Name: monitoring protein aggregation kinetics in vivo using automated inclusion counting in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

我们感谢森本实验室提供 秀丽隐杆线虫 菌株，并感谢Esmeralda Bosman在高通量共聚焦显微镜方面的帮助。这项工作由乌得勒支大学向T.S.提供的启动补助金资助。

1. 秀丽隐杆线虫年龄同步种群的增长
<ol><li>根据标准程序18，在20°C下用大肠杆菌OP50接种的线虫生长培养基（NGM）板上维持秀丽隐杆线虫菌株。</li>
	<li>通过将10个成年线虫放在带有铂蚯蛆的6厘米种子NGM板上，进行同步产卵。让成虫在20°C下产卵约2小时，然后取出它们。每个菌株准备1-4个板，具体取决于菌株的生育力和要采取的时间点数。</li>
	<li>将装有种蛋的板置于20°C的孵化器中。 监测动物的发育，直到它们成年。 注意：动物成年的那一天在这里被定义为第1天。通常，这是产卵后三天。</li>
	<li>从第1天开始，每天将动物转移到新的种子NGM平板上，以将它们与后代分开。为了补偿在转移过程中死亡或丢失的动物，每株转移约40只动物，乘以要成像的点数（参见步骤2）。继续进行，直到动物停止产下受精卵（~成年期的第6天）。 注意：排除有袋装或其他发育表型的动物。袋装通常在表达易聚集蛋白的菌株中观察到。</li>
</ol>2. 在多孔板中制备 秀丽隐杆线虫 的样品
注意：由于成像程序需要最终会杀死动物的麻醉剂，因此相同的动物不能在随后的时间点重复使用。相反，来自同一年龄同步批次的不同动物在不同的日期进行成像。尽管大多数菌株在第1天几乎没有内含物，但建议将此时间点作为基线。
<ol><li>通过用100μL M9缓冲液填充所需数量的孔来制备384孔板，并补充25mM NaN3 作为麻醉剂。每个菌株填充一个孔以进行成像。 注意：叠氮化钠（NaN3）是有毒的，应小心处理。</li>
	<li>对于每种菌株，使用铂蚯蚓将20只动物转移到一个孔中。 注意：蠕虫在放入井中之前必须放置在细菌草坪之外。细菌使动物粘附在蠕虫镐上，这可以阻止它们的释放，并使井内容物变得浑浊。通常，20是每孔的最佳动物数量，以防止蠕虫之间的重叠，同时限制空井空间的不必要成像。</li>
	<li>用盖子盖住板以防止蒸发，并在制备后1小时内对板进行成像。</li>
	<li>每天重复步骤2.1-2.3，直到达到包涵体数量的稳定平台或直到大多数动物死亡。每天在同一时间进行样品制备和成像，以确保间隔24小时。</li>
</ol>3. 高通量共聚焦显微镜的图像采集
注意：该实验也可以设置在带有多孔板支架的常规旋转盘共聚焦显微镜上。具有大视场的相机有利于限制需要成像以跨越整个油井的瓷砖数量。有关此方案中使用的显微镜和软件的详细信息，请参阅 材料表 。
<ol><li>打开仪器并打开软件。</li>
	<li>通过转到 测量设置|开始新的实验方案新建。选择正确的多孔板类型，然后单击 创建新的测量设置。</li>
	<li>通过转到 Ch 1设置荧光通道。将目标设置为 10 倍。选择 488 nm 作为光源， BP525/25 作为发射滤光片，对YFP进行成像。将合并为 2x2 以减小文件大小。</li>
	<li>单击 添加通道 ，然后选择 明场 作为方法。</li>
	<li>要将 z-stack 共聚焦荧光图像添加到测量中，请选择“操作列表”下的“3D 荧光采集”。转到“选择”，然后选择“通道 1”。要最小化文件大小，请将“图像处理”设置为“最大值”，以便保存最大投影图像，而不是整个 z 堆栈。</li>
	<li>点击 高炉/PH 采集|选择|第 2 章 用于明场通道。</li>
	<li>单击“卸载孔板”旁边的播放按钮（查找指向右侧的三角形符号），然后将 384 孔板放入显微镜中。</li>
	<li>在 “3D 荧光采集”下，单击“ 测试 ”并选择包含蠕虫的孔，以确定蠕虫正确居中的最佳移动距离。将 “上升距离 ”设置为 50 μm， 将“下降距离” 设置为 -50 μm，将 切片间隔 设置为 2 μm，以捕获 z 组中动物的整个厚度。</li>
	<li>优化曝光时间，为所有四种菌株获得良好的信号强度，同时避免饱和。对所有菌株和时间点使用相同的曝光时间。</li>
	<li>在孔 板扫描设置下选择要成像的孔。选择“ 平铺 ” 并获取“整个井”。</li>
	<li>保存 “测量设置” ，然后单击“ 开始测量”开始实验。对于后续时间点，打开相同的测量设置并调整移动距离和要成像的孔。</li>
</ol>4. 在 ImageJ 中拼接平铺图像
注意：仅当使用大于 4x 的物镜时，才需要执行此步骤，其中每个井的图像将作为多个图块进行获取。在此分析工作流程中，使用免费软件FIJI/ImageJ19 执行图块拼接（图2）。根据步骤3中使用的仪器，也可以直接在随附的软件中执行拼接。
<ol><li>下载斐济20 并打开它。</li>
	<li>转到 插件|拼接|网格/集合拼接21.</li>
	<li>在弹出窗口的 “网格/集合拼接”中，选择收集图块 的类型 和 顺序 。选择 “网格：逐行 ”和 “右与下”。</li>
	<li>在下一个窗口中， 网格拼接：网格：逐行，右和下，在x和y方向上插入瓷砖数量。对于此处使用的 10 倍物镜，选择 2 作为 格网大小 x， 选择 3 作为 格网大小 y， 选择 0 作为 图块重叠。</li>
	<li>单击“ 浏览 ”，然后选择包含要拼接的 TIFF 图像的文件夹。</li>
	<li>在 磁贴的文件名下插入通用文件名，在每个文件名中的磁贴编号位置使用 {i}。</li>
	<li>取消选中下面的所有框。</li>
	<li>运行插件。</li>
	<li>将生成的图像另存为 TIFF 文件，以便在下一步中进行分析。</li>
</ol>5. 使用细胞探查器22 自动计数内含物
<ol><li>下载并安装开源图像分析软件 CellProfiler23。从 github.com/sinnigelab/aggregate-quantification 下载 InclusionCounting.cpproj 管道。</li>
	<li>打开 CellProfiler 并将管道拖动到 “将管道文件拖放 到此处”窗口中。 单击“ 是”加载项目。</li>
	<li>单击 图像 输入模块，然后将拼接的图像拖到窗口中 将文件和文件夹拖放到此处。</li>
	<li>单击 元数据 输入模块。调整 正则表达式以 根据拼接图像的名称从文件名中提取。</li>
	<li>单击 “名称和类型” 输入模块，然后调整 “选择规则条件” 以匹配文件名中的通道。 注意：在管道的默认设置中，包含 BF 的文件名被识别为明场图像，并命名为 Worms。包含 YFP 的文件名被识别为荧光图像，并被命名为 荧光。</li>
	<li>单击“ 查看输出设置 ”以选择默认文件夹以保存CellProfiler的输出。</li>
	<li>单击“ 启动测试模式” 以使用第一个映像数据集检查管道的设置。单击“ 运行 ”以运行管道中的所有模块，或单击 “步骤” 以一次一个模块地运行管道。要在 EditObjectsManually 模块中调整蠕虫轮廓，请单击“ 帮助 ”以查看说明，然后单击“ 完成 ”以继续运行管道。 注意：在测试模式下，提取的测量值将不会导出。检测蠕虫和夹杂物的阈值参数可能需要根据所使用的应变和放大倍率进行调整。</li>
	<li>单击“ 退出测试模式” 并 分析图像。</li>
	<li>打开输出文件夹以查看输出文件。打开带有原始文件名后跟 轮廓 的图像，以检查蠕虫和内含物是否正确叠加。 注意：每个蠕虫的内含物数量可以在名为 ExpandedWormObjects 的文件中找到。有关输入图像的详细信息，请参阅名为 Image 的文件。可以在管道中的 “导出到单张” 模块中选择其他输出。</li>
</ol>6. 使用 AmyloFit5 对内含物计数数据进行全局拟合
注意：仅当多种蛋白质浓度的数据可用时，才能执行此步骤。对于Q40-YFP，先前已经创建了一组四种在体壁肌肉细胞中具有不同水平过表达的菌株17。在其他情况下，应使用质粒显微注射和基因组整合24产生新的菌株。
<ol><li>转到免费的在线拟合平台，获取聚合动力学 AmyloFit25。 注册或使用现有帐户登录。 注意：有关如何使用AmyloFit的广泛手册，可以访问以获取更多帮助。有关详细信息，请参阅网页左上角的链接（登录后）。</li>
	<li>要开始使用AmyloFit， 请命名 项目，然后单击“ 创建项目”。通过单击“ 打开 ”打开项目，并通过为其命名并单击“ 创建和加载会话”来创建会话。</li>
	<li>单击 添加数据 ，然后按照左侧面板中显示的数据格式要求上传包含每只动物的平均内含物数量的文件。单击“ 加载新数据”。</li>
	<li>跳过预处理步骤，这些步骤对于包含计数数据不是必需的，方法是将零点偏移的点数设置为平均值，并将平台设置为 0 的平均值。单击“提交”。对每个蛋白质浓度（即，上传文件中的每一列）重复此步骤。</li>
	<li>在模型面板中选择 自定义 ，在公式框中输入 Ncells*（1-exp（-Kcell*m**（n）*（t-1）））， 然后单击 载荷模型。 注意：由于AmyloFit最初是为分析 体外 测定的动力学数据而设计的，因此必须加载定制的模型来分析 秀丽隐杆线虫 的包涵体计数数据。在这里使用的方程中， N个细胞 是发生包涵体形成的细胞数量， K细胞 是成核速率常数， m 是细胞内蛋白质浓度， n 是成核的反应顺序。</li>
	<li>将参数类型设置为 N个单元格的全局常量、K单元格和 n 的全局拟合以及 m 的 Const。将体壁肌肉细胞的 N 个单元格值设置为 95，将 K单元格 的初始猜测设置为 n 到 1。在左侧面板中输入不同菌株的 m 值。 注意：初始猜测与此处使用的相对简单的模型无关。对于更复杂的模型，输入预期值的估计值以缩短计算时间是有益的。</li>
	<li>保持盆跃点数不变，然后单击管接头面板中的 “适合 ”。</li>
	<li>通过单击 下载数据和拟合来提取拟合。 注意：通过模型的全局拟合提取的参数将列在右下角。数据和拟合的绘图将在右上角的面板中自动生成。此图可以通过单击下载pdf来提取 ， 并通过转到 显示绘图选项进行自定义。 K细胞 具有分子浓度-n时间-1细胞-1的单位。为了比较具有不同 n的值， K细胞 可以通过将其与 mn相乘来转换为给定蛋白质浓度下的成核速率。</li>
</ol>

<ol>
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作者没有利益冲突需要披露。

本文提出的方法有助于对模型生物 秀丽隐杆线虫中的蛋白质聚集动力学进行无偏倚和定量分析。它取决于四个关键要素（图1）：1）维持年龄同步的线虫种群;2）多孔板中的荧光显微镜;3）细胞培养器中的自动包涵物计数;4）AmyloFit中的数据拟合。与手动计数自由移动动物或保存图像中的内含物26相比，CellProfiler中的定量更快，更无偏。该协议的另一个关键进步是获取动力学数据，而不是单个时间点，这在将数据拟合到数学模型时为聚合机制提供了定量的见解。
该协议的四个元素可以用作独立的模块，可以根据应用程序进行修改。年龄同步的种群也可以使用5-氟-2′-脱氧尿苷（FUDR）对动物进行绝育。该化合物影响寿命和蛋白质平衡24，25 ，并且对实验者具有高度致癌性;但是，它排除了蠕虫的手动转移，当处理大量蠕虫时，这可能是劳动密集型的。其它替代方法是使用无菌突变体29 或过滤装置来分离后代30。
荧光显微镜步骤也可以调整，例如，使用更高的放大倍率来监测神经元中的蛋白质聚集。当条件之间的相对差异比包涵体的绝对数量更重要时，宽视场显微镜可能足以监测肌肉细胞中的polyQ聚集。在这些情况下，仍然可以使用CellProfiler管道，尽管识别蠕虫和内含物的设置需要由用户进行调整。该技术的通量目前受到需要手动将动物采摘到384孔板中的限制。这可以通过使用微流体装置16来潜在地补救。叠氮化钠是一种相对苛刻的麻醉剂，可以用水凝胶或珠子的物理固定代替28，29。
这里介绍的AmyloFit分析基于由单个细胞中独立成核事件组成的聚集机制。在这种模型不适合的情况下，用户应考虑诸如先前开发的协作聚合模型17的替代方法。这种方法的局限性在于，需要提供以不同浓度表达目标蛋白的菌株，尽管这些菌株可以使用常规 秀丽隐杆线虫 方法24生成。
总而言之，该协议提供了在 体内 模型系统中获取蛋白质聚集动力学的高质量数据的方法，允许对聚集机制17进行详细分析。尽管该方法已被证明可用于 秀丽隐杆线虫 肌肉组织中的polyQ聚集，但该方案的未来应用可能包括其他蛋白质和组织以及蛋白质平衡因子和小分子的作用。

错误折叠的蛋白质积累成不溶性沉积物发生在广泛的疾病中。众所周知的例子是阿尔茨海默病中淀粉样蛋白β和tau的聚集，帕金森病中的α突触核蛋白，以及亨廷顿舞蹈症中具有扩增polyQ的亨廷顿蛋白1，2。将这些多肽错误地折叠成淀粉样原纤维与毒性和细胞死亡有关，其机制在很大程度上尚不清楚。阐明淀粉样蛋白形成的机制对于开发目前尚不可用的有效疗法至关重要。
基于硫黄素T荧光测量 ，在体外 进行了淀粉样蛋白形成的详细研究，从而对聚集过程和抑制分子的作用进行了机械理解3，4，5。然而，目前尚不清楚相同的聚集机制是否适用于活细胞和生物体的复杂环境。线虫秀 丽隐杆线虫 是研究体内蛋白质聚集 的合适模式生物。它具有相对简单的解剖结构，但由多个组织组成，包括肌肉，肠道和神经系统。它具有良好的遗传特征，并且很容易获得用于遗传修饰的工具。此外，它的生成时间短至约3天，总寿命为2-3周。因此，可以在实验上方便的时间尺度上检查动物的整个生命周期中的蛋白质聚集。最后，线虫在光学上是透明的，能够追踪活体动物中荧光标记蛋白质的聚集。
秀丽隐杆线虫的这些特征以前已被用于研究polyQ蛋白的聚集，作为亨廷顿舞蹈症和其他polyQ扩增疾病的模型。高于35-40谷氨酰胺残基的致病阈值，可以观察到用黄色荧光蛋白（YFP）标记的polyQ蛋白在肌肉组织6，7，神经元8和肠道9，10中形成不溶性包涵体。这些特征已被广泛用于筛选基因11、12、13和小分子修饰因子14的蛋白质聚集和毒性。
秀丽隐杆线虫 有可能在弥合蛋白质聚集 的体外 研究与更复杂的疾病模型（如小鼠15）之间的差距方面发挥重要作用。 秀丽隐杆线虫 适合于药物筛选16 ，但也可以利用它来获得对蛋白质 在体内聚集的分子机制的基本理解，如最近证明的17所示。然而，对于这两种应用，提取定量和可重复的蛋白质聚集测量值至关重要。在这里，这是通过使用高通量共聚焦显微镜结合专用图像分析管道来实现的（图1）。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Black with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmyloFit</td>
			<td>Knowles lab</td>
			<td>v2.0</td>
			<td>Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line A</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1228</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line B</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1229</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line C</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1230</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line D</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1231</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>4.1.3</td>
			<td>Downloaded from https://cellprofiler.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>Open-source</td>
			<td>(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j</td>
			<td>Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-throughput confocal microscope</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager CV8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>&#160;17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>WU Mainz</td>
			<td>250</td>
			<td>To make worm pick, 150 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum iridium wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>39383</td>
			<td>To make worm pick, 0.25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein aggregation kinetics in vivo using automated inclusion counting in caenorhabditis elegans

蛋白质聚集成不溶性内含物是多种人类疾病的标志，其中许多疾病与年龄有关。线虫 秀丽隐杆线虫 是一种成熟的模式生物，已在该领域被广泛用于研究蛋白质聚集和毒性。其光学透明度能够通过荧光显微镜直接可视化蛋白质聚集。此外，快速的繁殖周期和较短的寿命使线虫成为筛选调节这一过程的基因和分子的合适模型。
然而，活体动物中聚集负荷的定量标准化较差，通常通过在荧光解剖显微镜下在单个时间点手动计数来进行包涵体计数。这种方法可能导致观察者之间的高度可变性，并限制对聚合过程的理解。相反，淀粉样蛋白样蛋白 在体外 聚集通过硫黄素T荧光以高度定量和时间分辨的方式常规监测。
在这里，提出了一种类似的方法，用于活 秀丽隐杆线虫聚集动力学的无偏分析，使用高通量共聚焦显微镜结合定制的图像分析和数据拟合。该方法的适用性通过监测体壁肌肉细胞中荧光标记的聚谷氨酰胺（polyQ）蛋白的包涵体形成来证明。图像分析工作流程允许确定不同时间点的内含物数量，这些夹杂物拟合到基于单个肌肉细胞中独立成核事件的数学模型中。这里描述的方法可能被证明有助于以稳健和定量的方式评估蛋白质平衡因子和潜在治疗活体动物蛋白质聚集疾病的影响。

这里描述的方法（图1）用于分析包含40个与YFP（Q40-YFP）融合的谷氨酰胺的结构的聚集动力学。该蛋白在 unc-54 启动子的控制下表达，驱动体壁肌肉细胞中的表达。由于它们相对较大且易于可视化，因此使用10x物镜足以解析Q40-YFP在该组织中形成的夹杂物。先前开发了四种菌株（系A-D），在不同程度上表达该蛋白以评估 体内17中polyQ聚集的浓度依赖性。
通过2 h产卵产生年龄同步的A-D系种群，然后在后代成年后每日转移。从成年期的第1天到第10天，使用高通量共聚焦显微镜在384孔板中对来自四个菌株中的每一个菌株的20只动物进行成像。井的图像被采集为6个图块，这些图块使用ImageJ21 中的插件拼接在一起（图2）。随后使用定制的CellProfiler22 管道（图3）分析拼接的图像，以量化每个菌株和时间点的每只动物的平均内含物数量。
然后将数据拟合到AmyloFit5中的数学模型（图4）。该模型基于以下假设：95个体壁肌肉细胞中的每一个都通过限速成核事件独立获得一个包涵体，然后快速聚集生长17。拟合得到的成核速率常数为9.9×105个分子M-2.1 d-1 cell-1，反应顺序为2.1，对应于在1 mM的细胞内蛋白浓度下0.38个分子d-1 cell-1的成核速率。两个独立的生物重复导致成核速率和反应顺序的紧密对应值，这与先前使用类似方案17的研究一致（表1）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig01v2.jpg"> （A）年龄同步的秀丽隐杆线虫种群是由定时产卵产生的。（B）在不同时间点的384孔板中对来自同一种群的动物进行成像。（C）将瓷砖缝合在一起以形成整个孔的图像，在CellProfiler中对其进行分析以量化每个动物的内含物数量。（D）使用AmyloFit将数据拟合到数学模型中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig02.jpg"> 图 2：使用插件 Grid/Collection 拼接在 ImageJ 中的拼接过程的屏幕截图21。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig03.jpg"> 图 3：用于量化内含物数量的 CellProfiler 流水线示意图。（A-C） 明场图像 （A） 用于识别蠕虫（B，C 中的特写）。（D-G）荧光图像（D，E中的特写）用于鉴定夹杂物（F）。蠕虫和内含物与提供孔中每个蠕虫的内含物数量相关（G）。显示的图像是成年期第3天的Q40线A动物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig04.jpg"> 图 4：将数据拟合到 AmyloFit 中的数学模型。 （A） 数据上传到 AmyloFit。（B）输入自定义方程以模拟包涵体的形成，假设每个细胞中独立的成核事件。（C）表达不同水平Q40-YFP的 秀丽隐杆线 A-D的聚集动力学拟合。这些数据代表了两个独立的生物重复。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>数据集 1</td>
			<td>数据集 2</td>
			<td>Sinnige et al.17
</td>
		</tr>
<tr>
<td>n</td>
			<td>2.1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>K细胞 （分子M-n d-1 细胞-1）</td>
			<td>约9.9 x 105
</td>
			<td>1.4 x 105
</td>
			<td>3.1 x 104
</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM时的成核速率（分子d-1 细胞-1）</td>
			<td>0.38</td>
			<td>0.21</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
</tbody></table>表1：Q40-YFP聚集体的成核速率和反应顺序值。 方案的两个独立生物重复的数据以及与先前发表的数据的比较17.

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Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

这里，提出了一种分析线虫 秀丽隐杆线虫中蛋白质聚集动力学的方法。来自年龄同步种群的动物在不同的时间点成像，然后在CellProfiler中进行半自动内含物计数，并拟合AmyloFit中的数学模型。

使用秀丽隐杆线虫中的自动包涵体计数监测体内蛋白质聚集动力学

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

到目前为止，蛋白质聚集的机制主要在体外进行了研究。使用我们的方案，我们可以在模式生物秀丽隐杆线虫中进行类似的定量研究。我们方法的主要优点是对夹杂物数量进行无偏量化。通过将这些高质量数据拟合到数学模型中，我们可以深入了解聚合机制。蛋白质聚集发生在许多疾病中，包括阿尔茨海默氏症和亨廷顿舞蹈症。了解蛋白质在体内聚集的分子机制对于开发新疗法至关重要。首先将10个成年线虫放在6厘米的染色NGM板上，用铂蚯蚓进行同步产卵。让成虫在20°C下产卵约两个小时，然后将其从盘子中取出。将装有卵的盘子放在20°C的孵化器中，监测动物的发育，直到它们在产卵后大约第三天成年。通过用100L M9缓冲液填充所需数量的孔来制备384孔板，并补充25mM叠氮化钠作为麻醉剂。每个菌株填充一个孔以进行成像。对于每种菌株，使用铂蚯蚓将20只动物转移到一个孔中。用盖子盖住板以防止蒸发，并在制备后一小时内对板进行成像。打开仪器，然后打开软件。单击“卸载孔板”旁边的“播放”按钮，然后将 384 孔板放入显微镜中。在“操作列表和 3D 荧光采集”下，单击“测试”，然后选择包含蠕虫的孔。将“图像处理”设置为“无”。然后单击“播放”按钮，确定蠕虫正确居中的最佳移动距离。将“上升距离”设置为 50 m，将“下降距离”设置为 50 m，将“切片间隔”设置为 2 m，以捕获 z 堆栈中动物的整个厚度。将“图像处理”设置回“最大值”。在孔板扫描设置下选择要成像的孔。然后选择“平铺”并获取整个井。保存测量设置。然后点击开始测量以开始实验。打开 CellProfiler 并将管道拖动到“将管道文件拖放到此处”窗口中。单击“是”加载项目。接下来，将拼接的图像拖到“将文件和文件夹拖放到此处”窗口中。单击元数据输入模块。调整正则表达式以根据拼接图像的名称从文件名中提取。单击“名称和类型”输入模块，然后调整“选择规则条件”以匹配文件名中的通道。然后，单击“输出设置”以选择一个文件夹以保存CellProfiler的输出。单击“启动测试模式”以使用第一个映像数据集检查管道的设置。单击“步骤”以一次运行一个模块，从而通过管道运行。要调整蠕虫轮廓，请单击“编辑对象手动”模块中的“显示帮助”以查看说明。更正轮廓。然后单击“完成”以继续运行管道。单击“退出测试模式”并分析图像。打开输出文件夹以查看输出文件。并打开带有原始文件名的图像，后跟轮廓，以检查蠕虫和内含物是否正确覆盖。要开始使用AmyloFit，请命名项目，然后单击“创建项目”。单击“打开”将其打开。并通过为其命名并单击“创建并加载会话”来创建会话。单击“添加数据”，然后按照左侧面板中显示的数据格式要求上传包含每只动物的平均内含物数量的文件。然后，单击“加载新数据”。将零点偏移的“平均点数”设置为 0，将“平稳点的平均值”设置为 0 以跳过包含计数数据不需要的预处理步骤。然后，单击“提交”。对每种蛋白质浓度重复此步骤。在“模型”面板中选择“自定义”。在“公式”框中输入独立成核的公式。然后单击加载模型。对于 Ncell，将参数类型设置为全局常量，并将 Value 设置为 95，对应于体壁肌肉细胞的数量。将 Kcell 和 n 的参数类型设置为全局拟合。并给常数为m。在左侧面板中输入不同菌株的 m 值。保持盆跃点数不变，然后单击“管接头”面板中的“适合”。最后，通过单击下载数据和拟合来提取拟合。在四种表达不同Q40浓度的秀丽隐杆线虫菌株中监测包涵体数量。独立成核模型很好地描述了聚集动力学。在细胞内蛋白浓度为1 mM的情况下，拟合产生2.1的反应顺序，每个细胞每天的成核速率为0.38个分子。在之前的一项研究中，两个独立的生物重复显示了反应顺序和成核速率的紧密对应值。应该记住的一件事是，您需要多个蛋白质浓度的高质量数据集才能获得可靠的拟合。这种方法可用于寻找干扰生物体中蛋白质聚集的方法，例如遗传敲低或小分子治疗。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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科研

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