Name: monitoring protein aggregation kinetics in vivo using automated inclusion counting in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Мы благодарим лабораторию Моримото за штаммы C. elegans и Esmeralda Bosman за помощь в работе с высокопроизводительным конфокальным микроскопом. Эта работа финансировалась за счет стартового гранта Утрехтского университета T.S.

<ol>
	<li>Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+state+and+its+association+with+protein+misfolding+diseases.">The amyloid state and its association with protein misfolding diseases.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).</li><li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+amyloid+formation,+and+human+disease:+a+summary+of+progress+over+the+last+decade.">Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: a summary of progress over the last decade.</a> Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).</li><li>Knowles, T. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analytical+solution+to+the+kinetics+of+breakable+filament+assembly.">An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly.</a> Science. 326 (5959), 1533-1537 (2009).</li><li>Cohen, S. I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+amyloid-&#946;42+aggregates+occurs+through+a+secondary+nucleation+mechanism.">Proliferation of amyloid-&#946;42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9758-9763 (2013).</li><li>Meisl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+protein+aggregation+from+global+fitting+of+kinetic+models.">Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models.</a> Nature Protocols. 11 (2), 252-272 (2016).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+proteins+at+the+pathogenic+threshold+display+neuron-specific+aggregation+in+a+pan-neuronal+Caenorhabditis+elegans+model.">Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model.</a> Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Prahlad, V., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+regulates+the+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+misfolded+proteins.">Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14204-14209 (2011).</li><li>Nollen, E. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screening+strategy+identifies+novel+regulators+of+the+proteostasis+network.">A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network.</a> PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).</li><li>Brehme, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperome+subnetwork+safeguards+proteostasis+in+aging+and+neurodegenerative+disease.">A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease.</a> Cell Reports. 9, 1-16 (2014).</li><li>Calamini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+proteostasis+regulators+for+protein+conformational+diseases.">Small-molecule proteostasis regulators for protein conformational diseases.</a> Nature Chemical Biology. 8 (2), 185-196 (2012).</li><li>Sinnige, T., Stroobants, K., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+studies+of+protein+misfolding+and+aggregation+in+in+vivo+models+of+Alzheimer's+and+Parkinson's+diseases.">Biophysical studies of protein misfolding and aggregation in in vivo models of Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 49, 22 (2020).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model.">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7, 13023 (2016).</li><li>Sinnige, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+reveals+that+independent+nucleation+events+determine+the+progression+of+polyglutamine+aggregation+in+C.+elegans.">Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 202188118 (2021).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans.">Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>. FIJI/ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/downloads">https://imagej.net/downloads</a> (2012)</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions.">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li><li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+free,+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis.">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> BioTechniques. 42 (1), 71-75 (2007).</li><li>CellProfiler. Broad Institute Available from: <a target="_blank" href="https://cellprofiler.org/releases">https://cellprofiler.org/releases</a> (2021)</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>. Knowles group, University of Cambridge Available from: <a target="_blank" href="https://amylofit.com/amylofitmain/login/">https://amylofit.com/amylofitmain/login/</a> (2021)</li><li>Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+tissue-specific+proteostatic+decline+in+Caenorhabditis+elegans.">Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), (2021).</li><li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset.">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).</li><li>Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+enhances+the+heat+shock+response+and+decreases+polyglutamine+aggregation+in+an+HSF-1-dependent+manner+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 141-142, 1-4 (2014).</li><li>David, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+protein+aggregation+as+an+inherent+part+of+aging+in+C.+elegans.">Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans.</a> PLoS Biology. 8 (8), 47-48 (2010).</li><li>Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+sieve:+A+low-tech+instrument+and+methodology+for+sorting+small+multicellular+organisms.">Caenorhabditis sieve: A low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).</li><li>Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours.">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73 (2018).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+and+long-term+immobilization+in+a+hydrogel-microbead+matrix+for+high-resolution+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+and+other+small+organisms.">Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms.</a> PLoS One. 13 (3), 0193989 (2018).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Способ, представленный в настоящем описании, облегчает непредвзятый и количественный анализ кинетики агрегации белка в модельном организме C. elegans. Это зависит от четырех ключевых элементов (рисунок 1): 1) поддержание синхронизированной по возрасту популяции нематод; 2) флуоресцентная микроскопия в многоязычных пластинах; 3) автоматизированный подсчет включений в CellProfiler; 4) подгонка данных в AmyloFit. По сравнению с ручным подсчетом включений у свободно движущихся животных или из сохраненных изображений26, количественная оценка в CellProfiler является более быстрой и более объективной. Другим ключевым достижением протокола является получение кинетических данных, а не отдельных временных точек, что дает количественное представление о механизме агрегации при подгонке данных к математической модели.
Четыре элемента протокола могут быть использованы в качестве независимых модулей, которые могут быть изменены в зависимости от приложения. Популяции, синхронизированные по возрасту, также могут поддерживаться с использованием 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FUDR) для стерилизации животных. Это соединение влияет на продолжительность жизни и протеостаз24,25 и является высококанцерогенным для экспериментатора; однако это исключает ручную передачу червей, которая может быть трудоемкой при обработке большого количества. Другими альтернативами являются использование стерильных мутантов29 или фильтрационных устройств для разделения потомства30.
Стадия флуоресцентной микроскопии также может быть скорректирована, например, с использованием более высоких увеличений для мониторинга агрегации белка в нейронах. Широкоугольной микроскопии может быть достаточно для мониторинга агрегации polyQ в мышечных клетках, когда относительная разница между состояниями более важна, чем абсолютное число включений. Конвейер CellProfiler по-прежнему можно использовать в этих случаях, хотя параметры для распознавания червей и включений должны быть скорректированы пользователем. Пропускная способность техники в настоящее время ограничена необходимостью ручного отбора животных в 384-луночную плиту. Это потенциально может быть исправлено путем использования микрофлюидных устройств16. Азид натрия является относительно жестким анестетиком, который может быть заменен физической иммобилизацией гидрогелями или бусинами28,29.
Анализ в AmyloFit, представленный здесь, основан на механизме агрегации, состоящем из независимых событий нуклеации в отдельных клетках. В тех случаях, когда эта модель не подходит, пользователю следует рассмотреть альтернативу, такую как модель кооперативной агрегации, разработанная ранее17. Ограничение этого подхода заключается в том, что штаммы, экспрессирующие интересующий белок в различных концентрациях, должны быть доступны, хотя они могут быть получены с использованием рутинных методов C. elegans 24.
В целом, этот протокол предоставляет средства для получения высококачественных данных для кинетики агрегации белка в модельной системе in vivo , что позволяет проводить детальный анализ механизмов агрегации17. Хотя метод был продемонстрирован для агрегации polyQ в мышечной ткани C. elegans , будущие применения протокола могут включать другие белки и ткани и эффекты факторов протеостаза и малых молекул.

Накопление неправильно свернутых белков в нерастворимые отложения происходит при широком спектре заболеваний. Известными примерами являются агрегация амилоид-β и тау при болезни Альцгеймера, α-синуклеина при болезни Паркинсона и гентингтина с вспененным полиQ при болезни Гентингтона 1,2. Неправильное сворачивание этих полипептидов в амилоидные фибриллы связано с токсичностью и гибелью клеток механизмами, которые до сих пор в значительной степени неясны. Выяснение механизмов образования амилоида будет иметь решающее значение для разработки эффективных методов лечения, которые в настоящее время недоступны.
Детальные исследования образования амилоида были выполнены in vitro на основе измерений флуоресценции тиофлавина Т, что привело к механистическому пониманию процесса агрегации и влияния ингибирующих молекул 3,4,5. Однако неясно, справедливы ли те же механизмы агрегации в сложной среде живых клеток и организмов. Червь-нематода Caenorhabditis elegans является подходящим модельным организмом для изучения агрегации белка in vivo. Он имеет относительно простую анатомию, но состоит из нескольких тканей, включая мышцы, кишечник и нервную систему. Он генетически хорошо характеризуется, и инструменты для генетической модификации легко доступны. Кроме того, он имеет короткое время генерации ~ 3 дня и общую продолжительность жизни 2-3 недели. Таким образом, агрегация белка может быть исследована на протяжении всей жизни животного в экспериментально удобной временной шкале. Наконец, нематода оптически прозрачна, что позволяет отслеживать агрегацию флуоресцентно меченых белков у живых животных.
Эти особенности C. elegans ранее использовались для исследования агрегации белков polyQ в качестве модели для гентингтона и других заболеваний расширения polyQ. Выше патогенного порога в 35-40 остатков глутамина можно наблюдать, что белки polyQ, помеченные желтым флуоресцентным белком (YFP), образуют нерастворимые включения в мышечной ткани 6,7, нейронах8 и кишечнике 9,10. Эти особенности были широко использованы для скрининга генов 11,12,13 и низкомолекулярных модификаторов 14 агрегации и токсичности белка.
C. elegans может сыграть важную роль в преодолении разрыва между исследованиями агрегации белка in vitro и более сложными моделями заболеваний, такими как мыши15. C. elegans поддается скринингу лекарств16 , но также может быть использован для получения фундаментального понимания молекулярных механизмов агрегации белка in vivo, как было продемонстрировано недавно17. Однако для обоих применений первостепенное значение имеет извлечение количественной и воспроизводимой меры агрегации белка. Здесь это достигается за счет использования высокопроизводительного конфокального микроскопа в сочетании с выделенным конвейером анализа изображений (рисунок 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Black with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmyloFit</td>
			<td>Knowles lab</td>
			<td>v2.0</td>
			<td>Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line A</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1228</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line B</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1229</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line C</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1230</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line D</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1231</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>4.1.3</td>
			<td>Downloaded from https://cellprofiler.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>Open-source</td>
			<td>(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j</td>
			<td>Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-throughput confocal microscope</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager CV8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>&#160;17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>WU Mainz</td>
			<td>250</td>
			<td>To make worm pick, 150 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum iridium wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>39383</td>
			<td>To make worm pick, 0.25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein aggregation kinetics in vivo using automated inclusion counting in caenorhabditis elegans

Агрегация белка в нерастворимые включения является отличительной чертой разнообразных заболеваний человека, многие из которых связаны с возрастом. Нематода Caenorhabditis elegans является хорошо зарекомендовавшим себя модельным организмом, который широко используется в этой области для изучения агрегации и токсичности белка. Его оптическая прозрачность позволяет непосредственно визуализировать агрегацию белка с помощью флуоресцентной микроскопии. Более того, быстрый репродуктивный цикл и короткая продолжительность жизни делают нематоду подходящей моделью для скрининга генов и молекул, которые модулируют этот процесс.
Однако количественная оценка совокупной нагрузки у живых животных плохо стандартизирована, обычно выполняется ручным подсчетом включения под флуоресцентным рассеченным микроскопом в одну точку времени. Такой подход может привести к высокой изменчивости между наблюдателями и ограничить понимание процесса агрегирования. Напротив, агрегация амилоидоподобных белков in vitro обычно контролируется флуоресценцией тиофлавина Т с высоким количественным и временным разрешением.
Здесь представлен аналогичный метод для непредвзятого анализа кинетики агрегации у живых C. elegans с использованием высокопроизводительного конфокального микроскопа в сочетании с индивидуальным анализом изображений и подгонкой данных. Применимость данного метода демонстрируется путем мониторинга включения образования флуоресцентно меченого белка полиглутамина (polyQ) в мышечных клетках стенки организма. Рабочий процесс анализа изображений позволяет определять количество включений в разных точках времени, которые подогнаны к математической модели, основанной на независимых событиях нуклеации в отдельных мышечных клетках. Метод, описанный здесь, может оказаться полезным для оценки воздействия факторов протеостаза и потенциальных терапевтических средств для лечения заболеваний агрегации белка у живого животного надежным и количественным образом.

Метод, описанный здесь (рисунок 1), использовался для анализа кинетики агрегации конструкции, содержащей 40 глутаминов, сплавленных с YFP (Q40-YFP). Белок экспрессируется под контролем промотора unc-54 , стимулируя экспрессию в мышечных клетках стенки тела. Поскольку они относительно велики и легко визуализируются, использование 10-кратного объектива достаточно для разрешения включений, образованных Q40-YFP в этой ткани. Ранее были разработаны четыре штамма (линии A-D), экспрессирующие белок в разной степени для оценки концентрационно-зависимости агрегации polyQ in vivo17.
Синхронизированные по возрасту популяции линий A-D были сгенерированы 2-часовой яйцекладкой, за которой следовал ежедневный перенос, как только потомство достигло совершеннолетия. С 1 по 10 день взрослой жизни 20 животных из каждого из четырех штаммов были изображены в 384-луночной пластине с использованием высокопроизводительного конфокального микроскопа. Изображения колодцев были получены в виде 6 плиток, которые были сшиты вместе с помощью плагина в ImageJ21 (рисунок 2). Сшитые изображения были впоследствии проанализированы с использованием специально изготовленного конвейера CellProfiler22 (рисунок 3) для количественной оценки среднего числа включения на животное для каждого штамма и точки времени.
Затем данные были сопоставлены с математической моделью в AmyloFit5 (рисунок 4). Модель основана на предположении, что каждая из 95 мышечных клеток стенки тела независимо приобретает одно включение путем события нуклеации, ограничивающего скорость, за которым следует быстрый совокупный рост17. Припадение дало константу скорости нуклеации 9,9 × 105 молекул M-2,1 d-1 клетки-1 и порядок реакции 2,1, соответствующий скорости нуклеации 0,38 молекулы d-1 клетка-1 при внутриклеточной концентрации белка 1 мМ. Две независимые биологические реплики привели к близко соответствующим значениям скорости нуклеации и порядка реакций, которые согласуются с предыдущим исследованием с использованием аналогичного протокола17 (таблица 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig01v2.jpg"> Рисунок 1: Схематический обзор метода. (A) Популяции C. elegans , синхронизированные по возрасту, генерируются синхронизированной яйцекладкой. (B) Животные из одной и той же популяции изображены в 384-луночной пластине в разные моменты времени. (C) Плитки сшиваются вместе для формирования изображений целых скважин, которые анализируются в CellProfiler для количественной оценки числа включений на животное. (D) Данные устанавливаются в математическую модель с использованием AmyloFit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig01largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig02.jpg"> Рисунок 2: Скриншоты процедуры сшивания в ImageJ с помощью плагина Grid/Collection stitching21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig03.jpg"> Рисунок 3: Схема конвейера CellProfiler для количественной оценки чисел включений. (A-C) Изображение яркого поля (A) используется для идентификации червей (B, крупный план в C). (Д-Г) Флуоресцентное изображение (D, крупный план в E) используется для идентификации включений (F). Черви и включения связаны, чтобы обеспечить количество включений для каждого червя в скважине (G). Показаны изображения животных линии Q40 A на 3-й день взрослой жизни. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig04.jpg"> Рисунок 4: Подгонка данных к математической модели в AmyloFit. (A) Данные загружаются в AmyloFit. (B) Для формирования включения модели вводится пользовательское уравнение, предполагающее независимые события нуклеации в каждой клетке. (C) Подгонка кинетики агрегации для линий A-D C. elegans , выражающих различные уровни Q40-YFP. Данные являются репрезентативными для двух независимых биологических реплик. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Набор данных 1</td>
			<td>Набор данных 2</td>
			<td>Синниге и др.17
</td>
		</tr>
<tr>
<td>n</td>
			<td>2.1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>К-клетка (молекулы M-n d-1 клетка-1)</td>
			<td>9,9 х 105
</td>
			<td>1,4 х 105
</td>
			<td>3,1 х 104
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Скорость нуклеации при 1 мМ (молекулы d-1 клетка-1)</td>
			<td>0.38</td>
			<td>0.21</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Значения скорости нуклеации и порядка реакции агрегации Q40-YFP. Данные для двух независимых биологических реплик протокола и сравнение с ранее опубликованными данными17.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Здесь представлен метод анализа кинетики агрегации белка у нематоды Caenorhabditis elegans. Животные из популяции, синхронизированной по возрасту, визуализируются в разные моменты времени, за которыми следует полуавтоматический подсчет включения в CellProfiler и соответствие математической модели в AmyloFit.

Мониторинг кинетики агрегации белка In Vivo с использованием автоматизированного подсчета включений в Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Механизмы агрегации белка до сих пор исследовались в основном in vitro. С помощью нашего протокола мы можем проводить аналогичные количественные исследования в модельном организме C.elegans. Основным преимуществом нашего метода является объективная количественная оценка чисел включения.И подгоняя эти высококачественные данные к математическим моделям, мы можем получить представление о механизме агрегации. Агрегация белка происходит при многих заболеваниях, включая болезнь Альцгеймера и Болезнь Хантингтона. Понимание молекулярного механизма агрегации белка in vivo имеет решающее значение для разработки новых методов лечения.Начните с размещения 10 взрослых нематод на 6-сантиметровую посеянную пластину NGM с платиновым червячным отмычком для выполнения синхронной яйцекладки. Оставьте взрослым отложить яйца примерно на два часа при 20 С, прежде чем удалить их из тарелки. Поместите тарелки с яйцами в инкубатор при 20 С.Следите за развитием животных, пока они не достигнут совершеннолетия примерно на третий день после яйцекладки.Подготовьте плиту из 384 скважин, заполнив необходимое количество скважин 100 л буфера М9, дополненного 25 мМ азида натрия в качестве анестетика. Заполните по одной лунке для каждого штамма для получения изображения. Для каждого штамма переведите 20 животных в одну скважину с помощью платинового червячного кирка.Накройте пластину крышкой для предотвращения испарения и визуализируйте пластину в течение одного часа после приготовления. Включите прибор и откройте программное обеспечение. Нажмите кнопку «Воспроизвести» рядом с пунктом «Разгрузить колодезные пластины» и поместите пластину на 384 скважины в микроскоп.В разделе Список действий и Получение 3D-флуоресценции нажмите кнопку Тест и выберите скважину, содержащую червей. Установите для параметра Обработка изображений значение Нет. И нажмите кнопку «Воспроизвести», чтобы определить оптимальное расстояние смещения, на котором черви правильно центрированы.Установите расстояние по возрастанию на 50 м, расстояние по убыванию на 50 м и интервал нарезки на 2 м, чтобы захватить всю толщину животных в z-стеке. Установите для параметра Обработка изображений значение Максимальная. Выберите скважины для получения изображения в разделе Настройка сканирования плит скважины.Затем выберите Плитка и Получить целый колодец. Сохраните настройку измерения. И нажмите кнопку Начать измерение, чтобы начать эксперимент.Откройте CellProfiler и перетащите конвейер в окно Перетащить файл конвейера сюда. Нажмите кнопку Да, чтобы загрузить проект. Затем перетащите сшитые изображения в окно Перетащить файлы и папку здесь.Щелкните модуль ввода метаданных. Настройте регулярное выражение для извлечения из имени файла в соответствии с именами сшитых изображений. Щелкните модуль ввода NamesAndTypes и настройте Критерии выберите критерии правила в соответствии с каналами в именах файлов.Затем нажмите «Настройки вывода», чтобы выбрать папку для сохранения выходных данных из CellProfiler. Щелкните Запустить тестовый режим, чтобы проверить параметры конвейера с помощью первого набора данных образа. Щелкните Шаг, чтобы запустить конвейер по одному модулю за раз.Чтобы настроить контуры червей, щелкните Показать справку в модуле EditObjectsManually, чтобы просмотреть инструкции. Исправьте контуры. Затем нажмите кнопку Готово, чтобы продолжить работу конвейера.Нажмите «Выход из тестового режима» и «Анализ изображений». Откройте выходную папку для просмотра выходных файлов. И откройте изображения с исходным именем файла, за которым следуют контуры, чтобы проверить, правильно ли наложены черви и включения.Чтобы начать использовать AmyloFit, назовите проект и нажмите Создать проект. Нажмите «Открыть», чтобы открыть его. И создайте сеанс, присвоив ему имя и щелкнув Создать и загрузить сеанс.Нажмите «Добавить данные» и загрузите файл, содержащий среднее количество включений на животное, следуя требованиям к формату данных, показанным на левой панели. Затем нажмите Загрузить новые данные. Установите для параметра Число точек, которое необходимо усреднить для смещения нулевой точки, значение 0, а для параметра Число точек, которое необходимо усреднить для плато, значение 0, чтобы пропустить этапы предварительной обработки, которые не требуются для данных подсчета включений.Затем нажмите «Отправить». Повторите этот шаг для каждой концентрации белка. Выберите Пользовательский на панели «Модель».Введите уравнение для независимой нуклеации в поле Уравнение. И нажмите кнопку Загрузить модель. Для Ncells задайте тип параметра Global Constant, а для параметра Value — значение 95, соответствующее количеству мышечных клеток стенки тела.Установите для типов параметров Значение Global fit для Kcell и n. И к Константе за м. Введите значения m для различных деформаций в левой панели.Оставьте количество прыжков бассейна без изменений и нажмите кнопку «По размеру» на панели «Подгонка». Наконец, извлеките подгонку, щелкнув Загрузить данные и Подогнать. Показатели включения контролировали в четырех штаммах C.elegans, экспрессирующих различные концентрации Q40.Независимая модель нуклеации хорошо описывает кинетику агрегации. Припадок давал порядок реакции 2,1 и скорость нуклеации 0,38 молекулы в день на клетку при внутриклеточной концентрации белка 1 мМ. Две независимые биологические реплики в предыдущем исследовании показали близко совпадающие значения для порядка реакции и скорости нуклеации.Одна вещь, которую следует иметь в виду, заключается в том, что вам нужны высококачественные наборы данных для нескольких концентраций белка, чтобы получить надежные соответствия. Этот метод может быть использован для поиска способов вмешательства в агрегацию белка в живом организме, таких как генетические нокдауны или обработка малых молекул.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Растущий белок кристаллы с отдельных измерений с помощью автоматизированных кристаллизации, в сочетании с в Situ Динамическое рассеяние света

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Оценка влияния агрегации белков на сотовой окислительный стресс в дрожжи

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

На основе плиты крупномасштабного культивирования Caenorhabditis elegans: Пробоподготовка для изучения метаболические изменения при сахарном диабете

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

В Vivo Кальций Imaging в C. elegans мышцы стены тела

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Синтез пониженного стандарта для количественной оценки 2-Arachidonoylglycerol в Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

В Vivo Hydroxyl радикальный белок следдля изучения взаимодействия белков в Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...