Name: monitoring protein aggregation kinetics in vivo using automated inclusion counting in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Duration: 6 min 49 s
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हम उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर सहायता के लिए सी एलिगन्स उपभेदों और एस्मेराल्डा बोसमैन के लिए मोरिमोतो प्रयोगशाला को धन्यवाद देते हैं। इस काम को यूट्रेक्ट विश्वविद्यालय से टीएस को स्टार्ट-अप अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

<ol>
	<li>Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+state+and+its+association+with+protein+misfolding+diseases.">The amyloid state and its association with protein misfolding diseases.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).</li><li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+amyloid+formation,+and+human+disease:+a+summary+of+progress+over+the+last+decade.">Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: a summary of progress over the last decade.</a> Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).</li><li>Knowles, T. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analytical+solution+to+the+kinetics+of+breakable+filament+assembly.">An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly.</a> Science. 326 (5959), 1533-1537 (2009).</li><li>Cohen, S. I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+amyloid-&#946;42+aggregates+occurs+through+a+secondary+nucleation+mechanism.">Proliferation of amyloid-&#946;42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9758-9763 (2013).</li><li>Meisl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+protein+aggregation+from+global+fitting+of+kinetic+models.">Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models.</a> Nature Protocols. 11 (2), 252-272 (2016).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+proteins+at+the+pathogenic+threshold+display+neuron-specific+aggregation+in+a+pan-neuronal+Caenorhabditis+elegans+model.">Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model.</a> Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Prahlad, V., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+regulates+the+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+misfolded+proteins.">Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14204-14209 (2011).</li><li>Nollen, E. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screening+strategy+identifies+novel+regulators+of+the+proteostasis+network.">A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network.</a> PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).</li><li>Brehme, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperome+subnetwork+safeguards+proteostasis+in+aging+and+neurodegenerative+disease.">A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease.</a> Cell Reports. 9, 1-16 (2014).</li><li>Calamini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+proteostasis+regulators+for+protein+conformational+diseases.">Small-molecule proteostasis regulators for protein conformational diseases.</a> Nature Chemical Biology. 8 (2), 185-196 (2012).</li><li>Sinnige, T., Stroobants, K., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+studies+of+protein+misfolding+and+aggregation+in+in+vivo+models+of+Alzheimer's+and+Parkinson's+diseases.">Biophysical studies of protein misfolding and aggregation in in vivo models of Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 49, 22 (2020).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model.">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7, 13023 (2016).</li><li>Sinnige, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+reveals+that+independent+nucleation+events+determine+the+progression+of+polyglutamine+aggregation+in+C.+elegans.">Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 202188118 (2021).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans.">Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>. FIJI/ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/downloads">https://imagej.net/downloads</a> (2012)</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions.">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li><li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+free,+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis.">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> BioTechniques. 42 (1), 71-75 (2007).</li><li>CellProfiler. Broad Institute Available from: <a target="_blank" href="https://cellprofiler.org/releases">https://cellprofiler.org/releases</a> (2021)</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>. Knowles group, University of Cambridge Available from: <a target="_blank" href="https://amylofit.com/amylofitmain/login/">https://amylofit.com/amylofitmain/login/</a> (2021)</li><li>Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+tissue-specific+proteostatic+decline+in+Caenorhabditis+elegans.">Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), (2021).</li><li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset.">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).</li><li>Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+enhances+the+heat+shock+response+and+decreases+polyglutamine+aggregation+in+an+HSF-1-dependent+manner+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 141-142, 1-4 (2014).</li><li>David, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+protein+aggregation+as+an+inherent+part+of+aging+in+C.+elegans.">Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans.</a> PLoS Biology. 8 (8), 47-48 (2010).</li><li>Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+sieve:+A+low-tech+instrument+and+methodology+for+sorting+small+multicellular+organisms.">Caenorhabditis sieve: A low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).</li><li>Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours.">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73 (2018).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+and+long-term+immobilization+in+a+hydrogel-microbead+matrix+for+high-resolution+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+and+other+small+organisms.">Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms.</a> PLoS One. 13 (3), 0193989 (2018).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

यहां प्रस्तुत विधि मॉडल जीव सी एलिगन्स में प्रोटीन एकत्रीकरण कैनेटीक्स के एक निष्पक्ष और मात्रात्मक विश्लेषण की सुविधा प्रदान करती है। यह चार प्रमुख तत्वों (चित्रा 1) पर निर्भर करता है: 1) नेमाटोड की एक आयु-सिंक्रनाइज़ आबादी को बनाए रखना; 2) मल्टीवेल प्लेटों में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी; 3) CellProfiler में स्वचालित समावेशन गिनती; 4) AmyloFit में डेटा फिटिंग. स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों में या सहेजी गई छवियों से समावेशन की मैनुअल गिनती की तुलना में26, CellProfiler में परिमाणीकरण तेज और अधिक निष्पक्ष दोनों है। प्रोटोकॉल की अन्य महत्वपूर्ण प्रगति एकल टाइमपॉइंट्स के बजाय गतिज डेटा का अधिग्रहण है, जो डेटा को गणितीय मॉडल में फिट करने पर एकत्रीकरण तंत्र में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
प्रोटोकॉल के चार तत्वों को स्वतंत्र मॉड्यूल के रूप में उपयोग किया जा सकता है जिसे एप्लिकेशन के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। आयु-सिंक्रनाइज़ आबादी को जानवरों को निष्फल करने के लिए 5-फ्लोरो-2'-डीऑक्सीयूरिडीन (एफयूडीआर) का उपयोग करके भी बनाए रखा जा सकता है। यह यौगिक जीवनकाल और प्रोटियोस्टैसिस24,25 को प्रभावित करता है और प्रयोगकर्ता के लिए अत्यधिक कार्सिनोजेनिक है; हालांकि, यह कीड़े के मैनुअल हस्तांतरण को रोकता है, जो बड़ी संख्या में नियंत्रित होने पर श्रम-गहन हो सकता है। अन्य विकल्प संतानों को अलग करने के लिए बाँझ उत्परिवर्ती29 या निस्पंदन उपकरणों का उपयोग कर रहे हैं30.
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी चरण को भी समायोजित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स में प्रोटीन एकत्रीकरण की निगरानी के लिए उच्च आवर्धन का उपयोग करना। वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी मांसपेशियों की कोशिकाओं में पॉलीक्यू एकत्रीकरण की निगरानी करने के लिए पर्याप्त हो सकती है जब स्थितियों के बीच सापेक्ष अंतर समावेशन की पूर्ण संख्या की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण होता है। CellProfiler पाइपलाइन का उपयोग अभी भी इन मामलों में किया जा सकता है, हालांकि कीड़े और समावेशन को पहचानने के लिए सेटिंग्स को उपयोगकर्ता द्वारा समायोजित करने की आवश्यकता होगी। तकनीक का थ्रूपुट वर्तमान में 384-अच्छी तरह से प्लेट में जानवरों के मैन्युअल पिकिंग की आवश्यकता से सीमित है। यह संभावित रूप से माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के उपयोग से ठीक किया जा सकताहै 16। सोडियम एज़ाइड एक अपेक्षाकृत कठोर संवेदनाहारी है, जिसे हाइड्रोजेल या मोतियों28,29 के साथ भौतिक स्थिरीकरण द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
यहां प्रस्तुत एमाइलोफिट में विश्लेषण एक एकत्रीकरण तंत्र पर आधारित है जिसमें व्यक्तिगत कोशिकाओं में स्वतंत्र न्यूक्लिएशन की घटनाएं शामिल हैं। उन मामलों में जहां यह मॉडल फिट नहीं होता है, उपयोगकर्ता को एक विकल्प पर विचार करना चाहिए जैसे कि सहकारी एकत्रीकरण मॉडल पहलेसे विकसित 17। इस दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि विभिन्न सांद्रता में ब्याज के प्रोटीन को व्यक्त करने वाले उपभेदों को उपलब्ध होने की आवश्यकता होती है, हालांकि इन्हें नियमित सी एलिगेंस विधियों का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकताहै।
कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल एक इन विवो मॉडल सिस्टम में प्रोटीन एकत्रीकरण कैनेटीक्स के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने का साधन प्रदान करता है, जिससे एकत्रीकरण तंत्र 17 के विस्तृत विश्लेषण की अनुमतिमिलती है। यद्यपि विधि को C. elegans मांसपेशी ऊतक में polyQ एकत्रीकरण के लिए प्रदर्शित किया गया था, प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों में अन्य प्रोटीन और ऊतक और प्रोटियोस्टैसिस कारकों और छोटे अणुओं के प्रभाव शामिल हो सकते हैं।

अघुलनशील जमा में misfolded प्रोटीन का संचय रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में होता है। प्रसिद्ध उदाहरण अल्जाइमर रोग में एमिलॉइड-β और ताऊ का एकत्रीकरण, पार्किंसंस रोग में α-सिन्यूक्लिन, और हंटिंगटन रोग 1,2 में विस्तारित पॉलीक्यू के साथ हंटिंगटिन हैं। अमाइलॉइड फाइब्रिल में इन पॉलीपेप्टाइड्स की मिसफोल्डिंग विषाक्तता और कोशिका मृत्यु से तंत्र से जुड़ी हुई है जो अभी भी काफी हद तक अस्पष्ट हैं। एमाइलॉइड गठन के तंत्र को स्पष्ट करना प्रभावी उपचार विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण होगा, जो वर्तमान में अनुपलब्ध हैं।
एमाइलॉइड गठन की विस्तृत जांच इन विट्रो में थायोफ्लेविन टी प्रतिदीप्ति माप के आधार पर की गई है, जिससे एकत्रीकरण प्रक्रिया की यांत्रिक समझ और निरोधात्मक अणुओंके प्रभाव 3,4,5 हो गए हैं। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या एक ही एकत्रीकरण तंत्र जीवित कोशिकाओं और जीवों के जटिल वातावरण में सच है। सूत्रकृमि कृमि Caenorhabditis elegans विवो में प्रोटीन एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल जीव है। इसमें एक अपेक्षाकृत सरल शरीर रचना विज्ञान है, लेकिन इसमें मांसपेशियों, आंत और तंत्रिका तंत्र सहित कई ऊतक होते हैं। यह आनुवंशिक रूप से अच्छी तरह से विशेषता है, और आनुवंशिक संशोधन के लिए उपकरण आसानी से उपलब्ध हैं। इसके अलावा, इसमें ~ 3 दिनों की एक छोटी पीढ़ी का समय और 2-3 सप्ताह का कुल जीवनकाल है। इस प्रकार, प्रोटीन एकत्रीकरण की जांच प्रयोगात्मक रूप से सुविधाजनक टाइमस्केल पर जानवर के जीवनकाल में की जा सकती है। अंत में, सूत्रकृमि ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी है, जो जीवित जानवरों में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन के एकत्रीकरण की ट्रैकिंग को सक्षम करता है।
C. elegans की इन विशेषताओं को पहले हंटिंगटन और अन्य पॉलीक्यू विस्तार रोगों के लिए एक मॉडल के रूप में पॉलीक्यू प्रोटीन के एकत्रीकरण की जांच करने के लिए शोषण किया गया है। 35-40 ग्लूटामाइन अवशेषों की रोगजनक सीमा के ऊपर, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) के साथ लेबल किए गए पॉलीक्यू प्रोटीन को मांसपेशियों केऊतकों में अघुलनशील समावेशन बनाने के लिए देखा जा सकता है 6,7, न्यूरॉन्स8, और आंत 9,10। इन विशेषताओं का व्यापक रूप से जीन11,12,13 और प्रोटीन एकत्रीकरण और विषाक्तता के छोटे-अणु संशोधक14 के लिए स्क्रीन करने के लिए उपयोग किया गया है।
C. elegans में प्रोटीन एकत्रीकरण के इन विट्रो अध्ययनों और चूहों जैसे चूहोंके 15 जैसे अधिक जटिल रोग मॉडल के बीच के अंतर को पाटने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की क्षमता है। C. elegans दवा स्क्रीनिंग16 के लिए उपयुक्त है, लेकिन विवो में प्रोटीन एकत्रीकरण के आणविक तंत्र की मौलिक समझ प्राप्त करने के लिए भी शोषण किया जा सकता है, जैसा कि हाल ही मेंप्रदर्शित किया गया है 17। हालांकि, दोनों अनुप्रयोगों के लिए, प्रोटीन एकत्रीकरण के मात्रात्मक और पुन: प्रस्तुत करने योग्य उपाय निकालने के लिए यह प्रमुख महत्व का है। यहां, यह एक समर्पित छवि विश्लेषण पाइपलाइन (चित्रा 1) के साथ संयुक्त एक उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग के साथ प्राप्त किया जाता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Black with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmyloFit</td>
			<td>Knowles lab</td>
			<td>v2.0</td>
			<td>Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line A</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1228</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line B</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1229</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line C</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1230</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line D</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1231</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>4.1.3</td>
			<td>Downloaded from https://cellprofiler.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>Open-source</td>
			<td>(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j</td>
			<td>Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-throughput confocal microscope</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager CV8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>&#160;17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>WU Mainz</td>
			<td>250</td>
			<td>To make worm pick, 150 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum iridium wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>39383</td>
			<td>To make worm pick, 0.25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein aggregation kinetics in vivo using automated inclusion counting in caenorhabditis elegans

अघुलनशील समावेशन में प्रोटीन एकत्रीकरण विभिन्न प्रकार के मानव रोगों की पहचान है, जिनमें से कई उम्र से संबंधित हैं। सूत्रकृमि Caenorhabditis elegans एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल जीव है कि व्यापक रूप से प्रोटीन एकत्रीकरण और विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया है। इसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन एकत्रीकरण के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाती है। इसके अलावा, तेजी से प्रजनन चक्र और कम जीवनकाल नेमाटोड को जीन और अणुओं के लिए स्क्रीन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल बनाते हैं जो इस प्रक्रिया को संशोधित करते हैं।
हालांकि, जीवित जानवरों में कुल भार का परिमाणीकरण खराब मानकीकृत होता है, आमतौर पर एक ही समय बिंदु पर प्रतिदीप्ति विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत मैन्युअल समावेशन गिनती द्वारा किया जाता है। इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप पर्यवेक्षकों के बीच उच्च परिवर्तनशीलता हो सकती है और एकत्रीकरण प्रक्रिया की समझ को सीमित कर सकती है। इसके विपरीत, विट्रो में अमाइलॉइड-जैसे प्रोटीन एकत्रीकरण को नियमित रूप से थायोफ्लेविन टी प्रतिदीप्ति द्वारा अत्यधिक मात्रात्मक और समय-हल किए गए फैशन में निगरानी की जाती है।
यहां, एक अनुरूप विधि जीवित सी एलिगन्स में एकत्रीकरण कैनेटीक्स के निष्पक्ष विश्लेषण के लिए प्रस्तुत की गई है, जो कस्टम-निर्मित छवि विश्लेषण और डेटा फिटिंग के साथ संयुक्त एक उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करती है। इस विधि की प्रयोज्यता को शरीर की दीवार की मांसपेशियों की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले पॉलीग्लूटामाइन (पॉलीक्यू) प्रोटीन के समावेश गठन की निगरानी करके प्रदर्शित किया जाता है। छवि विश्लेषण वर्कफ़्लो विभिन्न टाइमपॉइंट्स पर समावेशन की संख्या के निर्धारण की अनुमति देता है, जो व्यक्तिगत मांसपेशी कोशिकाओं में स्वतंत्र न्यूक्लिएशन घटनाओं के आधार पर गणितीय मॉडल में फिट होते हैं। यहां वर्णित विधि एक मजबूत और मात्रात्मक तरीके से एक जीवित जानवर में प्रोटीन एकत्रीकरण रोगों के लिए प्रोटियोस्टैसिस कारकों और संभावित चिकित्सीय के प्रभावों का आकलन करने के लिए उपयोगी साबित हो सकती है।

यहां वर्णित विधि (चित्रा 1) का उपयोग एक निर्माण के एकत्रीकरण कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए किया गया था जिसमें वाईएफपी (Q40-YFP) से जुड़े 40 ग्लूटामाइन शामिल थे। प्रोटीन को UNC-54 प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किया जाता है, जो शरीर की दीवार की मांसपेशियों की कोशिकाओं में अभिव्यक्ति को चलाता है। चूंकि ये अपेक्षाकृत बड़े और कल्पना करने में आसान हैं, इसलिए इस ऊतक में Q40-YFP द्वारा गठित समावेशन को हल करने के लिए 10x उद्देश्य का उपयोग पर्याप्त है। चार उपभेदों (लाइनों ए-डी) को पहले विवो17 में पॉलीक्यू एकत्रीकरण की एकाग्रता-निर्भरता का आकलन करने के लिए प्रोटीन को अलग-अलग हद तक व्यक्त करने के लिए विकसित किया गया था।
ए-डी लाइनों की आयु-सिंक्रनाइज़ आबादी 2 एच अंडे-ले द्वारा उत्पन्न की गई थी, जिसके बाद संतान वयस्कता तक पहुंचने के बाद दैनिक हस्तांतरण हुआ। वयस्कता के दिन 1 से 10 तक, चार उपभेदों में से प्रत्येक से 20 जानवरों को एक उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 384-अच्छी तरह से प्लेट में चित्रित किया गया था। कुओं की छवियों को 6 टाइलों के रूप में अधिग्रहित किया गया था, जिन्हें इमेजजे21 (चित्रा 2) में एक प्लगइन का उपयोग करके एक साथ सिला गया था। सिले हुए चित्रों को बाद में प्रत्येक तनाव और समय बिंदु के लिए प्रति जानवर औसत समावेशन संख्या को मापने के लिए एक कस्टम-निर्मित CellProfiler22 पाइपलाइन (चित्रा 3) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था।
डेटा को तब एमिलोफिट5 (चित्रा 4) में एक गणितीय मॉडल में फिट किया गया था। मॉडल इस धारणा पर आधारित है कि 95 शरीर की दीवार मांसपेशी कोशिकाओं में से प्रत्येक स्वतंत्र रूप से एक दर-सीमित न्यूक्लिएशन घटना द्वारा एक समावेश प्राप्त करता है, जिसके बाद तेजी से कुल वृद्धि17 होती है। फिट ने 9.9 × 105 अणुओं एम -2.1 डी -1 सेल -1 और 2.1 का प्रतिक्रिया क्रम का एक न्यूक्लिएशन दर स्थिरांक प्राप्त किया, जो 1 एमएम की इंट्रासेल्युलर प्रोटीन एकाग्रता पर 0.38 अणुओं डी -1 सेल -1 की न्यूक्लिएशन दर के अनुरूप है। दो स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों ने न्यूक्लिएशन दर और प्रतिक्रिया क्रम के लिए निकटता से संबंधित मूल्यों का नेतृत्व किया, जो एक समान प्रोटोकॉल17 (तालिका 1) का उपयोग करके पिछले अध्ययन के साथ समझौते में हैं।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig01v2.jpg"> चित्र 1: विधि का योजनाबद्ध अवलोकन। (A) आयु-सिंक्रनाइज़ C. elegans आबादी एक समयबद्ध अंडे-ले द्वारा उत्पन्न होती है। (बी) एक ही आबादी के जानवरों को अलग-अलग समय बिंदुओं पर 384-अच्छी तरह से प्लेट में चित्रित किया जाता है। (सी) टाइलों को पूरे कुओं की छवियों को बनाने के लिए एक साथ सिला जाता है, जिसका विश्लेषण सेलप्रोफाइलर में प्रति जानवर शामिल करने की संख्या को मापने के लिए किया जाता है। (डी) डेटा को एमिलोफिट का उपयोग करके गणितीय मॉडल में फिट किया जाता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig01largev2.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig02.jpg"> चित्र 2: प्लगइन ग्रिड/ संग्रह सिलाई21 का उपयोग कर ImageJ में सिलाई प्रक्रिया के स्क्रीनशॉट. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig03.jpg"> चित्र 3: समावेशन संख्याओं को मापने के लिए CellProfiler पाइपलाइन की योजनाबद्ध। (A-C) ब्राइटफील्ड छवि (A) का उपयोग कीड़े (B, C में क्लोज़-अप) की पहचान करने के लिए किया जाता है। (D-G) प्रतिदीप्ति छवि (डी, ई में क्लोज-अप) का उपयोग समावेशन (एफ) की पहचान करने के लिए किया जाता है। कीड़े और समावेशन कुएं (जी) में प्रत्येक कीड़े के लिए समावेशन की संख्या प्रदान करने से संबंधित हैं। दिखाई गई छवियां Q40 लाइन की हैं वयस्कता के दिन 3 पर एक जानवर। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig04.jpg"> चित्रा 4: एमाइलोफिट में एक गणितीय मॉडल के लिए डेटा को फिट करना। (ए) डेटा एमाइलोफिट पर अपलोड किए गए हैं। (बी) एक कस्टम समीकरण को मॉडल समावेशन गठन के लिए दर्ज किया जाता है, प्रत्येक सेल में स्वतंत्र न्यूक्लिएशन घटनाओं को मानते हुए। (C) C. elegans लाइनों A-D के लिए एकत्रीकरण कैनेटीक्स की फिटिंग Q40-YFP के विभिन्न स्तरों को व्यक्त करती है। डेटा दो स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों के प्रतिनिधि हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>डेटासेट 1</td>
			<td>डेटासेट 2</td>
			<td>Sinnige et al.17
</td>
		</tr>
<tr>
<td>n</td>
			<td>2.1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kसेल (अणु M-n d-1 सेल-1)</td>
			<td>9.9 x 105
</td>
			<td>1.4 x 105
</td>
			<td>3.1 x 104
</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM पर न्यूक्लिएशन दर (अणु d-1 सेल-1)</td>
			<td>0.38</td>
			<td>0.21</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: न्यूक्लिएशन दर और Q40-YFP एकत्रीकरण के प्रतिक्रिया क्रम के मान। प्रोटोकॉल के दो स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों के लिए डेटा और पहले प्रकाशित डेटा17 के साथ तुलना।

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Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

यहां, नेमाटोड केनोरहाब्डिटिस एलिगेंस में प्रोटीन एकत्रीकरण कैनेटीक्स के विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत की गई है। एक उम्र सिंक्रनाइज़ आबादी से जानवरों को अलग-अलग समय बिंदुओं पर चित्रित किया जाता है, इसके बाद सेलप्रोफाइलर में अर्ध-स्वचालित समावेशन गिनती और एमिलोफिट में एक गणितीय मॉडल के लिए फिटिंग होती है।

निगरानी प्रोटीन एकत्रीकरण कैनेटीक्स विवो में स्वचालित शामिल Caenorhabditis elegans में गिनती का उपयोग कर

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

प्रोटीन एकत्रीकरण के तंत्र की अब तक ज्यादातर इन विट्रो में जांच की गई है। हमारे प्रोटोकॉल के साथ हम मॉडल जीव C.elegans में इसी तरह के मात्रात्मक अध्ययन कर सकते हैं। हमारी विधि का मुख्य लाभ शामिल संख्याओं का निष्पक्ष परिमाणीकरण है।और गणितीय मॉडल के लिए इन उच्च गुणवत्ता वाले डेटा को फिट करके, हम एकत्रीकरण तंत्र में अंतर्दृष्टि प्राप्त कर सकते हैं। प्रोटीन एकत्रीकरण अल्जाइमर और हंटिंगटन सहित कई बीमारियों में होता है। विवो में प्रोटीन एकत्रीकरण के आणविक तंत्र को समझना नए उपचारों को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।एक सिंक्रनाइज़ अंडे-ले प्रदर्शन करने के लिए प्लैटिनम कृमि पिक के साथ एक 6 सेमी बीज वाले एनजीएम प्लेट पर 10 वयस्क नेमाटोड रखकर शुरू करें। वयस्कों को प्लेट से हटाने से पहले 20 सी पर लगभग दो घंटे के लिए अंडे देने के लिए छोड़ दें। इनक्यूबेटर में अंडे के साथ प्लेटों को 20 C.Monitor पर रखें जानवरों के विकास की निगरानी करें जब तक कि वे अंडे देने के बाद लगभग तीसरे दिन वयस्कता तक नहीं पहुंच जाते।एक संवेदनाहारी के रूप में 25 mM सोडियम azide के साथ पूरक M9 बफर के 100 L के साथ कुओं की आवश्यक संख्या को भरने के द्वारा 384-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें। छविबनाने के लिए प्रति तनाव एक अच्छी तरह से भरें। प्रत्येक तनाव के लिए, प्लैटिनम कृमि पिक का उपयोग करके 20 जानवरों को एक अच्छी तरह से स्थानांतरित करें।निवारक वाष्पीकरण के लिए ढक्कन के साथ प्लेट को कवर करें, और तैयारी के बाद एक घंटे के भीतर प्लेट की छवि बनाएं। उपकरण पर स्विच करें, और सॉफ़्टवेयर खोलें। अनलोड वेल प्लेट्स के बगल में प्ले बटन पर क्लिक करें, और माइक्रोस्कोप में 384-वेल प्लेट रखें।के अंतर्गत कार्रवाई सूची और 3D प्रतिदीप्ति अधिग्रहण, क्लिक करेंपरीक्षण, और अच्छी तरह से युक्त कीड़े का चयन करें। छवि संसाधन को कोई नहीं पर सेट करें. और इष्टतम स्थानांतरण दूरी निर्धारित करने के लिए प्ले बटन पर क्लिक करें जिस पर कीड़े सही ढंग से केंद्रित हैं।आरोही दूरी को 50 मीटर पर सेट करें, अवरोही दूरी को 50 मीटर तक, और स्लाइसिंग अंतराल को 2 मीटर तक सेट करें ताकि जेड-स्टैक में जानवरों की पूरी मोटाई पर कब्जा किया जा सके। छवि संसाधन को वापस अधिकतम पर सेट करें. वेल प्लेट स्कैन सेटिंग के तहत इमेज किए जाने वाले कुओं का चयन करें।और फिर टाइल का चयन करें और पूरे अच्छी तरह से प्राप्त करें। माप सेटिंग सहेजें. और प्रयोग प्रारंभ करने के लिए मापन प्रारंभ करें क्लिक करें.CellProfiler खोलें और पाइपलाइन को यहाँ कोई पाइपलाइन फ़ाइल ड्रॉप विंडो में खींचें। प्रोजेक्ट लोड करने के लिए हाँ क्लिक करें. अगला, सिले हुए छवियों को ड्रॉप फ़ाइलों और फ़ोल्डर में खींचें यहाँ विंडो।मेटाडेटा इनपुट मॉड्यूल पर क्लिक करें। सिले हुए चित्रों के नामों के अनुसार फ़ाइल नाम से निकालने के लिए नियमित अभिव्यक्ति समायोजित करें. NamesAndTypes इनपुट मॉड्यूल पर क्लिक करें, और समायोजित करें फ़ाइल नामों में चैनलों से मेल खाने के लिए नियम मानदंड का चयन करें।उसके बाद, CellProfiler से आउटपुट को सहेजने के लिए किसी फ़ोल्डर का चयन करने के लिए आउटपुट सेटिंग्स पर क्लिक करें। पहले इमेजिंग डेटा सेट का उपयोग करके पाइपलाइन की सेटिंग्स की जांच करने के लिए स्टार्ट टेस्ट मोड पर क्लिक करें। पाइपलाइन के माध्यम से चलाने के लिए चरण पर क्लिक करें, एक समय में एक मॉड्यूल।वर्म बाह्यरेखाओं को समायोजित करने के लिए, निर्देशों को देखने के लिए EditObjectsManually मॉड्यूल में मदद दिखाएँ पर क्लिक करें. बाह्यरेखाओं को सही करें. और फिर पाइपलाइन चलाना जारी रखने के लिए Done पर क्लिक करें।Exit Test Mode और Analyze Images पर क्लिक करें। आउटपुट फ़ाइलों को देखने के लिए आउटपुट फ़ोल्डर खोलें। और मूल फ़ाइल नाम के साथ छवियों को खोलें, इसके बाद रूपरेखा के बाद यह जांचने के लिए कि कीड़े और समावेशन को सही ढंग से ओवरलेड किया गया था या नहीं।AmyloFit का उपयोग शुरू करने के लिए, प्रोजेक्ट का नाम दें और प्रोजेक्ट बनाएँ पर क्लिक करें। इसे खोलने के लिए Open पर क्लिक करें। और इसे एक नाम देकर और बनाएँ और लोड सत्र पर क्लिक करके एक सत्र बनाएँ।डेटा जोड़ें पर क्लिक करें, और बाएं पैनल में दिखाए गए डेटा प्रारूप आवश्यकताओं का पालन करते हुए, प्रति जानवर समावेशन की औसत संख्या वाली फ़ाइल अपलोड करें। फिर नया डेटा लोड करें पर क्लिक करें। शून्य-बिंदु ऑफ़सेट के लिए औसत से अधिक बिंदुओं की संख्या 0 पर सेट करें, और पूर्व-प्रसंस्करण चरणों को छोड़ने के लिए पठार के लिए औसत से अधिक करने के लिए बिंदुओं की संख्या सेट करें, जो समावेशन गणना डेटा के लिए आवश्यक नहीं हैं.इसके बाद Submit पर क्लिक करें। प्रत्येक प्रोटीन एकाग्रता के लिए इस चरण को दोहराएं। मॉडल पैनल में कस्टम का चयन करें।समीकरण बॉक्स में स्वतंत्र न्यूक्लिएशन के लिए समीकरण दर्ज करें। और लोड मॉडलक्लिक करें। Ncells के लिए, पैरामीटर प्रकार को वैश्विक स्थिरांक पर सेट करें, और शरीर की दीवार मांसपेशी कोशिकाओं की संख्या के अनुरूप 95 पर मान सेट करें।Kcell और n के लिए वैश्विक फ़िट करने के लिए पैरामीटर प्रकार सेट करें। और एम के लिए स्थिरांक के लिए। बाएं पैनल में विभिन्न उपभेदों के लिए m के मान दर्ज करें.बेसिन हॉप्स की संख्या को अपरिवर्तित छोड़ दें, और फिटिंग पैनल में फ़िट करें क्लिक करें. अंत में, डाउनलोड डेटा और फ़िट पर क्लिक करके फ़िट निकालें. शामिल करने की संख्या को चार C.elegans उपभेदों में विभिन्न Q40 सांद्रता को व्यक्त करने में निगरानी की गई थी।स्वतंत्र न्यूक्लिएशन मॉडल एकत्रीकरण कैनेटीक्स का अच्छी तरह से वर्णन करता है। फिट ने 2.1 का एक प्रतिक्रिया क्रम प्राप्त किया, और 1 mM की इंट्रासेल्युलर प्रोटीन एकाग्रता पर प्रति दिन प्रति सेल 0.38 अणुओं की न्यूक्लिएशन दर प्राप्त की। पिछले अध्ययन में दो स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों ने प्रतिक्रिया क्रम और न्यूक्लिएशन दर के लिए बारीकी से संबंधित मूल्यों को दिखाया।एक बात जिसे ध्यान में रखा जाना चाहिए वह यह है कि आपको विश्वसनीय फिट प्राप्त करने के लिए कई प्रोटीन सांद्रता के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटा सेट की आवश्यकता होती है। इस विधि का उपयोग एक जीवित जीव में प्रोटीन एकत्रीकरण में हस्तक्षेप करने के तरीकों को खोजने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि आनुवंशिक नॉकडाउन या छोटे अणु उपचार।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

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