Name: monitoring protein aggregation kinetics in vivo using automated inclusion counting in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Nous remercions le laboratoire Morimoto pour les souches de C. elegans et Esmeralda Bosman pour son aide sur le microscope confocal à haut débit. Ce travail a été financé par une subvention de démarrage de l’Université d’Utrecht à T.S.

1. Croissance d’une population de C. elegans synchronisée selon l’âge
<ol><li>Maintenir les souches de C. elegans sur des plaques de milieu de croissance des nématodes (NGM) ensemencées avec Escherichia coli OP50 à 20 °C selon les procédures standard18.</li>
	<li>Effectuez une ponte synchronisée en plaçant 10 nématodes adultes sur une plaque NGM ensemencée de 6 cm avec un pic de ver de platine. Laissez les adultes pondre les œufs pendant environ 2 h à 20 °C avant de les retirer. Préparez 1 à 4 plaques par souche, en fonction de la fertilité de la souche et du nombre de points de temps à prendre.</li>
	<li>Placer les assiettes avec les œufs dans l’incubateur à 20 °C. Surveillez le développement des animaux jusqu’à ce qu’ils atteignent l’âge adulte. REMARQUE: Le jour où les animaux ont atteint l’âge adulte est défini ici comme le jour 1. En règle générale, c’est trois jours après la ponte.</li>
	<li>À partir du jour 1, transférez quotidiennement les animaux sur de nouvelles plaques de NGM ensemencées pour les séparer de leur progéniture. Pour compenser les animaux qui meurent ou sont perdus pendant le transfert, transférez environ 40 animaux par souche multiplié par le nombre de points à imager (voir étape 2). Continuez jusqu’à ce que les animaux aient cessé de pondre des œufs fécondés (~ jour 6 de l’âge adulte). REMARQUE: Exclure les animaux avec ensachage ou d’autres phénotypes de développement. L’ensachage est couramment observé dans les souches exprimant des protéines sujettes à l’agrégation.</li>
</ol>2. Préparation de l’échantillon de C. elegans dans une plaque multipuits
REMARQUE: Comme la procédure d’imagerie nécessite des anesthésiques qui finiront par tuer les animaux, les mêmes animaux ne peuvent pas être réutilisés pour les points temporels ultérieurs. Au lieu de cela, différents animaux du même lot synchronisé avec l’âge sont imagés à des jours différents. Même si la plupart des souches auront peu d’inclusions au jour 1, il est recommandé d’inclure ce point de temps comme point de référence.
<ol><li>Préparer la plaque de 384 puits en remplissant le nombre requis de puits avec 100 μL de tampon M9 complété par 25 mM de NaN3 comme anesthésique. Remplissez un puits par souche pour être imagé. REMARQUE: L’azoture de sodium (NaN3) est toxique et doit être manipulé avec soin.</li>
	<li>Pour chaque souche, transférez 20 animaux dans un puits à l’aide d’un pic à ver de platine. REMARQUE: Les vers doivent être placés à l’extérieur de la pelouse bactérienne avant de les placer dans le puits. Les bactéries font adhérer les animaux au pic à vers, ce qui peut empêcher leur libération et obscurcir le contenu du puits. Généralement, 20 est le nombre optimal d’animaux par puits pour éviter le chevauchement entre les vers tout en limitant l’imagerie inutile de l’espace vide du puits.</li>
	<li>Couvrez la plaque avec le couvercle pour éviter l’évaporation et imagez la plaque dans les 1 h suivant la préparation.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.1 à 2.3 tous les jours jusqu’à ce qu’un plateau stable dans le nombre d’inclusion soit atteint ou jusqu’à ce que la plupart des animaux soient morts. Effectuez la préparation de l’échantillon et l’imagerie à la même heure tous les jours pour assurer des intervalles de 24 heures.</li>
</ol>3. Acquisition d’images sur le microscope confocal à haut débit
REMARQUE: Cette expérience peut également être mise en place sur un microscope confocal à disque rotatif ordinaire avec un support de plaque multipuit. Une caméra avec un grand champ de vision est bénéfique pour limiter le nombre de tuiles à imager pour couvrir l’ensemble du puits. Voir la Table des matériaux pour plus de détails sur le microscope et les logiciels utilisés dans ce protocole.
<ol><li>Allumez l’instrument et ouvrez le logiciel.</li>
	<li>Démarrez un nouveau protocole en accédant à Paramètres de mesure | Nouveau. Sélectionnez le type de plaque multipuit approprié et cliquez sur Créer un nouveau paramètre de mesure.</li>
	<li>Configurez le canal pour la fluorescence en allant à Ch 1. Définissez l’objectif sur 10x. Sélectionnez 488 nm comme source lumineuse et BP525/25 comme filtre d’émission pour imageR YFP. Définissez le binning sur 2x2 pour réduire la taille du fichier.</li>
	<li>Cliquez sur Ajouter une couche et sélectionnez Brightfield comme méthode.</li>
	<li>Pour ajouter une image de fluorescence confocale z-stack à la mesure, choisissez Acquisition de fluorescence 3D sous Liste d’actions. Allez dans Sélectionner et choisissez Ch 1. Pour réduire la taille des fichiers, définissez Traitement d’image sur Maximum afin que l’image de projection maximale soit enregistrée plutôt que la pile z complète.</li>
	<li>Cliquez sur bf/ph acquisition | Sélectionnez | Ch 2 pour le canal en champ lumineux.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton de lecture (recherchez le symbole du triangle pointant vers la droite) à côté de Décharger les plaques de puits et placez la plaque de 384 puits dans le microscope.</li>
	<li>Sous Acquisition de fluorescence 3D, cliquez sur Tester et sélectionnez un puits contenant des vers pour déterminer la distance de déplacement optimale à laquelle les vers sont centrés correctement. Réglez la distance ascendante sur 50 μm, la distance descendante sur -50 μm et l’intervalle de tranchage sur 2 μm pour capturer toute l’épaisseur des animaux dans la pile z.</li>
	<li>Optimisez le temps d’exposition pour obtenir une bonne intensité de signal pour les quatre souches tout en évitant la saturation. Utilisez le même temps d’exposition pour toutes les souches et tous les points temporels.</li>
	<li>Sélectionnez les puits à imager sous Paramètre de balayage de la plaque de puits. Sélectionnez Tile et Acquire Whole Well.</li>
	<li>Enregistrez le paramètre de mesure et démarrez l’expérience en cliquant sur Démarrer la mesure. Pour les points temporels suivants, ouvrez le même paramètre de mesure et ajustez la distance de déplacement et les puits à imager.</li>
</ol>4. Assemblage d’images en mosaïque dans ImageJ
REMARQUE : cette étape n’est requise que lors de l’utilisation d’un objectif supérieur à 4x, pour lequel l’image de chaque puits est acquise sous forme de plusieurs tuiles. Dans ce workflow d’analyse, l’assemblage des tuiles est effectué à l’aide du logiciel gratuit FIJI/ImageJ19 (Figure 2). Selon l’instrument utilisé à l’étape 3, il peut également être possible d’effectuer des coutures directement dans le logiciel d’accompagnement.
<ol><li>Téléchargez FIJI20 et ouvrez-le.</li>
	<li>Aller à Plugins | | de couture Couture de grille/collection21.</li>
	<li>Dans la fenêtre contextuelle, Grille/Assemblage de collection, sélectionnez le type et l’ordre dans lesquels les vignettes ont été collectées. Choisissez Grille : ligne par ligne et Droite et bas.</li>
	<li>Dans la fenêtre suivante, Assemblage de grille : Grille : ligne par ligne, droite et bas, insérez le nombre de tuiles dans les directions x et y. Pour l’objectif 10x utilisé ici, choisissez 2 comme taille de grille x, 3 comme taille de grille y et 0 comme chevauchement de tuiles.</li>
	<li>Cliquez sur Parcourir et sélectionnez le dossier contenant les images TIFF à assembler.</li>
	<li>Insérez le nom de fichier commun sous Noms de fichiers pour les vignettes, en utilisant {i} à la position du numéro de vignette dans chaque nom de fichier.</li>
	<li>Décochez toutes les cases ci-dessous.</li>
	<li>Exécutez le plugin.</li>
	<li>Enregistrez les images résultantes en tant que fichiers TIFF pour analyse à l’étape suivante.</li>
</ol>5. Comptage automatisé des inclusions à l’aide de CellProfiler22
<ol><li>Téléchargez et installez le logiciel d’analyse d’images open source, CellProfiler23. Téléchargez le pipeline InclusionCounting.cpproj à partir de github.com/sinnigelab/aggregate-quantification.</li>
	<li>Ouvrez CellProfiler et faites glisser le pipeline dans la fenêtre Déposer un fichier de pipeline ici. Cliquez sur Oui pour charger le projet.</li>
	<li>Cliquez sur le module de saisie Images et faites glisser les images assemblées dans la fenêtre Déposer les fichiers et le dossier ici.</li>
	<li>Cliquez sur le module de saisie de métadonnées . Ajustez l’expression régulière pour extraire du nom de fichier en fonction des noms des images assemblées.</li>
	<li>Cliquez sur le module de saisie NamesandTypes et ajustez Sélectionnez les critères de règle pour qu’ils correspondent aux canaux dans les noms de fichiers. REMARQUE : Dans les paramètres par défaut du pipeline, les noms de fichiers contenant BF sont reconnus comme des images en champ clair et sont nommés Worms. Les noms de fichiers contenant YFP sont reconnus comme des images de fluorescence et sont nommés Fluorescence.</li>
	<li>Cliquez sur Afficher les paramètres de sortie pour sélectionner un dossier par défaut afin d’enregistrer la sortie de CellProfiler.</li>
	<li>Cliquez sur Démarrer le mode test pour vérifier les paramètres du pipeline à l’aide du premier jeu de données d’imagerie. Cliquez sur Exécuter pour parcourir tous les modules du pipeline ou sur Étape pour parcourir le pipeline un module à la fois. Pour ajuster les contours du ver dans le module EditObjectsManually , cliquez sur Aide pour voir les instructions et cliquez sur Terminé pour continuer à exécuter le pipeline. REMARQUE : Les mesures extraites ne seront pas exportées en mode test. Les paramètres de seuil pour détecter les vers et les inclusions peuvent devoir être ajustés en fonction des déformations et du grossissement utilisés.</li>
	<li>Cliquez sur Quitter le mode test et analyser les images.</li>
	<li>Ouvrez le dossier de sortie pour afficher les fichiers de sortie. Ouvrez les images avec le nom de fichier d’origine suivi des contours pour vérifier si les vers et les inclusions ont été correctement superposés. Remarque : Le nombre d’inclusions par ver peut être trouvé dans le fichier nommé ExpandedWormObjects. Vous trouverez plus d’informations sur les images d’entrée dans le fichier nommé Image. Une sortie supplémentaire peut être sélectionnée dans le module ExportToSpreadsheet du pipeline.</li>
</ol>6. Ajustement global des données de comptage d’inclusion à l’aide d’AmyloFit5
REMARQUE: Cette étape ne peut être effectuée que lorsque des données pour plusieurs concentrations de protéines sont disponibles. Pour Q40-YFP, un ensemble de quatre souches avec différents niveaux de surexpression dans les cellules musculaires de la paroi du corps a été créé précédemment17. Dans d’autres cas, de nouvelles souches doivent être générées à l’aide de la micro-injection de plasmides et de l’intégration génomique24.
<ol><li>Rendez-vous sur la plateforme d’ajustement en ligne gratuite pour la cinétique d’agrégation AmyloFit25. Inscrivez-vous ou connectez-vous avec un compte existant. REMARQUE: Un manuel complet sur la façon d’utiliser AmyloFit peut être consulté pour obtenir de l’aide supplémentaire. Voir le lien en haut à gauche de la page Web (après la connexion) pour plus d’informations.</li>
	<li>Pour commencer à utiliser AmyloFit, nommez le projet et cliquez sur Créer un projet. Ouvrez le projet en cliquant sur Ouvrir et créez une session en lui donnant un nom et en cliquant sur Créer et charger une session.</li>
	<li>Cliquez sur Ajouter des données et téléchargez le fichier contenant le nombre moyen d’inclusions par animal, en suivant les exigences de format de données indiquées dans le panneau de gauche. Cliquez sur Charger de nouvelles données.</li>
	<li>Ignorez les étapes de prétraitement, qui ne sont pas requises pour les données de comptage d’inclusion, en définissant le nombre de points à dépasser en moyenne pour le décalage de zéro point et le nombre de points à faire la moyenne pour le plateau à 0. Cliquez sur Envoyer. Répétez cette étape pour chaque concentration de protéines (c.-à-d. chaque colonne du fichier téléchargé).</li>
	<li>Sélectionnez Personnalisé dans le panneau du modèle, entrez Ncells*(1-exp(-Kcell*m**(n)*(t-1))) dans la zone d’équation et cliquez sur Charger le modèle. REMARQUE: Comme AmyloFit a été conçu à l’origine pour l’analyse des données cinétiques des essais in vitro, un modèle sur mesure doit être chargé pour analyser les données de nombre d’inclusion de C. elegans. Dans l’équation utilisée ici, lescellules N sont le nombre de cellules dans lesquelles la formation d’inclusion a lieu, la cellule K est la constante du taux de nucléation, m la concentration en protéines intracellulaires et n l’ordre de réaction de la nucléation.</li>
	<li>Définissez les types de paramètres sur Global Const pour Ncellules, Global fit pour Kcell et n, et Const pour m. Définissez la valeur des cellules N sur 95 pour les cellules musculaires de la paroi corporelle et la supposition initiale pour la cellule K et n sur 1. Entrez les valeurs de m pour les différentes souches dans le panneau de gauche. REMARQUE: Les suppositions initiales ne sont pas pertinentes pour le modèle relativement simple utilisé ici. Pour les modèles plus complexes, il est avantageux d’entrer une estimation des valeurs attendues pour raccourcir le temps de calcul.</li>
	<li>Laissez le nombre de sauts de bassin inchangé et cliquez sur Ajuster dans le panneau de raccord.</li>
	<li>Extrayez l’ajustement en cliquant sur Télécharger les données et Ajuster. REMARQUE : Les paramètres extraits par l’ajustement global du modèle seront répertoriés dans le coin inférieur droit. Un tracé des données et de l’ajustement sera automatiquement généré dans le panneau supérieur droit. Ce tracé peut être extrait en cliquant sur Télécharger le pdf et personnalisé en allant dans Afficher les options du tracé. Lacellule K a des unités de molécules concentration-n temps-1 cellule-1. Pour comparer les valeurs avec différents n, la cellule K peut être convertie en taux de nucléation à une concentration de protéine donnée en la multipliant par mn.</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

La méthode présentée ici facilite une analyse quantitative et impartiale de la cinétique d’agrégation des protéines dans l’organisme modèle C. elegans. Elle dépend de quatre éléments clés (figure 1) : 1) le maintien d’une population de nématodes synchronisée selon l’âge; 2) microscopie à fluorescence dans des plaques multipuits; 3) comptage automatisé des inclusions dans CellProfiler; 4) l’ajustement des données dans AmyloFit. Par rapport au comptage manuel des inclusions chez les animaux en mouvement libre ou à partir d’images enregistrées26, la quantification dans CellProfiler est à la fois plus rapide et plus impartiale. L’autre avancée clé du protocole est l’acquisition de données cinétiques, plutôt que de points temporels uniques, qui fournit des informations quantitatives sur le mécanisme d’agrégation lors de l’ajustement des données à un modèle mathématique.
Les quatre éléments du protocole peuvent être utilisés comme des modules indépendants qui peuvent être modifiés en fonction de l’application. Les populations synchronisées selon l’âge peuvent également être maintenues en utilisant la 5-fluoro-2′-désoxyuridine (FUDR) pour stériliser les animaux. Ce composé affecte la durée de vie et la protéostasie24,25 et est hautement cancérogène pour l’expérimentateur; cependant, il empêche le transfert manuel des vers, ce qui peut être laborieux lorsque de grands nombres sont manipulés. D’autres alternatives sont l’utilisation de mutants stériles29 ou de dispositifs de filtration pour séparer la progéniture30.
L’étape de microscopie à fluorescence peut également être ajustée, par exemple, en utilisant des grossissements plus élevés pour surveiller l’agrégation des protéines dans les neurones. La microscopie à grand champ peut être suffisante pour surveiller l’agrégation de polyQ dans les cellules musculaires lorsque la différence relative entre les conditions est plus importante que le nombre absolu d’inclusions. Le pipeline CellProfiler peut toujours être utilisé dans ces cas, bien que les paramètres de reconnaissance des vers et des inclusions devront être ajustés par l’utilisateur. Le débit de la technique est actuellement limité par la nécessité de cueillir manuellement les animaux dans la plaque de 384 puits. Cela peut potentiellement être résolu par l’utilisation de dispositifs microfluidiques16. L’azoture de sodium est un anesthésique relativement dur, qui pourrait être remplacé par une immobilisation physique avec des hydrogels ou des perles28,29.
L’analyse d’AmyloFit présentée ici est basée sur un mécanisme d’agrégation constitué d’événements de nucléation indépendants dans des cellules individuelles. Dans les cas où ce modèle ne convient pas, l’utilisateur devrait envisager une alternative telle que le modèle d’agrégation coopérative développé précédemment17. Une limite de cette approche est que des souches exprimant la protéine d’intérêt à différentes concentrations doivent être disponibles, bien que celles-ci puissent être générées à l’aide des méthodes de routine de C. elegans 24.
Dans l’ensemble, ce protocole fournit les moyens d’obtenir des données de haute qualité pour la cinétique d’agrégation des protéines dans un système de modèle in vivo , permettant une analyse détaillée des mécanismes d’agrégation17. Bien que la méthode ait été démontrée pour l’agrégation de polyQ dans le tissu musculaire de C. elegans , les applications futures du protocole pourraient inclure d’autres protéines et tissus et les effets des facteurs de protéostasie et des petites molécules.

L’accumulation de protéines mal repliées dans des dépôts insolubles se produit dans un large éventail de maladies. Des exemples bien connus sont l’agrégation de β amyloïde et de tau dans la maladie d’Alzheimer, la α-synucléine dans la maladie de Parkinson et la huntingtine avec polyQ expansé dans la maladie de Huntington 1,2. Le mauvais repliement de ces polypeptides en fibrilles amyloïdes est associé à la toxicité et à la mort cellulaire par des mécanismes encore largement flous. L’élucidation des mécanismes de formation de l’amyloïde sera cruciale pour développer des thérapies efficaces, qui ne sont actuellement pas disponibles.
Des études détaillées de la formation d’amyloïde ont été réalisées in vitro sur la base de mesures de fluorescence de la thioflavine T, conduisant à une compréhension mécaniste du processus d’agrégation et de l’effet des molécules inhibitrices 3,4,5. Cependant, il n’est pas clair si les mêmes mécanismes d’agrégation sont vrais dans l’environnement complexe des cellules et des organismes vivants. Le ver nématode Caenorhabditis elegans est un organisme modèle approprié pour étudier l’agrégation des protéines in vivo. Il a une anatomie relativement simple mais se compose de plusieurs tissus, y compris le muscle, l’intestin et un système nerveux. Il est génétiquement bien caractérisé et des outils de modification génétique sont facilement disponibles. En outre, il a un temps de génération court d’environ 3 jours et une durée de vie totale de 2-3 semaines. En tant que tel, l’agrégation des protéines peut être examinée tout au long de la durée de vie de l’animal sur une échelle de temps expérimentalement pratique. Enfin, le nématode est optiquement transparent, ce qui permet de suivre l’agrégation de protéines marquées par fluorescence chez les animaux vivants.
Ces caractéristiques de C. elegans ont déjà été exploitées pour étudier l’agrégation des protéines polyQ en tant que modèle pour la maladie de Huntington et d’autres maladies d’expansion polyQ. Au-dessus du seuil pathogène de 35 à 40 résidus de glutamine, on peut observer les protéines polyQ marquées avec une protéine fluorescente jaune (YFP) pour former des inclusions insolubles dans le tissu musculaire 6,7, les neurones8 et l’intestin 9,10. Ces caractéristiques ont été largement utilisées pour dépister les gènes 11,12,13 et les modificateurs de petites molécules 14 de l’agrégation et de la toxicité des protéines.
C. elegans a le potentiel de jouer un rôle important pour combler le fossé entre les études in vitro de l’agrégation des protéines et des modèles de maladies plus complexes tels que les souris15. C. elegans se prête au dépistagede médicaments 16 mais peut également être exploité pour obtenir une compréhension fondamentale des mécanismes moléculaires de l’agrégation des protéines in vivo, comme démontré récemment17. Cependant, pour les deux applications, il est d’une importance primordiale d’extraire une mesure quantitative et reproductible de l’agrégation des protéines. Ici, ceci est réalisé avec l’utilisation d’un microscope confocal à haut débit combiné à un pipeline d’analyse d’image dédié (Figure 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Black with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmyloFit</td>
			<td>Knowles lab</td>
			<td>v2.0</td>
			<td>Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line A</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1228</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line B</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1229</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line C</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1230</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line D</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1231</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>4.1.3</td>
			<td>Downloaded from https://cellprofiler.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>Open-source</td>
			<td>(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j</td>
			<td>Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-throughput confocal microscope</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager CV8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>&#160;17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>WU Mainz</td>
			<td>250</td>
			<td>To make worm pick, 150 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum iridium wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>39383</td>
			<td>To make worm pick, 0.25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein aggregation kinetics in vivo using automated inclusion counting in caenorhabditis elegans

L’agrégation des protéines en inclusions insolubles est une caractéristique d’une variété de maladies humaines, dont beaucoup sont liées à l’âge. Le nématode Caenorhabditis elegans est un organisme modèle bien établi qui a été largement utilisé sur le terrain pour étudier l’agrégation et la toxicité des protéines. Sa transparence optique permet la visualisation directe de l’agrégation des protéines par microscopie à fluorescence. De plus, le cycle de reproduction rapide et la courte durée de vie font du nématode un modèle approprié pour dépister les gènes et les molécules qui modulent ce processus.
Cependant, la quantification de la charge globale chez les animaux vivants est mal standardisée, généralement effectuée par comptage manuel de l’inclusion sous un microscope à dissection de fluorescence à un seul moment. Cette approche peut entraîner une grande variabilité entre les observateurs et limiter la compréhension du processus d’agrégation. En revanche, l’agrégation de protéines de type amyloïde in vitro est systématiquement surveillée par fluorescence T de thioflavine de manière très quantitative et résolue dans le temps.
Ici, une méthode analogue est présentée pour l’analyse impartiale de la cinétique d’agrégation chez C. elegans vivant, en utilisant un microscope confocal à haut débit combiné à une analyse d’image et à un ajustement de données sur mesure. L’applicabilité de cette méthode est démontrée par la surveillance de la formation d’inclusion d’une protéine de polyglutamine (polyQ) marquée par fluorescence dans les cellules musculaires de la paroi corporelle. Le flux de travail d’analyse d’images permet de déterminer le nombre d’inclusions à différents moments, qui sont adaptés à un modèle mathématique basé sur des événements de nucléation indépendants dans des cellules musculaires individuelles. La méthode décrite ici peut s’avérer utile pour évaluer les effets des facteurs de protéostasie et des thérapies potentielles pour les maladies d’agrégation des protéines chez un animal vivant de manière robuste et quantitative.

La méthode décrite ici (Figure 1) a été utilisée pour analyser la cinétique d’agrégation d’une construction comprenant 40 glutamines fusionnées à YFP (Q40-YFP). La protéine est exprimée sous le contrôle du promoteur unc-54 , qui stimule l’expression dans les cellules musculaires de la paroi du corps. Comme ceux-ci sont relativement grands et faciles à visualiser, l’utilisation d’un objectif 10x est suffisante pour résoudre les inclusions formées par Q40-YFP dans ce tissu. Quatre souches (lignées A-D) ont déjà été développées exprimant la protéine à des degrés différents pour évaluer la concentration-dépendance de l’agrégation polyQ in vivo17.
Des populations synchronisées selon l’âge des lignées A-D ont été générées par une ponte de 2 h, suivie d’un transfert quotidien une fois que la progéniture a atteint l’âge adulte. Du jour 1 au jour 10 de l’âge adulte, 20 animaux de chacune des quatre souches ont été photographiés dans une plaque de 384 puits, à l’aide d’un microscope confocal à haut débit. Les images des puits ont été acquises sous la forme de 6 tuiles, qui ont été assemblées à l’aide d’un plugin dans ImageJ21 (Figure 2). Les images assemblées ont ensuite été analysées à l’aide d’un pipeline CellProfiler22 sur mesure (Figure 3) pour quantifier le nombre moyen d’inclusion par animal pour chaque souche et chaque point temporel.
Les données ont ensuite été ajustées à un modèle mathématique dans AmyloFit5 (Figure 4). Le modèle est basé sur l’hypothèse que chacune des 95 cellules musculaires de la paroi corporelle acquiert indépendamment une inclusion par un événement de nucléation limitant le taux, suivi d’une croissance agrégée rapide17. L’ajustement a donné une constante de vitesse de nucléation de 9,9 × 105 molécules M-2,1 d-1 cellule-1 et un ordre de réaction de 2,1, correspondant à un taux de nucléation de 0,38 molécules d-1 cellule-1 à une concentration de protéines intracellulaires de 1 mM. Deux répliques biologiques indépendantes ont conduit à des valeurs étroitement correspondantes pour la vitesse de nucléation et l’ordre de réaction, qui sont en accord avec une étude précédente utilisant un protocole similaire17 (tableau 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig01v2.jpg"> Figure 1: Vue d’ensemble schématique de la méthode. (A) Les populations de C. elegans synchronisées avec l’âge sont générées par une ponte chronométrée. (B) Les animaux de la même population sont photographiés dans une plaque de 384 puits à différents moments. (C) Les tuiles sont cousues ensemble pour former des images de l’ensemble des puits, qui sont analysées dans CellProfiler pour quantifier les nombres d’inclusion par animal. (D) Les données sont ajustées à un modèle mathématique à l’aide d’AmyloFit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig02.jpg"> Figure 2 : Captures d’écran de la procédure d’assemblage dans ImageJ à l’aide du plugin Grid/Collection stitching21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig03.jpg"> Figure 3 : Schéma du pipeline CellProfiler pour quantifier les nombres d’inclusions. (A-C) L’image en champ clair (A) est utilisée pour identifier les vers (B, gros plan en C). (D-G) L’image de fluorescence (D, gros plan en E) est utilisée pour identifier les inclusions (F). Les vers et les inclusions sont liés pour fournir le nombre d’inclusions pour chaque ver dans le puits (G). Les images montrées sont celles d’animaux de la ligne A Q40 au jour 3 de l’âge adulte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig04.jpg"> Figure 4 : Ajustement des données à un modèle mathématique dans AmyloFit. (A) Les données sont téléchargées sur AmyloFit. (B) Une équation personnalisée est entrée pour modéliser la formation d’inclusion, en supposant des événements de nucléation indépendants dans chaque cellule. (C) Ajustement de la cinétique d’agrégation pour les raies A-D de C. elegans exprimant différents niveaux de Q40-YFP. Les données sont représentatives de deux répliques biologiques indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Ensemble de données 1</td>
			<td>Ensemble de données 2</td>
			<td>Sinnige et coll.17
</td>
		</tr>
<tr>
<td>n</td>
			<td>2.1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cellule K (molécules M-n d-1 cell-1)</td>
			<td>9,9 x 105
</td>
			<td>1,4 x 105
</td>
			<td>3,1 x 104
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taux de nucléation à 1 mM (molécules d-1 cellule-1)</td>
			<td>0.38</td>
			<td>0.21</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Valeurs de la vitesse de nucléation et de l’ordre de réaction de l’agrégation Q40-YFP. Données pour deux répliques biologiques indépendantes du protocole et comparaison avec les données précédemment publiées17.

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Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Ici, une méthode est présentée pour l’analyse de la cinétique d’agrégation des protéines chez le nématode Caenorhabditis elegans. Les animaux d’une population synchronisée selon l’âge sont photographiés à différents moments, suivis d’un comptage semi-automatisé des inclusions dans CellProfiler et d’un ajustement à un modèle mathématique dans AmyloFit.

Surveillance de la cinétique d’agrégation des protéines in vivo à l’aide du comptage automatisé de l’inclusion chez Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Les mécanismes d’agrégation des protéines ont jusqu’à présent été étudiés principalement in vitro. Avec notre protocole, nous pouvons faire des études quantitatives similaires dans l’organisme modèle C.elegans. Le principal avantage de notre méthode est la quantification impartiale des nombres d’inclusion.Et en adaptant ces données de haute qualité à des modèles mathématiques, nous pouvons obtenir des informations sur le mécanisme d’agrégation. L’agrégation des protéines se produit dans de nombreuses maladies, y compris la maladie d’Alzheimer et la maladie de Huntington. Comprendre le mécanisme moléculaire de l’agrégation des protéines in vivo est crucial pour développer de nouvelles thérapies.Commencez par placer 10 nématodes adultes sur une plaque NGM ensemencée de 6 cm avec un pic de ver de platine pour effectuer une ponte synchronisée. Laissez les adultes pondre les œufs pendant environ deux heures à 20 ° C avant de les retirer de l’assiette. Placez les assiettes avec les œufs dans l’incubateur à 20 ° C.Surveillez le développement des animaux jusqu’à ce qu’ils atteignent l’âge adulte environ le troisième jour après la ponte.Préparer la plaque de 384 puits en remplissant le nombre requis de puits avec 100 L de tampon M9 complété par 25 mM d’azoture de sodium comme anesthésique. Remplissez un puits par souche pour être imagé. Pour chaque souche, transférez 20 animaux dans un puits à l’aide d’un pic à ver de platine.Couvrez la plaque avec le couvercle jusqu’à l’évaporation préventive et imagez la plaque dans l’heure qui suit la préparation. Allumez l’instrument et ouvrez le logiciel. Cliquez sur le bouton Lecture à côté de Décharger les plaques de puits et placez la plaque de 384 puits dans le microscope.Sous Liste d’actions et acquisition de fluorescence 3D, cliquez sur Tester, puis sélectionnez le puits contenant les vers. Définissez Traitement d’image sur Aucun. Et cliquez sur le bouton Lecture pour déterminer la distance de déplacement optimale à laquelle les vers sont correctement centrés.Réglez la distance ascendante sur 50 m, la distance descendante sur 50 m et l’intervalle de tranchage sur 2 m pour capturer toute l’épaisseur des animaux dans la pile z. Redéfinissez le traitement d’image sur Maximum. Sélectionnez les puits à imager sous Paramètre de balayage de la plaque de puits.Et puis sélectionnez Tile et Acquire Whole Well. Enregistrez le paramètre de mesure. Et cliquez sur Démarrer la mesure pour démarrer l’expérience.Ouvrez CellProfiler et faites glisser le pipeline dans la fenêtre Déposer un fichier de pipeline ici. Cliquez sur Oui pour charger le projet. Ensuite, faites glisser les images assemblées dans la fenêtre Déposer les fichiers et le dossier ici.Cliquez sur le module de saisie de métadonnées. Ajustez l’expression régulière pour extraire du nom de fichier en fonction des noms des images assemblées. Cliquez sur le module de saisie NamesAndTypes et ajustez Sélectionnez les critères de règle pour qu’ils correspondent aux canaux dans les noms de fichiers.Ensuite, cliquez sur Paramètres de sortie pour sélectionner un dossier pour enregistrer la sortie de CellProfiler. Cliquez sur Démarrer le mode test pour vérifier les paramètres du pipeline à l’aide du premier ensemble de données d’imagerie. Cliquez sur Étape pour parcourir le pipeline, un module à la fois.Pour ajuster les contours du ver, cliquez sur Afficher l’aide dans le module EditObjectsManually pour voir les instructions. Corrigez les contours. Et puis cliquez sur Terminé pour continuer à exécuter le pipeline.Cliquez sur Quitter le mode test et analyser les images. Ouvrez le dossier de sortie pour afficher les fichiers de sortie. Et ouvrez les images avec le nom de fichier d’origine suivi des contours pour vérifier si les vers et les inclusions ont été correctement superposés.Pour commencer à utiliser AmyloFit, nommez le projet et cliquez sur Créer un projet. Cliquez sur Ouvrir pour l’ouvrir. Et créez une session en lui donnant un nom et en cliquant sur Créer et charger une session.Cliquez sur Ajouter des données et téléchargez le fichier contenant le nombre moyen d’inclusions par animal, en suivant les exigences de format de données indiquées dans le panneau de gauche. Ensuite, cliquez sur Charger de nouvelles données. Définissez Nombre de points à dépasser pour le décalage du point zéro sur 0 et Nombre de points à faire la moyenne sur le plateau à 0 pour ignorer les étapes de prétraitement, qui ne sont pas requises pour les données de comptage d’inclusion.Ensuite, cliquez sur Soumettre. Répétez cette étape pour chaque concentration de protéines. Sélectionnez Personnalisé dans le panneau Modèle.Entrez l’équation de nucléation indépendante dans la zone Équation. Et cliquez sur Charger le modèle. Pour Ncells, définissez le type de paramètre sur Global Constant et définissez Value sur 95, correspondant au nombre de cellules musculaires de la paroi du corps.Définissez les types de paramètres sur Global fit pour Kcell et n. Et à Constant pour m. Entrez les valeurs de m pour les différentes souches dans le panneau de gauche.Laissez le nombre de sauts de bassin inchangé, puis cliquez sur Ajuster dans le panneau Raccord. Enfin, extrayez l’ajustement en cliquant sur Télécharger les données et Ajuster. Les nombres d’inclusion ont été surveillés dans quatre souches de C.elegans exprimant différentes concentrations de Q40.Le modèle de nucléation indépendant décrit bien la cinétique d’agrégation. L’ajustement a donné un ordre de réaction de 2,1 et un taux de nucléation de 0,38 molécule par jour et par cellule à une concentration de protéines intracellulaires de 1 mM. Deux répliques biologiques indépendantes dans une étude précédente ont montré des valeurs étroitement correspondantes pour l’ordre de réaction et la vitesse de nucléation.Une chose à garder à l’esprit est que vous avez besoin d’ensembles de données de haute qualité pour plusieurs concentrations de protéines afin d’obtenir des ajustements fiables. Cette méthode peut être utilisée pour trouver des moyens d’interférer avec l’agrégation des protéines dans un organisme vivant, comme les knockdowns génétiques ou les traitements de petites molécules.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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