومة بالبروتين الفلوري الأصفر (YFP) لتشكيل شوائب غير قابلة للذوبان في الأنسجة العضلية6,7 ، الخلايا العصبية8 ، والأمعاء 9,10. وقد استخدمت هذه الميزات على نطاق واسع لفحص الجينات 11،12،13 ومعدلات الجزيئات الصغيرة 14 من تجميع البروتين والسمية.
C. elegans لديه القدرة على لعب دور مهم في سد الفجوة بين الدراسات المختبرية لتجميع البروتين ونماذج الأمراض الأكثر تعقيدا مثل الفئران15. C. elegans قابل لفحص المخدرات16 ولكن يمكن أيضا استغلاله للحصول على فهم أساسي للآليات الجزيئية لتراكم البروتين في الجسم الحي ، كما هو موضح مؤخرا17. ومع ذلك ، بالنسبة لكلا التطبيقين ، من الأهمية بمكان استخراج مقياس كمي وقابل للتكرار لتجميع البروتين. هنا ، يتم تحقيق ذلك باستخدام مجهر بؤري بؤري عالي الإنتاجية جنبا إلى جنب مع خط أنابيب مخصص لتحليل الصور (الشكل 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Black with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmyloFit</td>
			<td>Knowles lab</td>
			<td>v2.0</td>
			<td>Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line A</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1228</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line B</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1229</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line C</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1230</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line D</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1231</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>4.1.3</td>
			<td>Downloaded from https://cellprofiler.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>Open-source</td>
			<td>(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j</td>
			<td>Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-throughput confocal microscope</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager CV8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>&#160;17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>WU Mainz</td>
			<td>250</td>
			<td>To make worm pick, 150 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum iridium wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>39383</td>
			<td>To make worm pick, 0.25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein aggregation kinetics in vivo using automated inclusion counting in caenorhabditis elegans

يعد تجميع البروتين في شوائب غير قابلة للذوبان سمة مميزة لمجموعة متنوعة من الأمراض البشرية ، وكثير منها مرتبط بالعمر. الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans هي كائن حي نموذجي راسخ تم استخدامه على نطاق واسع في هذا المجال لدراسة تجميع البروتين والسمية. تتيح شفافيتها البصرية التصور المباشر لتجميع البروتين بواسطة المجهر الفلوري. علاوة على ذلك ، فإن الدورة التناسلية السريعة والعمر القصير يجعلان من الديدان الخيطية نموذجا مناسبا لفحص الجينات والجزيئات التي تعدل هذه العملية.
ومع ذلك ، فإن القياس الكمي للحمل الكلي في الحيوانات الحية غير موحد بشكل جيد ، وعادة ما يتم إجراؤه عن طريق العد اليدوي للإدراج تحت مجهر تشريح التألق في نقطة زمنية واحدة. ويمكن أن يؤدي هذا النهج إلى تباين كبير بين المراقبين ويحد من فهم عملية التجميع. في المقابل ، يتم مراقبة تراكم البروتين الشبيه بالأميلويد في المختبر بشكل روتيني بواسطة فلورة ثيوفلافين T بطريقة كمية للغاية ويتم حلها بمرور الوقت.
هنا ، يتم تقديم طريقة مماثلة للتحليل غير المتحيز لحركية التجميع في C. elegans الحية ، باستخدام مجهر بؤري عالي الإنتاجية جنبا إلى جنب مع تحليل الصور حسب الطلب وتركيب البيانات. يتم إثبات قابلية تطبيق هذه الطريقة من خلال مراقبة تكوين تضمين بروتين البولي جلوتامين (polyQ) المسمى بالفلورسنت في خلايا عضلات جدار الجسم. يسمح سير عمل تحليل الصور بتحديد أعداد الشوائب في نقاط زمنية مختلفة ، والتي يتم تركيبها على نموذج رياضي يعتمد على أحداث النوى المستقلة في خلايا العضلات الفردية. قد تكون الطريقة الموصوفة هنا مفيدة لتقييم آثار عوامل البروتينات والعلاجات المحتملة لأمراض تجميع البروتين في حي بطريقة قوية وكميتة.

تم استخدام الطريقة الموضحة هنا (الشكل 1) لتحليل حركية التجميع لبنية تتكون من 40 جلوتامين منصهرة في YFP (Q40-YFP). يتم التعبير عن البروتين تحت سيطرة المروج unc-54 ، مما يدفع التعبير في خلايا العضلات جدار الجسم. نظرا لأن هذه الأهداف كبيرة نسبيا وسهلة التصور ، فإن استخدام هدف 10x يكفي لحل الشوائب التي تشكلها Q40-YFP في هذا الأنسجة. تم تطوير أربع سلالات (خطوط A-D) سابقا تعبر عن البروتين بدرجات مختلفة لتقييم اعتماد تركيز تراكم polyQ في الجسم الحي17.
تم إنشاء مجموعات متزامنة مع العمر من الخطوط A-D عن طريق وضع البيض لمدة 2 ساعة ، تليها عملية نقل يومية بمجرد وصول النسل إلى مرحلة البلوغ. من اليوم الأول إلى اليوم 10 من مرحلة البلوغ ، تم تصوير 20 حيوانا من كل سلالة من السلالات الأربع في صفيحة من 384 بئرا ، باستخدام مجهر بؤري عالي الإنتاجية. تم الحصول على صور الآبار على شكل 6 بلاطات ، والتي تم خياطتها معا باستخدام مكون إضافي في ImageJ21 (الشكل 2). تم تحليل الصور المخيطة لاحقا باستخدام خط أنابيب CellProfiler22 المصنوع خصيصا (الشكل 3) لتحديد متوسط عدد التضمين لكل لكل سلالة ونقطة زمنية.
ثم تم تركيب البيانات على نموذج رياضي في AmyloFit5 (الشكل 4). يعتمد النموذج على افتراض أن كل خلية من خلايا عضلات جدار الجسم البالغ عددها 95 خلية تكتسب بشكل مستقل إدراجا واحدا من خلال حدث نووية يحد من المعدل ، يليه نمو إجمالي سريع17. أسفرت الملاءمة عن معدل نوى ثابت قدره 9.9 × 105 جزيئات M-2.1 d-1 cell-1 وترتيب تفاعل قدره 2.1 ، يقابل معدل نواة 0.38 جزيء d-1 cell-1 عند تركيز بروتين داخل الخلايا يبلغ 1 mM. أدى اثنان من النسخ المتماثلة البيولوجية المستقلة إلى قيم متطابقة بشكل وثيق لمعدل التنوي وترتيب التفاعل ، والتي تتفق مع دراسة سابقة باستخدام بروتوكول مماثل17 (الجدول 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig01v2.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على الطريقة . (أ) يتم إنشاء مجموعات C. elegans المتزامنة مع العمر بواسطة وضع البيض في الوقت المحدد. (ب) يتم تصوير الحيوانات من نفس المجموعة في صفيحة من 384 بئرا في نقاط زمنية مختلفة. (ج) يتم خياطة البلاط معا لتشكيل صور للآبار بأكملها ، والتي يتم تحليلها في CellProfiler لتحديد أرقام التضمين لكل. (د) يتم تركيب البيانات على نموذج رياضي باستخدام AmyloFit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig01largev2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig02.jpg"> الشكل 2: لقطات شاشة لإجراء الخياطة في ImageJ باستخدام المكون الإضافي Grid / Collection خياطة21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig03.jpg"> الشكل 3: مخطط خط أنابيب CellProfiler لقياس أعداد التضمينات. (A-C) تستخدم صورة الحقل الساطع (A) لتحديد الديدان (B ، عن قرب في C). (D-G) تستخدم صورة التألق (D ، عن قرب في E) لتحديد الشوائب (F). ترتبط الديدان والشوائب بتوفير عدد الشوائب لكل دودة في البئر (G). الصور المعروضة هي لحيوانات Q40 Line A في اليوم 3 من مرحلة البلوغ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig04.jpg"> الشكل 4: تركيب البيانات مع نموذج رياضي في AmyloFit. (أ) يتم تحميل البيانات إلى AmyloFit. (ب) يتم إدخال معادلة مخصصة لتشكيل نموذج التضمين ، بافتراض أحداث نواة مستقلة في كل خلية. (ج) تركيب حركية التجميع لخطوط C. elegans A-D التي تعبر عن مستويات مختلفة من Q40-YFP. وتمثل البيانات نسختين متماثلتين بيولوجيتين مستقلتين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>مجموعة البيانات 1</td>
			<td>مجموعة البيانات 2</td>
			<td>سينيغ وآخرون.17
</td>
		</tr>
<tr>
<td>n</td>
			<td>2.1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>الخلية K (جزيئات M-n d-1 cell-1)</td>
			<td>9.9 × 105
</td>
			<td>1.4 × 105
</td>
			<td>3.1 × 104
</td>
		</tr>
<tr>
<td>معدل التنوي عند 1 mM (جزيئات d-1 cell-1)</td>
			<td>0.38</td>
			<td>0.21</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: قيم معدل التنوي وترتيب التفاعل لتجميع Q40-YFP. بيانات لنسختين بيولوجيتين مستقلتين من البروتوكول ومقارنتهما بالبيانات المنشورة سابقا17.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

هنا ، يتم تقديم طريقة لتحليل حركية تجميع البروتين في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans. يتم تصوير الحيوانات من مجموعة سكانية متزامنة مع العمر في نقاط زمنية مختلفة ، تليها عد التضمين شبه الآلي في CellProfiler وتناسبها مع نموذج رياضي في AmyloFit.

مراقبة حركية تجميع البروتين في الجسم الحي باستخدام عد التضمين الآلي في Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

تم التحقيق في آليات تجميع البروتين حتى الآن في الغالب في المختبر. مع بروتوكولنا يمكننا إجراء دراسات كمية مماثلة في الكائن الحي النموذجي C.elegans. الميزة الرئيسية لطريقتنا هي القياس الكمي غير المتحيز لأرقام التضمين.ومن خلال ملاءمة هذه البيانات عالية الجودة، مع النماذج الرياضية، يمكننا الحصول على رؤى حول آلية التجميع. يحدث تراكم البروتين في العديد من الأمراض، بما في ذلك مرض الزهايمر وهانتنغتون. يعد فهم الآلية الجزيئية لتجميع البروتين في الجسم الحي أمرا بالغ الأهمية لتطوير علاجات جديدة.ابدأ بوضع 10 ديدان خيطية بالغة على صفيحة NGM ببذور 6 سم مع اختيار دودة بلاتينية لإجراء وضع بيض متزامن. اترك البالغين يضعون البيض لمدة ساعتين تقريبا عند 20 درجة مئوية قبل إزالته من الطبق. ضع الأطباق مع البيض في الحاضنة في الساعة 20 م.راقب تطور الحيوانات حتى تصل إلى مرحلة البلوغ في اليوم الثالث تقريبا بعد وضع البيض.قم بإعداد الصفيحة المكونة من 384 بئرا عن طريق ملء العدد المطلوب من الآبار ب 100 لتر من المخزن المؤقت M9 مع استكماله بأزيد الصوديوم 25 mM كمخدر. املأ بئرا واحدا لكل سلالة ليتم تصويرها. لكل سلالة ، انقل 20 حيوانا إلى بئر واحد باستخدام اختيار دودة البلاتين.قم بتغطية اللوحة بالغطاء للتبخر الوقائي ، وقم بتصوير اللوحة في غضون ساعة واحدة بعد التحضير. قم بتشغيل الأداة ، وافتح البرنامج. انقر على زر التشغيل بجوار تفريغ لوحات الآبار ، ووضع لوحة 384 بئر في المجهر.ضمن قائمة الإجراءات واكتساب التألق 3D، انقر فوق اختبار، وحدد الديدان التي تحتوي على البئر. اضبط معالجة الصور على لا شيء. وانقر فوق الزر تشغيل لتحديد مسافة التحول المثلى التي تتمركز فيها الديدان بشكل صحيح.اضبط المسافة التصاعدية على 50 مترا، والمسافة التنازلية على 50 مترا، والفاصل الزمني للتقطيع على 2 متر لالتقاط سمك الحيوانات بالكامل في المكدس z. اضبط معالجة الصور مرة أخرى على الحد الأقصى. حدد الآبار المراد تصويرها ضمن إعداد مسح لوحة البئر.ثم حدد البلاط والحصول على البئر بالكامل. احفظ إعداد القياس. وانقر فوق بدء القياس لبدء التجربة.افتح CellProfiler واسحب خط الأنابيب إلى النافذة إسقاط ملف خط أنابيب هنا. انقر فوق نعم لتحميل المشروع. بعد ذلك ، اسحب الصور المخيطة إلى نافذة إسقاط الملفات والمجلد هنا.انقر على وحدة إدخال البيانات الوصفية. اضبط التعبير العادي للاستخراج من اسم الملف وفقا لأسماء الصور المخيطة. انقر فوق وحدة إدخال NamesAndTypes ، واضبط تحديد معايير القاعدة لمطابقة القنوات في أسماء الملفات.ثم انقر فوق إعدادات الإخراج لتحديد مجلد لحفظ الإخراج من CellProfiler. انقر فوق بدء وضع الاختبار للتحقق من إعدادات خط الأنابيب باستخدام مجموعة بيانات التصوير الأولى. انقر فوق خطوة لتشغيل عبر خط الأنابيب ، وحدة واحدة في كل مرة.لضبط الخطوط العريضة للفيروس المتنقل ، انقر فوق إظهار التعليمات في الوحدة النمطية EditObjectsManually لرؤية التعليمات. تصحيح الخطوط العريضة. ثم انقر فوق تم لمتابعة تشغيل خط الأنابيب.انقر فوق الخروج من وضع الاختبار وتحليل الصور. افتح مجلد الإخراج لعرض ملفات الإخراج. وافتح الصور باسم الملف الأصلي متبوعا بالخطوط العريضة للتحقق مما إذا كانت الديدان والتضمينات قد تم وضعها بشكل صحيح.لبدء استخدام AmyloFit ، قم بتسمية المشروع وانقر فوق إنشاء مشروع. انقر فوق فتح لفتحه. وإنشاء جلسة عن طريق إعطائها اسما والنقر على إنشاء وتحميل الجلسة.انقر فوق إضافة بيانات، وقم بتحميل الملف الذي يحتوي على متوسط أعداد التضمينات لكل حيوان، باتباع متطلبات تنسيق البيانات الموضحة في اللوحة اليمنى. ثم انقر فوق تحميل بيانات جديدة. قم بتعيين عدد النقاط إلى المتوسط فوق إزاحة نقطة الصفر إلى 0، وقم بتعيين عدد النقاط إلى المتوسط فوق الهضبة إلى 0 لتخطي خطوات المعالجة المسبقة، والتي ليست مطلوبة لبيانات حساب التضمين.ثم انقر فوق إرسال. كرر هذه الخطوة لكل تركيز بروتين. حدد مخصص في لوحة النموذج.أدخل معادلة النوى المستقل في مربع المعادلة. وانقر فوق تحميل النموذج. بالنسبة إلى Ncells، اضبط نوع المعلمة على Global Constant، واضبط القيمة على 95، المقابلة لعدد خلايا عضلات جدار الجسم.قم بتعيين أنواع المعلمات إلى Global fit ل Kcell و n. وإلى ثابت ل م. أدخل قيم m للسلالات المختلفة في اللوحة اليمنى.اترك عدد قفزات الحوض دون تغيير، وانقر فوق احتواء في لوحة التركيب. أخيرا ، قم باستخراج الملاءمة بالنقر فوق تنزيل البيانات و Fit. تم رصد أرقام التضمين في أربع سلالات C.elegans تعبر عن تركيزات Q40 مختلفة.يصف نموذج النوى المستقل حركية التجميع جيدا. أسفر التناسب عن ترتيب تفاعل قدره 2.1 ، ومعدل نواة قدره 0.38 جزيء يوميا لكل خلية عند تركيز بروتين داخل الخلايا يبلغ 1 ملليمتر. أظهر اثنان من النسخ المتماثلة البيولوجية المستقلة في دراسة سابقة قيما متطابقة بشكل وثيق لترتيب التفاعل ومعدل النوى.شيء واحد يجب أن يؤخذ في الاعتبار هو أنك تحتاج إلى مجموعات بيانات عالية الجودة لتركيزات البروتين المتعددة للحصول على نوبات موثوقة. يمكن استخدام هذه الطريقة لإيجاد طرق للتداخل مع تراكم البروتين في كائن حي ، مثل الضربات القاضية الجينية أو علاجات الجزيئات الصغيرة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

تنامي البلورات البروتينية مع أبعاد متميزة باستخدام الآلي تبلور مقرونا في الموقع الحيوي تشتت الضوء

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

تقييم أثر تراكم البروتين في الأكسدة الخلوية في الخميرة

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

قياس الألوان فحوصات من داخل الخلايا لاكتات الصغيرة وبيروفات في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

زراعة الواسعة النطاق على أساس لوحة ايليجانس كاينورهابديتيس: "إعداد نموذج" "دراسة التعديلات الأيضي" في مرض السكري

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

توليف معيار مبتور للكم من 2-Arashidonoylglycerol في Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

في فيفو هيدروكسيل الجذر البروتين البصمة لدراسة التفاعلات البروتين في Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...