Name: monitoring protein aggregation kinetics in vivo using automated inclusion counting in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Vi tackar Morimoto-laboratoriet för C. elegans-stammar och Esmeralda Bosman för hjälp med konfokalmikroskopet med hög genomströmning. Detta arbete finansierades av ett startbidrag från Utrecht University till T.S.

1. Tillväxt av en ålderssynkronerad befolkning av C. elegans
<ol><li>Behåll C. elegans-stammarna på nematodtillväxtmediumplattor (NGM) sådda med Escherichia coli OP50 vid 20 °C enligt standardförfaranden18.</li>
	<li>Utför en synkroniserad äggläggning genom att placera 10 vuxna nematoder på en 6 cm fröad NGM-platta med en platinamaskplockning. Låt de vuxna lägga ägg i ~ 2 timmar vid 20 ° C innan du tar bort dem. Förbered 1-4 plattor per stam, beroende på stammens fertilitet och antalet tidpunkter som ska tas.</li>
	<li>Placera plattorna med ägg i inkubatorn vid 20 °C. Övervaka djurens utveckling tills de når vuxen ålder. OBS: Den dag då djuren har nått vuxen ålder definieras här som dag 1. Vanligtvis är detta tre dagar efter äggläggningen.</li>
	<li>Från och med dag 1, överför djuren till nya fröade NGM-plattor dagligen för att skilja dem från sina avkommor. För att kompensera för djur som dör eller går förlorade under överföringen, överför ~ 40 djur per stam gånger antalet punkter som ska avbildas (se steg 2). Fortsätt tills djuren har upphört att lägga befruktade ägg (~ dag 6 i vuxen ålder). OBS: Uteslut djur med uppsamling eller andra utvecklingsfenotyper. Bagging observeras vanligen i stammar som uttrycker aggregeringsbenägna proteiner.</li>
</ol>2. Provberedning av C. elegans i en multiwell-platta
OBS: Eftersom avbildningsförfarandet kräver anestetika som så småningom kommer att döda djuren, kan samma djur inte återanvändas för efterföljande tidpunkter. Istället avbildas olika djur från samma ålderssynkroniserade sats på olika dagar. Även om de flesta stammar kommer att ha få inneslutningar vid dag 1, rekommenderas att inkludera denna tidpunkt som en baslinje.
<ol><li>Förbered 384-brunnsplattan genom att fylla det önskade antalet brunnar med 100 μL M9-buffert kompletterad med 25 mM NaN3 som bedövningsmedel. Fyll en brunn per stam som ska avbildas. OBS: Natriumazid (NaN3) är giftigt och bör hanteras med försiktighet.</li>
	<li>För varje stam, överför 20 djur till en brunn med en platinamaskplockning. OBS: Maskarna måste placeras utanför bakteriegräsmattan innan de placeras i brunnen. Bakterier gör att djuren håller sig till maskplockningen, vilket kan förhindra att de släpps och kommer att fördunkla brunnsinnehållet. I allmänhet är 20 det optimala antalet djur per brunn för att förhindra överlappning mellan maskarna samtidigt som onödig avbildning av tomt brunnsutrymme begränsas.</li>
	<li>Täck plattan med locket för att förhindra avdunstning och avbilda plattan inom 1 timme efter beredningen.</li>
	<li>Upprepa steg 2,1-2,3 dagligen tills en stadig platå i inkluderingsnumren har uppnåtts eller tills de flesta djur har dött. Utför provberedningen och avbildningen vid samma tidpunkt varje dag för att säkerställa intervaller på 24 timmar.</li>
</ol>3. Bildförvärv på konfokalmikroskopet med hög genomströmning
OBS: Detta experiment kan också ställas in på ett vanligt konfokalmikroskop med en multiwell platthållare. En kamera med ett stort synfält är fördelaktigt för att begränsa antalet plattor som behövs för att avbildas för att spänna över hela brunnen. Se materialförteckningen för mer information om mikroskopet och programvaran som används i detta protokoll.
<ol><li>Slå på instrumentet och öppna programvaran.</li>
	<li>Starta ett nytt protokoll genom att gå till | Nyhet. Välj rätt typ av flerbrunnsplatta och klicka på Skapa en ny mätinställning.</li>
	<li>Ställ in kanalen för fluorescens genom att gå till Ch 1. Ställ in målet på 10x. Välj 488 nm som ljuskälla och BP525/25 som emissionsfilter för att avbilda YFP. Ställ in binning på 2x2 för att minska filstorleken.</li>
	<li>Klicka på Lägg till kanal och välj Brightfield som metod.</li>
	<li>Om du vill lägga till en z-stack konfokalfluorescensbild till mätningen väljer du 3D Fluorescens acquisition under Action List. Gå till Välj och välj Ch 1. Om du vill minimera filstorlekarna ställer du in Bildbehandling på Maximalt så att den maximala projektionsbilden sparas i stället för hela z-stacken.</li>
	<li>Klicka på BF/Ph-| Välj | Ch 2 för ljusfältskanalen.</li>
	<li>Klicka på uppspelningsknappen (leta efter den högerpekande triangelsymbolen) bredvid Lossa brunnsplattor och placera 384-brunnsplattan i mikroskopet.</li>
	<li>Under 3D Fluorescence Acquisition klickar du på Testa och väljer en brunn som innehåller maskar för att bestämma det optimala växlingsavståndet vid vilket maskarna är centrerade korrekt. Ställ in Ascending Distance till 50 μm, Descending Distance till -50 μm och Slicing Interval till 2 μm för att fånga hela tjockleken på djuren i z-stacken.</li>
	<li>Optimera exponeringstiden för att få en bra signalintensitet för alla fyra stammarna samtidigt som mättnad undviks. Använd samma exponeringstid för alla stammar och tidpunkter.</li>
	<li>Välj de brunnar som ska avbildas under Well Plate Scan Setting. Välj Kakel och skaffa hela brunnen.</li>
	<li>Spara mätinställningen och starta experimentet genom att klicka på Starta mätning. För efterföljande tidspunkter, öppna samma mätinställning och justera växlingsavståndet och brunnarna som ska avbildas.</li>
</ol>4. Sy kaklade bilder i ImageJ
OBS: Detta steg krävs endast när du använder ett mål som är större än 4x, för vilket bilden av varje brunn förvärvas som flera paneler. I detta analysarbetsflöde utförs sömnad av plattorna med hjälp av den fria programvaran FIJI/ImageJ19 (Figur 2). Beroende på vilket instrument som används i steg 3 kan det också vara möjligt att utföra sömnad direkt i den medföljande programvaran.
<ol><li>Ladda ner FIJI20 och öppna den.</li>
	<li>Gå till Plugins | Sömmar | Rutnät/kollektionssömmar21.</li>
	<li>I popup-fönstret, Grid/Collection Stitching, väljer du typ och ordning med vilken panelerna samlades in. Välj Rutnät: rad för rad och Höger och Nedåt.</li>
	<li>I nästa fönster, Rutnätssöm: Rutnät: rad för rad, Höger och nedåt, infoga antalet paneler i x- och y-riktningar. För det 10x-mål som används här väljer du 2 som rutnätsstorlek x, 3 som rutnätsstorlek y och 0 som panelöverlappning.</li>
	<li>Klicka på Bläddra och välj mappen som innehåller TIFF-bilderna som ska sys.</li>
	<li>Infoga det gemensamma filnamnet under Filnamn för paneler med {i} i positionen för panelnumret i varje filnamn.</li>
	<li>Avmarkera alla rutor nedan.</li>
	<li>Kör plugin-programmet.</li>
	<li>Spara de resulterande bilderna som TIFF-filer för analys i nästa steg.</li>
</ol>5. Automatiserad inkluderingsräkning med CellProfiler22
<ol><li>Ladda ner och installera bildanalysprogramvaran med öppen källkod, CellProfiler23. Ladda ned pipelinen InclusionCounting.cpproj från github.com/sinnigelab/aggregate-quantification.</li>
	<li>Öppna CellProfiler och dra pipelinen till fönstret Släpp en pipelinefil här. Klicka på Ja för att läsa in projektet.</li>
	<li>Klicka på modulen Bilder inmatning och dra de sydda bilderna till fönstret Släpp filer och mapp här.</li>
	<li>Klicka på modulen Metadatainmatning . Justera reguljärt uttryck för att extrahera från filnamn enligt namnen på de sammanfogade bilderna.</li>
	<li>Klicka på indatamodulen NamesandTypes och justera Välj regelvillkoren så att de matchar kanalerna i filnamnen. I standardinställningarna för pipelinen identifieras filnamn som innehåller BF som ljusfältsbilder och får namnet Worms. Filnamn som innehåller YFP känns igen som fluorescensbilder och heter Fluorescens.</li>
	<li>Klicka på Visa utdatainställningar för att välja en standardmapp för att spara utdata från CellProfiler.</li>
	<li>Klicka på Starta testläge för att kontrollera inställningarna för pipelinen med hjälp av den första bilddatauppsättningen. Klicka på Kör för att köra igenom alla moduler i pipelinen eller Steg för att köra pipelinen en modul i taget. För att justera maskkonturerna i modulen EditObjectsManually , klicka på Hjälp för att se instruktionerna och klicka på Klar för att fortsätta köra pipelinen. OBS: De extraherade mätningarna exporteras inte i testläge. Tröskelvärdesparametrarna för att upptäcka maskar och inneslutningar kan behöva justeras baserat på de stammar och förstoring som används.</li>
	<li>Klicka på Avsluta testläge och analysera bilder.</li>
	<li>Öppna utdatamappen för att visa utdatafilerna. Öppna bilderna med det ursprungliga filnamnet följt av konturer för att kontrollera om maskarna och inneslutningarna var korrekt överlagrade. OBS: Antalet inneslutningar per mask finns i filen med namnet ExpandedWormObjects. Mer information om indatabilderna finns i filen med namnet Image. Ytterligare utdata kan väljas i modulen ExportToSpreadsheet i pipelinen.</li>
</ol>6. Global anpassning av inkluderingsdata med AmyloFit5
OBS: Detta steg kan endast utföras när data för flera proteinkoncentrationer finns tillgängliga. För Q40-YFP har en uppsättning av fyra stammar med olika nivåer av överuttryck i muskelcellerna i kroppsväggen skapats tidigare17. I andra fall bör nya stammar genereras med hjälp av plasmidmikroinjektion och genomisk integration24.
<ol><li>Gå till den kostnadsfria online-anpassningsplattformen för aggregeringskinetik AmyloFit25. Registrera dig eller logga in med ett befintligt konto. OBS: En omfattande manual om hur du använder AmyloFit kan nås för ytterligare hjälp. Se länken längst upp till vänster på webbsidan (efter inloggning) för mer information.</li>
	<li>För att börja använda AmyloFit, namnge projektet och klicka på Skapa projekt. Öppna projektet genom att klicka på Öppna och skapa en session genom att ge den ett namn och klicka på Skapa & ladda session.</li>
	<li>Klicka på Lägg till data och ladda upp filen som innehåller det genomsnittliga antalet inneslutningar per djur, enligt kraven för dataformat som visas i den vänstra panelen. Klicka på Läs in nya data.</li>
	<li>Hoppa över förbearbetningsstegen, som inte krävs för inkludering av räkningsdata, genom att ställa in antalet punkter till genomsnittet över för nollpunktsförskjutning och antalet punkter till genomsnittet över för platå till 0. Klicka på Skicka. Upprepa detta steg för varje proteinkoncentration (dvs. varje kolumn i den uppladdade filen).</li>
	<li>Välj Anpassad i modellpanelen, ange Ncells*(1-exp(-Kcell*m**(n)*(t-1))) i ekvationsrutan och klicka på Läs in modell. OBS: Eftersom AmyloFit ursprungligen designades för analys av kinetiska data från in vitro-analyser, måste en skräddarsydd modell laddas för att analysera inkluderingsdata för C. elegans. I ekvationen som används här är N-celler antalet celler i vilka inklusionsbildning äger rum, K-cellen är kärnbildningshastighetskonstanten, m den intracellulära proteinkoncentrationen och n reaktionsordningen för kärnbildning.</li>
	<li>Ange parametertyperna till Global Const för N-celler, Global passform för K-cell och n och Const för m. Ställ in värdet på N-celler till 95 för muskelceller i kroppsväggen och Initial gissning för K-cell och n till 1. Ange värdena på m för de olika stammarna i den vänstra panelen. OBS: Initiala gissningar är inte relevanta för den relativt enkla modellen som används här. För mer komplexa modeller är det fördelaktigt att ange en uppskattning av de förväntade värdena för att förkorta beräkningstiden.</li>
	<li>Lämna antalet handfatshopp oförändrat och klicka på Anpassa i monteringspanelen.</li>
	<li>Extrahera passformen genom att klicka på Ladda ned data och Anpassa. OBS: Parametrarna som extraheras av modellens globala passform kommer att listas i det nedre högra hörnet. Ett diagram över data och passform genereras automatiskt i den övre högra panelen. Denna plot kan extraheras genom att klicka på Ladda ner pdf och anpassas genom att gå till Visa plotalternativ. K-cell har enheter av molekyler koncentration-n tid-1 cell-1. För att jämföra värden med olika n kan K-cell omvandlas till kärnbildningshastigheten vid en given proteinkoncentration genom att multiplicera den med mn.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+state+and+its+association+with+protein+misfolding+diseases.">The amyloid state and its association with protein misfolding diseases.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).</li><li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+amyloid+formation,+and+human+disease:+a+summary+of+progress+over+the+last+decade.">Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: a summary of progress over the last decade.</a> Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).</li><li>Knowles, T. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analytical+solution+to+the+kinetics+of+breakable+filament+assembly.">An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly.</a> Science. 326 (5959), 1533-1537 (2009).</li><li>Cohen, S. I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+amyloid-&#946;42+aggregates+occurs+through+a+secondary+nucleation+mechanism.">Proliferation of amyloid-&#946;42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9758-9763 (2013).</li><li>Meisl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+protein+aggregation+from+global+fitting+of+kinetic+models.">Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models.</a> Nature Protocols. 11 (2), 252-272 (2016).</li><li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li><li>Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+proteins+at+the+pathogenic+threshold+display+neuron-specific+aggregation+in+a+pan-neuronal+Caenorhabditis+elegans+model.">Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model.</a> Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Prahlad, V., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+regulates+the+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+misfolded+proteins.">Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14204-14209 (2011).</li><li>Nollen, E. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation.">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li><li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screening+strategy+identifies+novel+regulators+of+the+proteostasis+network.">A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network.</a> PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).</li><li>Brehme, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperome+subnetwork+safeguards+proteostasis+in+aging+and+neurodegenerative+disease.">A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease.</a> Cell Reports. 9, 1-16 (2014).</li><li>Calamini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+proteostasis+regulators+for+protein+conformational+diseases.">Small-molecule proteostasis regulators for protein conformational diseases.</a> Nature Chemical Biology. 8 (2), 185-196 (2012).</li><li>Sinnige, T., Stroobants, K., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+studies+of+protein+misfolding+and+aggregation+in+in+vivo+models+of+Alzheimer's+and+Parkinson's+diseases.">Biophysical studies of protein misfolding and aggregation in in vivo models of Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 49, 22 (2020).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model.">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7, 13023 (2016).</li><li>Sinnige, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+reveals+that+independent+nucleation+events+determine+the+progression+of+polyglutamine+aggregation+in+C.+elegans.">Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 202188118 (2021).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans.">Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>. FIJI/ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/downloads">https://imagej.net/downloads</a> (2012)</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions.">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li><li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+free,+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis.">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> BioTechniques. 42 (1), 71-75 (2007).</li><li>CellProfiler. Broad Institute Available from: <a target="_blank" href="https://cellprofiler.org/releases">https://cellprofiler.org/releases</a> (2021)</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>. Knowles group, University of Cambridge Available from: <a target="_blank" href="https://amylofit.com/amylofitmain/login/">https://amylofit.com/amylofitmain/login/</a> (2021)</li><li>Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+tissue-specific+proteostatic+decline+in+Caenorhabditis+elegans.">Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), (2021).</li><li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset.">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).</li><li>Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+enhances+the+heat+shock+response+and+decreases+polyglutamine+aggregation+in+an+HSF-1-dependent+manner+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 141-142, 1-4 (2014).</li><li>David, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+protein+aggregation+as+an+inherent+part+of+aging+in+C.+elegans.">Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans.</a> PLoS Biology. 8 (8), 47-48 (2010).</li><li>Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+sieve:+A+low-tech+instrument+and+methodology+for+sorting+small+multicellular+organisms.">Caenorhabditis sieve: A low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).</li><li>Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours.">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73 (2018).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+and+long-term+immobilization+in+a+hydrogel-microbead+matrix+for+high-resolution+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+and+other+small+organisms.">Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms.</a> PLoS One. 13 (3), 0193989 (2018).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Metoden som presenteras här underlättar en opartisk och kvantitativ analys av proteinaggregeringskinetiken i modellorganismen C. elegans. Det beror på fyra nyckelelement (figur 1): 1) upprätthålla en ålderssynkroniserad population av nematoder; 2) fluorescensmikroskopi i multiwellplattor; 3) automatiserad inkluderingsräkning i CellProfiler; 4) datapassning i AmyloFit. Jämfört med manuell räkning av inneslutningar i fritt rörliga djur eller från sparade bilder26 är kvantifieringen i CellProfiler både snabbare och mer opartisk. Den andra viktiga utvecklingen av protokollet är förvärvet av kinetiska data, snarare än enskilda tidpunkter, vilket ger kvantitativa insikter i aggregeringsmekanismen vid anpassning av data till en matematisk modell.
De fyra elementen i protokollet kan användas som oberoende moduler som kan ändras beroende på applikation. Ålderssynkroniserade populationer kan också upprätthållas med hjälp av 5-fluor-2′-deoxyuridin (FUDR) för att sterilisera djuren. Denna förening påverkar livslängden och proteostasen24,25 och är mycket cancerframkallande för experimenteraren; Det utesluter dock manuell överföring av maskarna, vilket kan vara arbetsintensivt när stora antal hanteras. Andra alternativ är användning av sterila mutanter29 eller filtreringsanordningar för att separera avkommor30.
Fluorescensmikroskopisteget kan också justeras, till exempel med hjälp av högre förstoringar för att övervaka proteinaggregering i neuroner. Widefield-mikroskopi kan vara tillräcklig för att övervaka polyQ-aggregering i muskelceller när den relativa skillnaden mellan tillstånd är viktigare än det absoluta antalet inneslutningar. CellProfiler-pipelinen kan fortfarande användas i dessa fall, även om inställningarna för att känna igen maskar och inneslutningar måste justeras av användaren. Teknikens genomströmning begränsas för närvarande av behovet av manuell plockning av djuren i 384-brunnsplattan. Detta kan eventuellt åtgärdas genom användning av mikrofluidiska anordningar16. Natriumazid är ett relativt hårt bedövningsmedel, som kan ersättas med fysisk immobilisering med hydrogeler eller pärlor28,29.
Analysen i AmyloFit som presenteras här är baserad på en aggregeringsmekanism bestående av oberoende kärnbildningshändelser i enskilda celler. I de fall där denna modell inte passar bör användaren överväga ett alternativ, t.ex. den kooperativa aggregeringsmodell som utvecklats tidigare17. En begränsning av detta tillvägagångssätt är att stammar som uttrycker proteinet av intresse vid olika koncentrationer måste vara tillgängliga, även om dessa kan genereras med hjälp av rutinmässiga C. elegans-metoder 24.
Sammantaget ger detta protokoll möjlighet att erhålla högkvalitativa data för proteinaggregeringskinetik i ett in vivo-modellsystem , vilket möjliggör detaljerad analys av aggregeringsmekanismer17. Även om metoden demonstrerades för polyQ-aggregering i C. elegans muskelvävnad, kan framtida tillämpningar av protokollet innefatta andra proteiner och vävnader och effekterna av proteostasfaktorer och små molekyler.

Uppsamlingen av felveckade proteiner i olösliga avlagringar sker i ett brett spektrum av sjukdomar. Välkända exempel är aggregeringen av amyloid-β och tau vid Alzheimers sjukdom, α-synuklein vid Parkinsons sjukdom och huntingtin med expanderad polyQ vid Huntingtons sjukdom 1,2. Felveckningen av dessa polypeptider till amyloidfibriller är associerad med toxicitet och celldöd av mekanismer som fortfarande till stor del är oklara. Att belysa mekanismerna för amyloidbildning kommer att vara avgörande för att utveckla effektiva terapier, som för närvarande inte är tillgängliga.
Detaljerade undersökningar av amyloidbildning har utförts in vitro baserat på tioflavin T-fluorescensmätningar, vilket leder till en mekanistisk förståelse av aggregeringsprocessen och effekten av hämmande molekyler 3,4,5. Det är emellertid inte klart om samma aggregeringsmekanismer gäller i den komplexa miljön hos levande celler och organismer. Nematodmasken Caenorhabditis elegans är en lämplig modellorganism för att studera proteinaggregering in vivo. Den har en relativt enkel anatomi men består av flera vävnader, inklusive muskler, tarmar och ett nervsystem. Det är genetiskt väl karakteriserat, och verktyg för genetisk modifiering är lättillgängliga. Dessutom har den en kort generationstid på ~ 3 dagar och en total livslängd på 2-3 veckor. Som sådan kan proteinaggregering undersökas över djurets livslängd på en experimentellt lämplig tidsskala. Slutligen är nematoden optiskt transparent, vilket möjliggör spårning av aggregeringen av fluorescerande märkta proteiner i levande djur.
Dessa egenskaper hos C. elegans har tidigare utnyttjats för att undersöka aggregeringen av polyQ-proteiner som en modell för Huntingtons och andra polyQ-expansionssjukdomar. Över det patogena tröskelvärdet på 35-40 glutaminrester kan polyQ-proteinerna märkta med gult fluorescerande protein (YFP) observeras för att bilda olösliga inneslutningar i muskelvävnaden 6,7, neuroner8 och tarmen 9,10. Dessa egenskaper har använts i stor utsträckning för att screena för gener 11,12,13 och småmolekylära modifierare14 av proteinaggregering och toxicitet.
C. elegans har potential att spela en viktig roll för att överbrygga klyftan mellan in vitro-studier av proteinaggregering och mer komplexa sjukdomsmodeller som möss15. C. elegans är mottaglig för läkemedelsscreening16 men kan också utnyttjas för att få en grundläggande förståelse för de molekylära mekanismerna för proteinaggregering in vivo, vilket nyligen visades17. För båda tillämpningarna är det dock av största vikt att extrahera ett kvantitativt och reproducerbart mått på proteinaggregering. Här uppnås detta med hjälp av ett konfokalmikroskop med hög genomströmning i kombination med en dedikerad bildanalyspipeline (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Black with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmyloFit</td>
			<td>Knowles lab</td>
			<td>v2.0</td>
			<td>Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line A</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1228</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line B</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1229</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line C</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1230</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans Q40 line D</td>
			<td>Morimoto lab</td>
			<td>AM1231</td>
			<td>Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>4.1.3</td>
			<td>Downloaded from https://cellprofiler.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>Open-source</td>
			<td>(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j</td>
			<td>Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-throughput confocal microscope</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager CV8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td>&#160;17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>WU Mainz</td>
			<td>250</td>
			<td>To make worm pick, 150 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum iridium wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>39383</td>
			<td>To make worm pick, 0.25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein aggregation kinetics in vivo using automated inclusion counting in caenorhabditis elegans

Proteinaggregering i olösliga inneslutningar är ett kännetecken för en mängd olika mänskliga sjukdomar, varav många är åldersrelaterade. Nematoden Caenorhabditis elegans är en väletablerad modellorganism som har använts i stor utsträckning inom området för att studera proteinaggregering och toxicitet. Dess optiska transparens möjliggör direkt visualisering av proteinaggregering genom fluorescensmikroskopi. Dessutom gör den snabba reproduktionscykeln och den korta livslängden nematoden till en lämplig modell för att screena för gener och molekyler som modulerar denna process.
Kvantifieringen av aggregerad belastning hos levande djur är emellertid dåligt standardiserad, vanligtvis utförd genom manuell inkluderingsräkning under ett fluorescensdissektionsmikroskop vid en enda tidpunkt. Den här metoden kan resultera i stor variation mellan observatörer och begränsar förståelsen för aggregeringsprocessen. Däremot övervakas amyloidliknande proteinaggregering in vitro rutinmässigt av tioflavin T-fluorescens på ett mycket kvantitativt och tidsupplöst sätt.
Här presenteras en analog metod för opartisk analys av aggregeringskinetik i levande C. elegans, med hjälp av ett konfokalmikroskop med hög genomströmning kombinerat med skräddarsydd bildanalys och dataanpassning. Tillämpligheten av denna metod demonstreras genom övervakning av inklusionsbildning av ett fluorescerande märkt polyglutamin (polyQ) protein i kroppens väggmuskelceller. Arbetsflödet för bildanalys gör det möjligt att bestämma antalet inneslutningar vid olika tidpunkter, som är anpassade till en matematisk modell baserad på oberoende kärnbildningshändelser i enskilda muskelceller. Den metod som beskrivs här kan visa sig vara användbar för att bedöma effekterna av proteostasfaktorer och potentiella behandlingar för proteinaggregeringssjukdomar hos ett levande djur på ett robust och kvantitativt sätt.

Metoden som beskrivs här (figur 1) användes för att analysera aggregeringskinetiken hos en konstruktion bestående av 40 glutaminer smälta till YFP (Q40-YFP). Proteinet uttrycks under kontroll av unc-54-promotorn , vilket driver uttryck i kroppens väggmuskelceller. Eftersom dessa är relativt stora och lätta att visualisera är användningen av ett 10x mål tillräckligt för att lösa de inneslutningar som bildas av Q40-YFP i denna vävnad. Fyra stammar (linjerna A-D) har tidigare utvecklats som uttrycker proteinet i olika utsträckning för att bedöma koncentrationsberoendet av polyQ-aggregering in vivo17.
Ålderssynkronerade populationer av linjerna A-D genererades av en 2 h äggläggning, följt av daglig överföring när avkomman nådde vuxen ålder. Från dag 1 till dag 10 i vuxen ålder avbildades 20 djur från var och en av de fyra stammarna i en 384-brunnsplatta med hjälp av ett konfokalmikroskop med hög genomströmning. Bilderna av brunnarna förvärvades som 6 plattor, som sys ihop med hjälp av ett plugin i ImageJ21 (figur 2). De sydda bilderna analyserades därefter med hjälp av en skräddarsydd CellProfiler22-pipeline (figur 3) för att kvantifiera det genomsnittliga inkluderingsantalet per djur för varje stam och tidpunkt.
Datan anpassades sedan till en matematisk modell i AmyloFit5 (figur 4). Modellen bygger på antagandet att var och en av de 95 muskelcellerna i kroppsväggen oberoende förvärvar en inkludering genom en hastighetsbegränsande kärnbildningshändelse, följt av snabb aggregerad tillväxt17. Passformen gav en kärnbildningshastighetskonstant på 9,9 × 105 molekyler M-2,1 d-1 cell-1 och en reaktionsordning på 2,1, motsvarande en kärnbildningshastighet av 0,38 molekyler d-1 cell-1 vid en intracellulär proteinkoncentration av 1 mM. Två oberoende biologiska replikat ledde till nära motsvarande värden för kärnbildningshastigheten och reaktionsordningen, vilket är i överensstämmelse med en tidigare studie med ett liknande protokoll17 (tabell 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig01v2.jpg"> Figur 1: Schematisk översikt över metoden. (A) Ålderssynkronerade C. elegans-populationer genereras av en tidsbunden äggläggning. (B) Djur från samma population avbildas i en 384-brunnsplatta vid olika tidpunkter. (C) Plattorna sys ihop för att bilda bilder av hela brunnarna, som analyseras i CellProfiler för att kvantifiera inkluderingsnumren per djur. (D) Data är anpassade till en matematisk modell med AmyloFit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig01largev2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig02.jpg"> Figur 2: Skärmdumpar av sömnadsproceduren i ImageJ med plugin Grid/Collection stitching21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig03.jpg"> Figur 3: Schematisk över CellProfiler-pipelinen för att kvantifiera inklusionsnummer. (A-C) Ljusfältsbilden (A) används för att identifiera maskarna (B, närbild i C). (D-G) Fluorescensbilden (D, närbild i E) används för att identifiera inneslutningarna (F). Maskarna och inneslutningarna är relaterade till att ge antalet inneslutningar för varje mask i brunnen (G). Bilderna som visas är av Q40 linje A djur vid dag 3 av vuxen ålder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63365/63365fig04.jpg"> Figur 4: Anpassa data till en matematisk modell i AmyloFit. (A) Data laddas upp till AmyloFit. (B) En anpassad ekvation anges för att modellera inkluderingsbildning, förutsatt oberoende kärnbildningshändelser i varje cell. (C) Anpassning av aggregeringskinetiken för C. elegans-linjerna A-D som uttrycker olika nivåer av Q40-YFP. Uppgifterna är representativa för två oberoende biologiska replikat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63365/63365fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Datauppsättning 1</td>
			<td>Datauppsättning 2</td>
			<td>Sinnige et al.17
</td>
		</tr>
<tr>
<td>n</td>
			<td>2.1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>K-cell (molekyler M-n d-1 cell-1)</td>
			<td>9,9 x 105
</td>
			<td>1,4 x 105
</td>
			<td>3,1 x 104
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kärnbildningshastighet vid 1 mM (molekyler d-1 cell-1)</td>
			<td>0.38</td>
			<td>0.21</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Värden för kärnbildningshastigheten och reaktionsordningen för Q40-YFP-aggregering. Data för två oberoende biologiska replikat av protokollet och jämförelse med tidigare publicerade data17.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Här presenteras en metod för analys av proteinaggregeringskinetik i nematoden Caenorhabditis elegans. Djur från en ålderssynkronerad population avbildas vid olika tidpunkter, följt av halvautomatisk inkluderingsräkning i CellProfiler och anpassning till en matematisk modell i AmyloFit.

Övervakning av proteinaggregeringskinetik in vivo med hjälp av automatiserad inkluderingsräkning i Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Mekanismerna för proteinaggregering har hittills undersökts mestadels in vitro. Med vårt protokoll kan vi göra liknande kvantitativa studier i modellorganismen C.elegans. Den största fördelen med vår metod är den opartiska kvantifieringen av inkluderingsnummer.Och genom att anpassa dessa högkvalitativa data till matematiska modeller kan vi få insikter i aggregeringsmekanismen. Proteinaggregering förekommer i många sjukdomar, inklusive Alzheimers och Huntingtons sjukdom. Att förstå den molekylära mekanismen för proteinaggregering in vivo är avgörande för att utveckla nya terapier.Börja med att placera 10 vuxna nematoder på en 6 cm fröad NGM-platta med en platinamaskplockning för att utföra en synkroniserad äggläggning. Låt de vuxna lägga ägg i ungefär två timmar vid 20 C innan de tas bort från plattan. Placera plattorna med ägg i inkubatorn vid 20 C.Övervaka djurens utveckling tills de når vuxen ålder ungefär den tredje dagen efter äggläggningen.Förbered 384-brunnsplattan genom att fylla det önskade antalet brunnar med 100 liter M9-buffert kompletterad med 25 mM natriumazid som bedövningsmedel. Fyll en brunn per stam som ska avbildas. För varje stam, överför 20 djur till en brunn med en platinamaskplockning.Täck plattan med locket till förebyggande avdunstning och avbilda plattan inom en timme efter beredningen. Slå på instrumentet och öppna programvaran. Klicka på Play-knappen bredvid Lossa brunnsplattor och placera 384-brunnsplattan i mikroskopet.Under Åtgärdslista och 3D-fluorescensförvärv klickar du på Testa och väljer brunnen som innehåller maskar. Ställ in Bildbehandling på Ingen. Och klicka på Play-knappen för att bestämma det optimala växlingsavståndet där maskarna är centrerade korrekt.Ställ in Stigande avstånd på 50 m, Fallande avstånd till 50 m och Skivintervall till 2 m för att fånga hela tjockleken på djuren i z-stacken. Ställ in Bildbehandling tillbaka till Maximalt. Välj de brunnar som ska avbildas under Well Plate Scan Setting.Och välj sedan Tile och Acquire Whole Well. Spara mätinställningen. Och klicka på Starta mätning för att starta experimentet.Öppna CellProfiler och dra pipelinen till fönstret Släpp en pipelinefil här. Klicka på Ja för att läsa in projektet. Dra sedan de sydda bilderna till fönstret Släpp filer och mapp här.Klicka på modulen Metadatainmatning. Justera reguljärt uttryck för att extrahera från filnamn enligt namnen på de sammanfogade bilderna. Klicka på indatamodulen NamesAndTypes och justera Välj regelvillkoren så att de matchar kanalerna i filnamnen.Klicka sedan på Utdatainställningar för att välja en mapp för att spara utdata från CellProfiler. Klicka på Starta testläge för att kontrollera inställningarna för pipelinen med hjälp av den första bilddatauppsättningen. Klicka på Steg för att köra igenom pipelinen, en modul i taget.För att justera maskkonturerna, klicka på Visa hjälp i modulen EditObjectsManually för att se instruktionerna. Korrigera konturerna. Och klicka sedan på Klar för att fortsätta köra pipelinen.Klicka på Avsluta testläge och analysera bilder. Öppna utdatamappen för att visa utdatafilerna. Och öppna bilderna med det ursprungliga filnamnet följt av konturer för att kontrollera om maskarna och inneslutningarna var korrekt överlagrade.För att börja använda AmyloFit, namnge projektet och klicka på Skapa projekt. Klicka på Öppna för att öppna den. Och skapa en session genom att ge den ett namn och klicka på Skapa och ladda session.Klicka på Lägg till data och ladda upp filen som innehåller det genomsnittliga antalet inneslutningar per djur, enligt kraven på dataformat som visas i den vänstra panelen. Klicka sedan på Ladda nya data. Ange Antal punkter till genomsnitt över för nollpunktsförskjutning till 0 och ange Antal punkter till genomsnitt över för platå till 0 för att hoppa över förbearbetningsstegen, som inte krävs för inkludering av räkningsdata.Klicka sedan på Skicka. Upprepa detta steg för varje proteinkoncentration. Välj Anpassad på panelen Modell.Ange ekvationen för oberoende kärnbildning i rutan Ekvation. Och klicka på Ladda modell. För Ncells anger du parametertypen till Global Constant och ställer in Value till 95, vilket motsvarar antalet muskelceller i kroppsväggen.Ställ in parametertyperna på Global passform för Kcell och n. Och till Konstant för m. Ange värdena på m för de olika stammarna i den vänstra panelen.Lämna antalet handfatshopp oförändrade och klicka på Anpassa i panelen Anpassning. Slutligen extrahera passformen genom att klicka på Ladda ner data och anpassa. Inklusionsnumren övervakades i fyra C.elegans-stammar som uttryckte olika Q40-koncentrationer.Den oberoende kärnbildningsmodellen beskriver aggregeringskinetiken väl. Passformen gav en reaktionsordning på 2,1 och en kärnbildningshastighet på 0,38 molekyler per dag per cell vid en intracellulär proteinkoncentration av 1 mM. Två oberoende biologiska replikat i en tidigare studie visade nära motsvarande värden för reaktionsordningen och kärnbildningshastigheten.En sak som bör hållas i åtanke är att du behöver högkvalitativa dataset för flera proteinkoncentrationer för att få tillförlitliga passformer. Denna metod kan användas för att hitta sätt att störa proteinaggregering i en levande organism, såsom genetiska knockdowns eller småmolekylära behandlingar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Växande proteinkristaller med olika dimensioner med automatiserad kristallisering tillsammans med In Situ det dynamiska ljusspridning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Utvärdering av effekten av Protein Aggregation på cellulära oxidativ Stress i jäst

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskaliga kolorimetriska analyser av intracellulära laktat och pyruvat i den nematoder Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Tallrik-baserade storskalig odling av Caenorhabditis elegans: provberedning för studie av metabola förändringar i Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo kalcium avbildning i C. elegans kropps vägg muskler

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Tillämpning av Biolayer interferometri (BLI) för att studera protein-proteininteraktioner vid transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Syntes av en Deuterat standard för kvantifiering av 2-Arachidonoylglycerol i Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vi

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...