Name: monitoring protein aggregation kinetics in vivo using automated inclusion counting in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Duration: 6 min 49 s
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Ringraziamo il laboratorio Morimoto per i ceppi di C. elegans ed Esmeralda Bosman per l'assistenza sul microscopio confocale ad alto rendimento. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione di start-up dell'Università di Utrecht a T.S.

1. Crescita di una popolazione di C. elegans sincronizzata con l'età
<ol><li>Mantenere i ceppi di C. elegans su piastre di terreno di crescita dei nematodi (NGM) seminate con Escherichia coli OP50 a 20 °C secondo le procedure standard18.</li>
	<li>Esegui una deposizione sincronizzata delle uova posizionando 10 nematodi adulti su una piastra NGM seminata di 6 cm con un piccone di verme di platino. Lasciare che gli adulti depongano le uova per ~2 h a 20 °C prima di rimuoverle. Preparare 1-4 piastre per ceppo, a seconda della fertilità del ceppo e del numero di punti temporali da assumere.</li>
	<li>Posizionare le piastre con le uova nell'incubatrice a 20 °C. Monitorare lo sviluppo degli animali fino a quando non raggiungono l'età adulta. NOTA: Il giorno in cui gli animali hanno raggiunto l'età adulta è definito qui come giorno 1. In genere, questo è tre giorni dopo la deposizione delle uova.</li>
	<li>A partire dal giorno 1, trasferire gli animali su nuove piastre NGM seminate ogni giorno per separarli dalla loro prole. Per compensare gli animali che muoiono o vengono persi durante il trasferimento, trasferire ~ 40 animali per ceppo per il numero di punti da visualizzare (vedere il passaggio 2). Procedere fino a quando gli animali non hanno cessato di deporre le uova fecondate (~ giorno 6 dell'età adulta). NOTA: Escludere animali con insaccamento o altri fenotipi dello sviluppo. Il sacchetto è comunemente osservato in ceppi che esprimono proteine inclini all'aggregazione.</li>
</ol>2. Preparazione del campione di C. elegans in una piastra multiwell
NOTA: poiché la procedura di imaging richiede anestetici che alla fine uccideranno gli animali, gli stessi animali non possono essere riutilizzati per i punti temporali successivi. Invece, animali diversi dello stesso lotto sincronizzato con l'età vengono ripresi in giorni diversi. Anche se la maggior parte dei ceppi avrà poche inclusioni al giorno 1, si consiglia di includere questo punto temporale come linea di base.
<ol><li>Preparare la piastra da 384 pozzetti riempiendo il numero richiesto di pozzetti con 100 μL di tampone M9 integrato con 25 mM NaN3 come anestetico. Riempi un pozzetto per ceppo da fotografare. NOTA: l'azide di sodio (NaN3) è tossico e deve essere maneggiato con cura.</li>
	<li>Per ogni ceppo, trasferire 20 animali in un pozzo utilizzando un plettro di verme di platino. NOTA: I vermi devono essere posizionati all'esterno del prato batterico prima di metterli nel pozzo. I batteri fanno aderire gli animali al piccone del verme, che può impedire il loro rilascio e offuscare il contenuto del pozzo. Generalmente, 20 è il numero ottimale di animali per pozzo per evitare sovrapposizioni tra i vermi limitando al contempo l'imaging non necessario dello spazio vuoto del pozzo.</li>
	<li>Coprire la piastra con il coperchio per evitare l'evaporazione e visualizzare la piastra entro 1 ora dalla preparazione.</li>
	<li>Ripeti i passaggi 2.1-2.3 al giorno fino a raggiungere un plateau costante nei numeri di inclusione o fino a quando la maggior parte degli animali non è morta. Eseguire la preparazione del campione e l'imaging alla stessa ora ogni giorno per garantire intervalli di 24 ore.</li>
</ol>3. Acquisizione di immagini sul microscopio confocale ad alta produttività
NOTA: Questo esperimento può anche essere impostato su un normale microscopio confocale a disco rotante con un supporto per piastre multiwell. Una fotocamera con un ampio campo visivo è utile per limitare il numero di tessere necessarie per essere fotografate per coprire l'intero pozzo. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sul microscopio e sul software utilizzato in questo protocollo.
<ol><li>Accendere lo strumento e aprire il software.</li>
	<li>Avviare un nuovo protocollo accedendo a Impostazioni di misurazione | Nuovo. Selezionare il tipo di piastra multiwell corretto e fare clic su Crea una nuova impostazione di misurazione.</li>
	<li>Impostare il canale per la fluorescenza andando a Ch 1. Impostare l'obiettivo su 10x. Selezionare 488 nm come sorgente luminosa e BP525/25 come filtro di emissione per l'immagine YFP. Impostare il binning su 2x2 per ridurre le dimensioni del file.</li>
	<li>Fare clic su Aggiungi canale e selezionare Brightfield come metodo.</li>
	<li>Per aggiungere un'immagine di fluorescenza confocale z-stack alla misurazione, scegliere Acquisizione fluorescenza 3D in Elenco azioni. Vai a Seleziona e scegli Ch 1. Per ridurre al minimo le dimensioni dei file, impostate Elaborazione immagini su Massimo in modo che venga salvata l'immagine di proiezione massima anziché lo stack z completo.</li>
	<li>Fare clic su BF/Ph Acquisition | Seleziona | Ch 2 per il canale brightfield.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante di riproduzione (cercare il simbolo del triangolo rivolto a destra) accanto a Scarica piastre del pozzo e posizionare la piastra a 384 pozzetti nel microscopio.</li>
	<li>In Acquisizione fluorescenza 3D, fare clic su Test e selezionare un pozzo contenente worm per determinare la distanza di spostamento ottimale alla quale i worm sono centrati correttamente. Impostare Distanza ascendente a 50 μm, Distanza discendente a -50 μm e Intervallo di taglio a 2 μm per catturare l'intero spessore degli animali nella pila z.</li>
	<li>Ottimizza il tempo di esposizione per ottenere una buona intensità del segnale per tutti e quattro i ceppi evitando la saturazione. Utilizzare lo stesso tempo di esposizione per tutti i ceppi e i punti temporali.</li>
	<li>Selezionare i pozzetti da visualizzare in Impostazione scansione piastra pozzo. Seleziona Riquadro e Acquisisci pozzo intero.</li>
	<li>Salvare l'impostazione di misurazione e avviare l'esperimento facendo clic su Avvia misurazione. Per i punti temporali successivi, aprire la stessa impostazione di misurazione e regolare la distanza di spostamento e i pozzetti da visualizzare.</li>
</ol>4. Cucitura di immagini affiancate in ImageJ
NOTA: questo passaggio è necessario solo quando si utilizza un obiettivo più grande di 4x, per il quale l'immagine di ciascun pozzetto viene acquisita come più riquadri. In questo flusso di lavoro di analisi, la cucitura delle tessere viene eseguita utilizzando il software gratuito FIJI/ImageJ19 (Figura 2). A seconda dello strumento utilizzato nel passaggio 3, potrebbe anche essere possibile eseguire cuciture direttamente nel software di accompagnamento.
<ol><li>Scarica FIJI20 e aprilo.</li>
	<li>Vai alla | Plugin | di cucitura Cuciture griglia/collezione21.</li>
	<li>Nella finestra popup, Grid/Collection Stitching, selezionare il tipo e l'ordine in base ai quali sono stati raccolti i riquadri. Scegli Griglia: riga per riga e Destra e Giù.</li>
	<li>Nella finestra successiva, Cucitura griglia: griglia: riga per riga, destra e giù, inserire il numero di riquadri nelle direzioni x e y. Per l'obiettivo 10x utilizzato qui, scegliere 2 come dimensione griglia x, 3 come dimensione griglia y e 0 come sovrapposizione tile.</li>
	<li>Fare clic su Sfoglia e selezionare la cartella contenente le immagini TIFF da cucire.</li>
	<li>Inserire il nome file comune in Nomi file per riquadri, utilizzando {i} nella posizione del numero di riquadro in ogni nome di file.</li>
	<li>Deseleziona tutte le caselle sottostanti.</li>
	<li>Esegui il plugin.</li>
	<li>Salvare le immagini risultanti come file TIFF per l'analisi nel passaggio successivo.</li>
</ol>5. Conteggio automatico delle inclusioni con CellProfiler22
<ol><li>Scarica e installa il software di analisi delle immagini open source, CellProfiler23. Scarica la pipeline InclusionCounting.cpproj da github.com/sinnigelab/aggregate-quantification.</li>
	<li>Aprire CellProfiler e trascinare la pipeline nella finestra Rilascia un file di pipeline qui. Fare clic su Sì per caricare il progetto.</li>
	<li>Fai clic sul modulo di input Immagini e trascina le immagini cucite nella finestra Rilascia file e cartella qui.</li>
	<li>Fare clic sul modulo di input dei metadati . Regolare l'espressione regolare per estrarre dal nome del file in base ai nomi delle immagini cucite.</li>
	<li>Fare clic sul modulo di input NamesandTypes e regolare Seleziona i criteri della regola in modo che corrispondano ai canali nei nomi dei file. NOTA: nelle impostazioni predefinite della pipeline, i nomi di file contenenti BF vengono riconosciuti come immagini brightfield e sono denominati Worms. I nomi di file contenenti YFP sono riconosciuti come immagini a fluorescenza e sono denominati Fluorescenza.</li>
	<li>Fare clic su Visualizza impostazioni di output per selezionare una cartella predefinita per salvare l'output da CellProfiler.</li>
	<li>Fare clic su Avvia modalità test per verificare le impostazioni della pipeline utilizzando il primo set di dati di imaging. Fare clic su Esegui per eseguire tutti i moduli nella pipeline o su Step per eseguire la pipeline un modulo alla volta. Per regolare i contorni del worm nel modulo EditObjectsManually , fare clic su Guida per visualizzare le istruzioni e fare clic su Fine per continuare a eseguire la pipeline. NOTA: le misurazioni estratte non verranno esportate in modalità test. Potrebbe essere necessario regolare i parametri di soglia per rilevare vermi e inclusioni in base alle deformazioni e all'ingrandimento utilizzati.</li>
	<li>Fare clic su Esci dalla modalità test e analizza immagini.</li>
	<li>Aprire la cartella di output per visualizzare i file di output. Apri le immagini con il nome del file originale seguito da contorni per verificare se i worm e le inclusioni sono stati sovrapposti correttamente. Nota : il numero di inclusioni per worm è disponibile nel file denominato ExpandedWormObjects. Ulteriori informazioni sulle immagini di input sono disponibili nel file denominato Image. È possibile selezionare un output aggiuntivo nel modulo ExportToSpreadsheet nella pipeline.</li>
</ol>6. Adattamento globale dei dati di conteggio dell'inclusione utilizzando AmyloFit5
NOTA: questo passaggio può essere eseguito solo quando sono disponibili dati per più concentrazioni proteiche. Per Q40-YFP, un insieme di quattro ceppi con diversi livelli di sovraespressione nelle cellule muscolari della parete corporea è stato creato in precedenza17. In altri casi, nuovi ceppi dovrebbero essere generati utilizzando la microiniezione di plasmidi e l'integrazione genomica24.
<ol><li>Vai alla piattaforma di fitting online gratuita per la cinetica di aggregazione AmyloFit25. Registrati o accedi con un account esistente. NOTA: è possibile accedere a un ampio manuale su come utilizzare AmyloFit per ulteriore assistenza. Vedi il link in alto a sinistra della pagina web (dopo l'accesso) per ulteriori informazioni.</li>
	<li>Per iniziare a utilizzare AmyloFit, assegna un nome al progetto e fai clic su Crea progetto. Apri il progetto cliccando su Apri e crea una sessione dandogli un nome e cliccando su Crea e carica sessione.</li>
	<li>Fai clic su Aggiungi dati e carica il file contenente il numero medio di inclusioni per animale, seguendo i requisiti di formato dei dati mostrati nel pannello di sinistra. Fare clic su Carica nuovi dati.</li>
	<li>Ignorare i passaggi di pre-elaborazione, che non sono necessari per i dati di conteggio dell'inclusione, impostando il numero di punti su medio per l'offset di punti zero e il numero di punti da mediare per plateau su 0. Fai clic su Invia. Ripetere questo passaggio per ogni concentrazione proteica (ad esempio, ogni colonna nel file caricato).</li>
	<li>Selezionate Personalizzato nel pannello del modello, immettete Celle n*(1-exp(-Kcell*m**(n)*(t-1))) nella casella dell'equazione e fate clic su Carica modello (Load model). NOTA: Poiché AmyloFit è stato originariamente progettato per l'analisi dei dati cinetici da saggi in vitro, è necessario caricare un modello personalizzato per analizzare i dati del conteggio di inclusione di C. elegans. Nell'equazione qui utilizzata, le cellule N sono il numero di cellule in cui avviene la formazione dell'inclusione, la cellula K è la costante del tasso di nucleazione, m la concentrazione proteica intracellulare e n l'ordine di reazione della nucleazione.</li>
	<li>Impostare i tipi di parametro su Global Const per N celle, Global fit per Kcell e n e Const per m. Impostare il valore delle cellule N su 95 per le cellule muscolari della parete corporea e l'ipotesi iniziale per le cellule K e n su 1. Immettete i valori di m per i diversi ceppi nel pannello di sinistra. NOTA: le ipotesi iniziali non sono rilevanti per il modello relativamente semplice utilizzato qui. Per i modelli più complessi, è utile inserire una stima dei valori attesi per abbreviare i tempi di calcolo.</li>
	<li>Lasciate invariato il numero di luppoli del bacino e fate clic su Adatta (Fit ) nel pannello di raccordo.</li>
	<li>Estrarre l'adattamento facendo clic su Scarica dati e adatta. NOTA: i parametri estratti dall'adattamento globale del modello verranno elencati nell'angolo in basso a destra. Un grafico dei dati e dell'adattamento verrà generato automaticamente nel pannello in alto a destra. Questo grafico può essere estratto facendo clic su Scarica pdf e personalizzato andando su Visualizza opzioni di trama. Lacellula K ha unità di concentrazione di molecole-n tempo-1 cellula-1. Per confrontare valori con diversi n, la cellula K può essere convertita nella velocità di nucleazione ad una data concentrazione proteica moltiplicandola per mn.</li>
</ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours.">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73 (2018).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+and+long-term+immobilization+in+a+hydrogel-microbead+matrix+for+high-resolution+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+and+other+small+organisms.">Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms.</a> PLoS One. 13 (3), 0193989 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Il metodo qui presentato facilita un'analisi imparziale e quantitativa della cinetica di aggregazione proteica nell'organismo modello C. elegans. Dipende da quattro elementi chiave (Figura 1): 1) mantenere una popolazione di nematodi sincronizzata con l'età; 2) microscopia a fluorescenza in piastre multiwell; 3) conteggio automatico delle inclusioni in CellProfiler; 4) data fitting in AmyloFit. Rispetto al conteggio manuale delle inclusioni in animali in movimento libero o da immagini salvate26, la quantificazione in CellProfiler è sia più veloce che imparziale. L'altro progresso chiave del protocollo è l'acquisizione di dati cinetici, piuttosto che di singoli punti temporali, che fornisce approfondimenti quantitativi sul meccanismo di aggregazione dopo aver adattato i dati a un modello matematico.
I quattro elementi del protocollo possono essere utilizzati come moduli indipendenti che possono essere modificati a seconda dell'applicazione. Le popolazioni sincronizzate con l'età possono anche essere mantenute utilizzando 5-fluoro-2′-deossiuridina (FUDR) per sterilizzare gli animali. Questo composto influisce sulla durata della vita e sulla proteostasi 24,25 ed è altamente cancerogeno per lo sperimentatore; tuttavia, preclude il trasferimento manuale dei worm, che può essere laborioso quando vengono gestiti grandi numeri. Altre alternative sono l'uso di mutanti sterili29 o dispositivi di filtrazione per separare la prole30.
La fase di microscopia a fluorescenza può anche essere regolata, ad esempio, utilizzando ingrandimenti più elevati per monitorare l'aggregazione proteica nei neuroni. La microscopia a campo largo può essere sufficiente per monitorare l'aggregazione di poliQ nelle cellule muscolari quando la differenza relativa tra le condizioni è più importante del numero assoluto di inclusioni. La pipeline CellProfiler può ancora essere utilizzata in questi casi, anche se le impostazioni per riconoscere worm e inclusioni dovranno essere regolate dall'utente. La produttività della tecnica è attualmente limitata dalla necessità di raccogliere manualmente gli animali nella piastra a 384 pozzetti. Questo può potenzialmente essere risolto con l'uso di dispositivimicrofluidici 16. L'azide di sodio è un anestetico relativamente duro, che potrebbe essere sostituito dall'immobilizzazione fisica con idrogel o perline28,29.
L'analisi in AmyloFit qui presentata si basa su un meccanismo di aggregazione costituito da eventi di nucleazione indipendenti in singole cellule. Nei casi in cui questo modello non si adatta, l'utente dovrebbe prendere in considerazione un'alternativa come il modello di aggregazione cooperativa sviluppato in precedenza17. Un limite di questo approccio è che devono essere disponibili ceppi che esprimono la proteina di interesse a diverse concentrazioni, sebbene questi possano essere generati utilizzando i metodi di routine di C. elegans 24.
Complessivamente, questo protocollo fornisce i mezzi per ottenere dati di alta qualità per la cinetica di aggregazione proteica in un sistema modello in vivo , consentendo un'analisi dettagliata dei meccanismi di aggregazione17. Sebbene il metodo sia stato dimostrato per l'aggregazione polyQ nel tessuto muscolare C. elegans , le future applicazioni del protocollo potrebbero includere altre proteine e tessuti e gli effetti dei fattori di proteostasi e delle piccole molecole.

L'accumulo di proteine mal ripiegate in depositi insolubili si verifica in una vasta gamma di malattie. Esempi ben noti sono l'aggregazione di amiloide-β e tau nella malattia di Alzheimer, α-sinucleina nel morbo di Parkinson e huntingtina con poliQ espanso nella malattia di Huntington 1,2. Il misfolding di questi polipeptidi in fibrille amiloidi è associato a tossicità e morte cellulare da meccanismi che sono ancora in gran parte poco chiari. Chiarire i meccanismi della formazione dell'amiloide sarà cruciale per lo sviluppo di terapie efficaci, che attualmente non sono disponibili.
Indagini dettagliate sulla formazione di amiloidi sono state eseguite in vitro sulla base di misurazioni della fluorescenza della tioflavina T, portando a una comprensione meccanicistica del processo di aggregazione e dell'effetto delle molecole inibitorie 3,4,5. Tuttavia, non è chiaro se gli stessi meccanismi di aggregazione siano validi nel complesso ambiente delle cellule e degli organismi viventi. Il verme nematode Caenorhabditis elegans è un organismo modello adatto per studiare l'aggregazione proteica in vivo. Ha un'anatomia relativamente semplice ma è costituito da più tessuti, tra cui muscoli, intestino e sistema nervoso. È geneticamente ben caratterizzato e gli strumenti per la modificazione genetica sono prontamente disponibili. Inoltre, ha un breve tempo di generazione di ~ 3 giorni e una durata totale di 2-3 settimane. Pertanto, l'aggregazione proteica può essere esaminata per tutta la durata della vita dell'animale su una scala temporale sperimentalmente conveniente. Infine, il nematode è otticamente trasparente, consentendo il tracciamento dell'aggregazione di proteine marcate fluorescentemente in animali vivi.
Queste caratteristiche di C. elegans sono state precedentemente sfruttate per studiare l'aggregazione delle proteine polyQ come modello per la Malattia di Huntington e altre malattie da espansione polyQ. Al di sopra della soglia patogenetica di 35-40 residui di glutammina, le proteine polyQ etichettate con proteina fluorescente gialla (YFP) possono essere osservate per formare inclusioni insolubili nel tessuto muscolare 6,7, neuroni8 e intestino 9,10. Queste caratteristiche sono state ampiamente utilizzate per lo screening dei geni 11,12,13 e dei modificatori di piccole molecole14 dell'aggregazione proteica e della tossicità.
C. elegans ha il potenziale per svolgere un ruolo importante nel colmare il divario tra studi in vitro sull'aggregazione proteica e modelli di malattia più complessi come i topi15. C. elegans è suscettibile di screening farmacologico16 ma può anche essere sfruttato per ottenere una comprensione fondamentale dei meccanismi molecolari dell'aggregazione proteica in vivo, come dimostrato recentemente17. Tuttavia, per entrambe le applicazioni, è di primaria importanza estrarre una misura quantitativa e riproducibile dell'aggregazione proteica. Qui, questo si ottiene con l'uso di un microscopio confocale ad alto rendimento combinato con una pipeline di analisi delle immagini dedicata (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Black with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmyloFit</td>
			<td>Knowles lab</td>
			<td>v2.0</td>
			<td>Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line A</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1228</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line B</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1229</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line C</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1230</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line D</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1231</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>4.1.3</td>
			<td>Downloaded from https://cellprofiler.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>Open-source</td>
			<td>(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j</td>
			<td>Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-throughput confocal microscope</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager CV8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>&#160;17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>WU Mainz</td>
			<td>250</td>
			<td>To make worm pick, 150 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum iridium wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>39383</td>
			<td>To make worm pick, 0.25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein aggregation kinetics in vivo using automated inclusion counting in caenorhabditis elegans

L'aggregazione proteica in inclusioni insolubili è un segno distintivo di una varietà di malattie umane, molte delle quali sono legate all'età. Il nematode Caenorhabditis elegans è un organismo modello ben consolidato che è stato ampiamente utilizzato nel campo per studiare l'aggregazione proteica e la tossicità. La sua trasparenza ottica consente la visualizzazione diretta dell'aggregazione proteica mediante microscopia a fluorescenza. Inoltre, il ciclo riproduttivo veloce e la breve durata della vita rendono il nematode un modello adatto per lo screening di geni e molecole che modulano questo processo.
Tuttavia, la quantificazione del carico aggregato negli animali vivi è scarsamente standardizzata, in genere eseguita mediante il conteggio manuale dell'inclusione sotto un microscopio a dissezione a fluorescenza in un singolo punto temporale. Questo approccio può comportare un'elevata variabilità tra gli osservatori e limita la comprensione del processo di aggregazione. Al contrario, l'aggregazione proteica simile all'amiloide in vitro viene regolarmente monitorata dalla fluorescenza T della tioflavina in modo altamente quantitativo e risolto nel tempo.
Qui, viene presentato un metodo analogo per l'analisi imparziale della cinetica di aggregazione nei C. elegans viventi, utilizzando un microscopio confocale ad alto rendimento combinato con analisi delle immagini su misura e adattamento dei dati. L'applicabilità di questo metodo è dimostrata monitorando la formazione di inclusione di una proteina poliglutammina (polyQ) marcata fluorescentemente nelle cellule muscolari della parete corporea. Il flusso di lavoro di analisi delle immagini consente di determinare il numero di inclusioni in diversi punti temporali, che sono adattati a un modello matematico basato su eventi di nucleazione indipendenti nelle singole cellule muscolari. Il metodo qui descritto può rivelarsi utile per valutare gli effetti dei fattori di proteostasi e le potenziali terapie per le malattie da aggregazione proteica in un animale vivente in modo robusto e quantitativo.

Il metodo qui descritto (Figura 1) è stato utilizzato per analizzare la cinetica di aggregazione di un costrutto comprendente 40 glutammine fuse a YFP (Q40-YFP). La proteina è espressa sotto il controllo del promotore unc-54 , guidando l'espressione nelle cellule muscolari della parete corporea. Poiché questi sono relativamente grandi e facili da visualizzare, l'uso di un obiettivo 10x è sufficiente per risolvere le inclusioni formate da Q40-YFP in questo tessuto. In precedenza sono stati sviluppati quattro ceppi (linee A-D) che esprimono la proteina in misura diversa per valutare la dipendenza dalla concentrazione dell'aggregazione polyQ in vivo17.
Le popolazioni sincronizzate per età delle linee A-D sono state generate da una deposizione di uova di 2 ore, seguita da un trasferimento giornaliero una volta che la prole ha raggiunto l'età adulta. Dal giorno 1 al giorno 10 dell'età adulta, 20 animali di ciascuno dei quattro ceppi sono stati ripresi in una piastra a 384 pozzetti, utilizzando un microscopio confocale ad alto rendimento. Le immagini dei pozzi sono state acquisite come 6 tessere, che sono state cucite insieme utilizzando un plugin in ImageJ21 (Figura 2). Le immagini cucite sono state successivamente analizzate utilizzando una pipeline CellProfiler22 personalizzata (Figura 3) per quantificare il numero medio di inclusione per animale per ogni ceppo e punto temporale.
I dati sono stati poi adattati a un modello matematico in AmyloFit5 (Figura 4). Il modello si basa sull'ipotesi che ciascuna delle 95 cellule muscolari della parete corporea acquisisca indipendentemente un'inclusione mediante un evento di nucleazione limitante la velocità, seguito da una rapida crescita aggregata17. L'adattamento ha prodotto una costante di nucleazione di 9,9 × 105 molecole M-2,1 d-1 cellula-1 e un ordine di reazione di 2,1, corrispondente a una velocità di nucleazione di 0,38 molecole d-1 cellula-1 ad una concentrazione proteica intracellulare di 1 mM. Due repliche biologiche indipendenti hanno portato a valori strettamente corrispondenti per la velocità di nucleazione e l'ordine di reazione, che sono in accordo con uno studio precedente che utilizzava un protocollo simile17 (Tabella 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig01v2.jpg"> Figura 1: Panoramica schematica del metodo. (A) Le popolazioni di C. elegans sincronizzate con l'età sono generate da un uovo a tempo. (B) Gli animali della stessa popolazione sono ripresi in una piastra a 384 pozzetti in diversi punti temporali. (C) Le piastrelle sono cucite insieme per formare immagini di tutti i pozzi, che vengono analizzate in CellProfiler per quantificare i numeri di inclusione per animale. (D) I dati sono adattati a un modello matematico utilizzando AmyloFit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig01largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig02.jpg"> Figura 2: Screenshot della procedura di cucitura in ImageJ utilizzando il plug-in Grid/Collection stitching21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig03.jpg"> Figura 3: Schema della pipeline CellProfiler per quantificare i numeri delle inclusioni. (A-C) L'immagine del campo luminoso (A) viene utilizzata per identificare i worm (B, primo piano in C). (D-G) L'immagine di fluorescenza (D, primo piano in E) viene utilizzata per identificare le inclusioni (F). I vermi e le inclusioni sono correlati per fornire il numero di inclusioni per ogni verme nel pozzo (G). Le immagini mostrate sono di animali della linea A Q40 al giorno 3 dell'età adulta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig04.jpg"> Figura 4: Adattamento dei dati a un modello matematico in AmyloFit. (A) I dati vengono caricati in AmyloFit. (B) Viene inserita un'equazione personalizzata per modellare la formazione dell'inclusione, assumendo eventi di nucleazione indipendenti in ciascuna cella. (C) Adattamento della cinetica di aggregazione per le linee C. elegans A-D che esprimono diversi livelli di Q40-YFP. I dati sono rappresentativi di due repliche biologiche indipendenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Set di dati 1</td>
			<td>Set di dati 2</td>
			<td>Sinnige et al.17
</td>
		</tr>
<tr>
<td>n</td>
			<td>2.1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cellula K (molecole M-n d-1 cellula-1)</td>
			<td>9,9 x 105
</td>
			<td>1,4 x 105
</td>
			<td>3,1 x 104
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Velocità di nucleazione a 1 mM (molecole d-1 cellula-1)</td>
			<td>0.38</td>
			<td>0.21</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Valori della velocità di nucleazione e dell'ordine di reazione dell'aggregazione Q40-YFP. Dati per due repliche biologiche indipendenti del protocollo e confronto con i dati precedentemente pubblicati17.

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Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Qui, viene presentato un metodo per l'analisi della cinetica di aggregazione proteica nel nematode Caenorhabditis elegans. Gli animali di una popolazione sincronizzata con l'età vengono ripresi in diversi punti temporali, seguiti dal conteggio dell'inclusione semiautomatica in CellProfiler e dall'adattamento a un modello matematico in AmyloFit.

Monitoraggio della cinetica di aggregazione proteica in vivo utilizzando il conteggio automatico dell'inclusione in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

I meccanismi di aggregazione proteica sono stati finora studiati principalmente in vitro. Con il nostro protocollo possiamo fare studi quantitativi simili nell'organismo modello C.elegans. Il vantaggio principale del nostro metodo è la quantificazione imparziale dei numeri di inclusione.E adattando questi dati di alta qualità a modelli matematici, possiamo ottenere informazioni sul meccanismo di aggregazione. L'aggregazione proteica si verifica in molte malattie, tra cui l'Alzheimer e l'Huntington. Comprendere il meccanismo molecolare dell'aggregazione proteica in vivo è fondamentale per sviluppare nuove terapie.Inizia posizionando 10 nematodi adulti su una piastra NGM seminata di 6 cm con un plettro di verme di platino per eseguire una deposizione sincronizzata delle uova. Lasciare gli adulti a deporre le uova per circa due ore a 20 ° C prima di rimuoverle dal piatto. Posizionare le piastre con le uova nell'incubatrice a 20 C.Monitorare lo sviluppo degli animali fino a quando non raggiungono l'età adulta all'incirca il terzo giorno dopo la deposizione delle uova.Preparare la piastra da 384 pozzetti riempiendo il numero richiesto di pozzetti con 100 L di tampone M9 integrato con 25 mM di azide di sodio come anestetico. Riempi un pozzetto per ceppo da fotografare. Per ogni ceppo, trasferire 20 animali in un pozzo utilizzando un plettro di verme di platino.Coprire la piastra con il coperchio per evaporazione preventiva e visualizzare la piastra entro un'ora dalla preparazione. Accendere lo strumento e aprire il software. Fare clic sul pulsante Riproduci accanto a Scarica piastre di pozzo e posizionare la piastra a 384 pozzetti nel microscopio.In Elenco azioni e Acquisizione fluorescenza 3D fare clic su Test e selezionare i worm contenenti il pozzo. Impostare Elaborazione immagini su Nessuno. E fai clic sul pulsante Riproduci per determinare la distanza di spostamento ottimale alla quale i worm sono centrati correttamente.Impostare Distanza ascendente a 50 m, Distanza discendente a 50 m e Intervallo di taglio a 2 m per catturare l'intero spessore degli animali nella pila z. Impostare Elaborazione immagini su Massimo. Selezionare i pozzetti da visualizzare in Impostazione scansione piastra pozzo.Quindi seleziona Affianca e acquisisci tutto bene. Salvare l'impostazione di misurazione. E fai clic su Avvia misurazione per avviare l'esperimento.Aprire CellProfiler e trascinare la pipeline nella finestra Rilascia un file di pipeline qui. Fare clic su Sì per caricare il progetto. Quindi, trascina le immagini cucite nella finestra Rilascia file e cartella qui.Fare clic sul modulo di input dei metadati. Regolare l'espressione regolare per estrarre dal nome del file in base ai nomi delle immagini cucite. Fare clic sul modulo di input NamesAndTypes e regolare Seleziona i criteri della regola in modo che corrispondano ai canali nei nomi dei file.Quindi, fare clic su Impostazioni di output per selezionare una cartella in cui salvare l'output da CellProfiler. Fare clic su Avvia modalità test per verificare le impostazioni della pipeline utilizzando il primo set di dati di imaging. Fare clic su Step per eseguire la pipeline, un modulo alla volta.Per regolare i contorni del worm, fare clic su Mostra guida nel modulo ModificaOggettimanualmente per visualizzare le istruzioni. Correggere i contorni. E quindi fare clic su Fine per continuare a eseguire la pipeline.Fare clic su Esci dalla modalità test e analizza immagini. Aprire la cartella di output per visualizzare i file di output. E apri le immagini con il nome del file originale seguito da contorni per verificare se i worm e le inclusioni sono stati correttamente sovrapposti.Per iniziare a utilizzare AmyloFit, assegna un nome al progetto e fai clic su Crea progetto. Fare clic su Apri per aprirlo. E crea una sessione dandogli un nome e facendo clic su Crea e carica sessione.Clicca su Aggiungi dati e carica il file contenente il numero medio di inclusioni per animale, seguendo i requisiti di formato dei dati mostrati nel pannello di sinistra. Quindi, fai clic su Carica nuovi dati. Impostare Numero di punti su medio per offset di punto zero su 0 e Impostare Numero di punti in media su per plateau su 0 per saltare i passaggi di pre-elaborazione, che non sono necessari per i dati di conteggio dell'inclusione.Quindi, fai clic su Invia. Ripetere questo passaggio per ogni concentrazione proteica. Selezionate Personalizzato nel pannello Modello.Immettere l'equazione per la nucleazione indipendente nella casella Equazione. E fai clic su Carica modello. Per Ncells, impostare il tipo di parametro su Costante globale e impostare Valore su 95, corrispondente al numero di cellule muscolari della parete corporea.Impostate i tipi di parametro su Global fit per Kcell e n. E a Costante per m. Immettete i valori di m per i diversi ceppi nel pannello di sinistra.Lasciate invariato il numero di luppoli del bacino e fate clic su Adatta (Fit) nel pannello Raccordo (Fitting). Infine, estrai l'adattamento facendo clic su Scarica dati e Adatta. I numeri di inclusione sono stati monitorati in quattro ceppi di C.elegans che esprimono diverse concentrazioni di Q40.Il modello di nucleazione indipendente descrive bene la cinetica di aggregazione. L'adattamento ha prodotto un ordine di reazione di 2,1 e una velocità di nucleazione di 0,38 molecole al giorno per cellula ad una concentrazione proteica intracellulare di 1 mM. Due repliche biologiche indipendenti in uno studio precedente hanno mostrato valori strettamente corrispondenti per l'ordine di reazione e la velocità di nucleazione.Una cosa che dovrebbe essere tenuta a mente è che hai bisogno di set di dati di alta qualità per più concentrazioni di proteine per ottenere adattamenti affidabili. Questo metodo può essere utilizzato per trovare modi per interferire con l'aggregazione proteica in un organismo vivente, come abbattimenti genetici o trattamenti a piccole molecole.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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