Name: de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data
Uploaded: 2022-02-18T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data at JoVE.com

يود المؤلفون أن ينوه بالدعم المقدم من الموارد الحسابية التي توفرها منصة HPCC بجامعة شيان جياوتونغ. Z.X. بامتنان خطة دعم المواهب الشابة من الدرجة الأولى من جامعة شيان جياوتونغ.

1. إعداد البيئة وتثبيت RiboCode
<ol><li>افتح نافذة محطة Linux الطرفية وقم بإنشاء بيئة conda: كوندا إنشاء -n ريبوكود بيثون = 3.8
</li>
	<li>التبديل إلى البيئة التي تم إنشاؤها وتثبيت RiboCode والتبعيات: conda تنشيط RiboCode كوندا تثبيت -c بيوكوندا ريبوكود ريبومينر sra-tools fastx_toolkit cutadapt القوس نجمة samtools
<...

<ol>
	<li>Eisenberg, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+Initiation+Site+Profiling+Reveals+Widespread+Synthesis+of+Non-AUG-Initiated+Protein+Isoforms+in+Yeast.">Translation Initiation Site Profiling Reveals Widespread Synthesis of Non-AUG-Initiated Protein Isoforms in Yeast.</a> Cell Systems. 11 (2), 145-160 (2020).</li><li>Spealman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+non-AUG+uORFs+revealed+by+a+novel+regression+analysis+of+ribosome+profiling+data.">Conserved non-AUG uORFs revealed by a novel regression analysis of ribosome profiling data.</a> Genome Research. 28 (2), 214-222 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147 (4), 789-802 (2011).</li><li>Bazzini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+ORFs+in+vertebrates+using+ribosome+footprinting+and+evolutionary+conservation.">Identification of small ORFs in vertebrates using ribosome footprinting and evolutionary conservation.</a> The EMBO Journal. 33 (9), 981-993 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell Reports. 8 (5), 1365-1379 (2014).</li><li>Chew, G. L., Pauli, A., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+uORF+repressiveness+and+sequence+features+in+mouse,+human+and+zebrafish.">Conservation of uORF repressiveness and sequence features in mouse, human and zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 11663 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genome-wide+distribution+and+evolution+of+uORFs+in+eukaryotes.">Determinants of genome-wide distribution and evolution of uORFs in eukaryotes.</a> Nature Communications. 12 (1), 1076 (2021).</li><li>Guenther, U. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+helicase+Ded1p+controls+use+of+near-cognate+translation+initiation+codons+in+5'+UTRs.">The helicase Ded1p controls use of near-cognate translation initiation codons in 5' UTRs.</a> Nature. 559 (7712), 130-134 (2018).</li><li>Goldsmith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+a+functional+role+for+autophagy+in+mRNA+translational+control.">Ribosome profiling reveals a functional role for autophagy in mRNA translational control.</a> Communications Biology. 3 (1), 388 (2020).</li><li>Magny, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+regulation+of+cardiac+calcium+uptake+by+peptides+encoded+in+small+open+reading+frames.">Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames.</a> Science. 341 (6150), 1116-1120 (2013).</li><li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Molecular Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress.">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li><li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes.">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biology. 16, 90 (2015).</li><li>Chng, S. C., Ho, L., Tian, J., Reversade, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELABELA:+a+hormone+essential+for+heart+development+signals+via+the+apelin+receptor.">ELABELA: a hormone essential for heart development signals via the apelin receptor.</a> Developmental Cell. 27 (6), 672-680 (2013).</li><li>Pauli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toddler:+an+embryonic+signal+that+promotes+cell+movement+via+Apelin+receptors.">Toddler: an embryonic signal that promotes cell movement via Apelin receptors.</a> Science. 343 (6172), 1248636 (2014).</li><li>Stark, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+functional+elements+in+12+Drosophila+genomes+using+evolutionary+signatures.">Discovery of functional elements in 12 Drosophila genomes using evolutionary signatures.</a> Nature. 450 (7167), 219-232 (2007).</li><li>Lin, M. F., Jungreis, I., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhyloCSF:+a+comparative+genomics+method+to+distinguish+protein+coding+and+non-coding+regions.">PhyloCSF: a comparative genomics method to distinguish protein coding and non-coding regions.</a> Bioinformatics. 27 (13), 275-282 (2011).</li><li>Slavoff, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+discovery+of+short+open+reading+frame-encoded+peptides+in+human+cells.">Peptidomic discovery of short open reading frame-encoded peptides in human cells.</a> Nature Chemical Biology. 9 (1), 59-64 (2013).</li><li>Schwaid, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+discovery+of+cysteine-containing+human+short+open+reading+frames.">Chemoproteomic discovery of cysteine-containing human short open reading frames.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (45), 16750-16753 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation+and+quantitation+of+translation+by+ribosome+profiling.">Genome-wide annotation and quantitation of translation by ribosome profiling.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 1-19 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Xiao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+annotation+and+characterization+of+the+translatome+with+ribosome+profiling+data.">De novo annotation and characterization of the translatome with ribosome profiling data.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 61 (2018).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF3+Associates+with+80S+Ribosomes+to+Promote+Translation+Elongation,+Mitochondrial+Homeostasis,+and+Muscle+Health.">eIF3 Associates with 80S Ribosomes to Promote Translation Elongation, Mitochondrial Homeostasis, and Muscle Health.</a> Molecular Cell. 79 (4), 575-587 (2020).</li><li>. AGAT: Another Gff Analysis Toolkit to handle annotations in any GTF/GFF format Available from: <a target="_blank" href="https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html">https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html</a> (2020)</li><li>. Gene Expression Omnibus Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo">https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo</a> (2002)</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>. STAR manual Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf">https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf</a> (2022)</li><li>. The genetic codes Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi</a> (2019)</li><li>. RiboMiner Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboMiner">https://github.com/xryanglab/RiboMiner</a> (2020)</li><li>Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+global+views+of+translation.">Ribosome profiling: global views of translation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), 032698 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+translation+initiation+sites+in+mammalian+cells+at+single-nucleotide+resolution.">Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+initiating+ribosomes+in+vivo.">Quantitative profiling of initiating ribosomes in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 147-153 (2015).</li><li>Spealman, P., Naik, A., McManus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uORF-seqr:+A+Machine+Learning-Based+approach+to+the+identification+of+upstream+open+reading+frames+in+yeast.">uORF-seqr: A Machine Learning-Based approach to the identification of upstream open reading frames in yeast.</a> Methods in Molecular Biol. 2252, 313-329 (2021).</li><li>. RiboCode Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboCode">https://github.com/xryanglab/RiboCode</a> (2018)</li><li>Sharma, P., Wu, J., Nilges, B. S., Leidel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+and+other+commonly+used+model+organisms+are+resistant+to+cycloheximide-mediated+biases+in+ribosome+profiling+experiments.">Humans and other commonly used model organisms are resistant to cycloheximide-mediated biases in ribosome profiling experiments.</a> Nature Communications. 12 (1), 5094 (2021).</li></ol>

يوفر تنميط الريبوسوم فرصة غير مسبوقة لدراسة عمل الريبوسومات في الخلايا على نطاق الجينوم. يمكن أن يوفر فك رموز المعلومات التي تحملها بيانات التنميط الريبوسومي بدقة نظرة ثاقبة حول مناطق الجينات أو النصوص التي تترجم بنشاط. يوفر هذا البروتوكول خطوة بخطوة إرشادات حول كيفية استخدام RiboCode لتحلي...

في الآونة الأخيرة ، كشفت مجموعة متزايدة من الدراسات عن إنتاج واسع النطاق للببتيدات المترجمة من ORFs من جينات الترميز والجينات المشروحة سابقا على أنها غير مشفرة ، مثل الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNAs) 1،2،3،4،5،6،7،8. يتم تنظيم أو تحفيز هذه ORFs المترجمة بواسطة الخلايا للاستجابة للتغيرات البيئية والإجهاد وتمايز الخلايا1،8،9،10،11،12،13. وقد ثبت أن منتجات الترجمة لبعض الموارد المالية المفتوحة تلعب أدوارا تنظيمية هامة في العمليات البيولوجية المتنوعة في التنمية وعلم وظائف الأعضاء. على سبيل المثال ، اكتشف Chng et al.14 هرمون الببتيد المسمى Elabela (Ela ، المعروف أيضا باسم Abela / Ende / Toddler) ، وهو أمر بالغ الأهمية لتطور القلب والأوعية الدموية. اقترح باولي وآخرون أن إيلا يعمل أيضا كميتوجين يعزز هجرة الخلايا في جنين الأسماك المبكر15. أبلغ Magny et al. عن اثنين من الببتيدات الدقيقة التي تحتوي على أقل من 30 حمضا أمينيا تنظم نقل الكالسيوم وتؤثر على تقلص العضلات المنتظم في قلب ذبابة الفاكهة 10.
ولا يزال من غير الواضح عدد هذه الببتيدات التي يشفرها الجينوم وما إذا كانت ذات صلة بيولوجية. لذلك ، فإن التحديد المنهجي لهذه ORFs التي يحتمل أن تكون مشفرة أمر مرغوب فيه للغاية. ومع ذلك ، فإن التحديد المباشر لمنتجات هذه ORFs (أي البروتين أو الببتيد) باستخدام النهج التقليدية مثل الحفظ التطوري 16،17 وقياس الطيف الكتلي 18،19 يمثل تحديا لأن كفاءة الكشف عن كلا النهجين تعتمد على طول ووفرة وتكوين الأحماض الأمينية للبروتينات أو الببتيدات المنتجة. وقد وفر ظهور تنميط الريبوسوم، وهو تقنية لتحديد شغل الريبوسوم على الحمض النووي الريبوزي المرسال بدقة النوكليوتيدات، طريقة دقيقة لتقييم إمكانات الترميز للنسخ المختلفة3،20،21، بغض النظر عن طولها وتكوينها. ميزة مهمة وشائعة الاستخدام لتحديد ترجمة ORFs بنشاط باستخدام تنميط الريبوسوم هي دورية النيوكليوتيدات الثلاثة (3-nt) لآثار أقدام الريبوسوم على mRNA من كودون البداية إلى كودون التوقف. ومع ذلك ، غالبا ما تواجه بيانات التنميط الريبوسومي العديد من المشكلات ، بما في ذلك قراءات التسلسل المنخفضة والمتناثرة على طول ORFs ، وضوضاء التسلسل العالية ، وتلوث الحمض النووي الريبوسومي (rRNA). وبالتالي ، فإن الإشارات المشوهة والغامضة الناتجة عن هذه البيانات تضعف أنماط الدورية 3-nt لآثار أقدام الريبوسومات على الحمض النووي الريبوزي المرسال ، مما يجعل في نهاية المطاف تحديد ORFs المترجمة عالية الثقة أمرا صعبا.
قامت حزمة تسمى "RiboCode" بتكييف اختبار الرتبة المعدل الموقع من Wilcoxon واستراتيجية تكامل القيمة P لفحص ما إذا كان ORF يحتوي على شظايا محمية بالريبوسوم داخل الإطار (RPFs) أكثر بكثير من RPFs22 خارج الإطار. وقد ثبت أنه عالي الكفاءة وحساس ودقيق للتعليق التوضيحي الجديد للترانسلاتوم في بيانات التنميط الريبوسومي المحاكية والحقيقية. وهنا، نصف كيفية استخدام هذه الأداة للكشف عن عمليات ORFs المحتملة للترجمة من مجموعات بيانات تسلسل توصيف الريبوسوم الخام التي تم إنشاؤها بواسطة الدراسة السابقة23. وقد استخدمت مجموعات البيانات هذه لاستكشاف وظيفة الوحدة الفرعية EIF3 "E" (EIF3E) في الترجمة من خلال مقارنة ملامح إشغال الريبوسوم لخلايا MCF-10A المنقولة مع التحكم (si-Ctrl) و EIF3E (si-eIF3e) الحمض النووي الريبي الصغير التداخل (siRNAs). من خلال تطبيق RiboCode على مجموعات البيانات النموذجية هذه ، اكتشفنا 5,633 ORFs جديدة يحتمل أن تشفر الببتيدات الصغيرة أو البروتينات. تم تصنيف هذه ORFs إلى أنواع مختلفة بناء على مواقعها بالنسبة لمناطق الترميز ، بما في ذلك ORFs المنبع (uORFs) ، و ORFs في المصب (dORFs) ، و ORFs المتداخلة ، و ORFs من جينات ترميز البروتين الجديدة (PCGs الجديدة) ، و ORFs من الجينات الجديدة غير المشفرة للبروتين (NonPCGs الجديدة). زادت كثافات قراءة RPF على uORFs بشكل كبير في الخلايا التي تعاني من نقص EIF3E مقارنة بخلايا التحكم ، والتي قد تكون ناجمة جزئيا على الأقل عن إثراء الريبوسومات التي تترجم بنشاط. وأشار تراكم الريبوسوم الموضعي في المنطقة من الكودون 25 إلى 75 من الخلايا الناقصة EIF3E إلى وجود انسداد في استطالة الترجمة في المرحلة المبكرة. يوضح هذا البروتوكول أيضا كيفية تصور كثافة RPF للمنطقة المطلوبة لفحص أنماط الدورية 3-nt لآثار أقدام الريبوسوم على ORFs المحددة. تظهر هذه التحليلات الدور القوي ل RiboCode في تحديد ترجمة ORFs ودراسة تنظيم الترجمة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A computer/server running Linux</td>
			<td>Any</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaconda or Miniconda</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>-</td>
			<td>Anaconda: https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data

يعد تحديد إطارات القراءة المفتوحة (ORFs) ، وخاصة تلك التي تشفر الببتيدات الصغيرة ويتم ترجمتها بنشاط في سياقات فسيولوجية محددة ، أمرا بالغ الأهمية للتعليقات التوضيحية الشاملة للتراتيمات المعتمدة على السياق. يوفر التنميط الريبوسومي، وهو تقنية للكشف عن مواقع الارتباط وكثافات ترجمة الريبوسومات على الحمض النووي الريبوسومي، وسيلة لاكتشاف مكان حدوث الترجمة بسرعة على نطاق الجينوم الواسع. ومع ذلك ، فليست مهمة تافهة في المعلوماتية الحيوية تحديد ترجمة ORFs بكفاءة وشمولية لتنميط الريبوسوم. الموضح هنا هو حزمة سهلة الاستخدام ، تسمى RiboCode ، مصممة للبحث عن ترجمة نشطة ل ORFs من أي حجم من الإشارات المشوهة والغامضة في بيانات التنميط الريبوسومي. إذا أخذنا مجموعة البيانات المنشورة مسبقا كمثال، توفر هذه المقالة إرشادات خطوة بخطوة لخط أنابيب RiboCode بأكمله، بدءا من المعالجة المسبقة للبيانات الخام إلى تفسير ملفات نتائج الإخراج النهائي. وعلاوة على ذلك، ومن أجل تقييم معدلات ترجمة الموارد المفتوحة، يرد أيضا وصف مفصل لإجراءات تصور وتقدير كمي لكثافات الريبوسوم في كل إطار من أطر عمل الريبوسوم. باختصار ، هذه المقالة هي تعليمات مفيدة وفي الوقت المناسب لمجالات البحث المتعلقة بالترجمة ، و ORFs الصغيرة ، والببتيدات.

وقد أودع مثال مجموعات بيانات التنميط الريبوسومي في قاعدة بيانات توقعات البيئة العالمية تحت رقم الانضمام GSE131074. تتوفر جميع الملفات والرموز المستخدمة في هذا البروتوكول من الملفات التكميلية 1-4. من خلال تطبيق RiboCode على مجموعة من مجموعات بيانات التنميط الريبوسومي <su...

Watch this Scientific Journal Video about De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data at JoVE.com

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

ترجمة الريبوسومات فك تشفير ثلاثة نيوكليوتيدات لكل كودون إلى الببتيدات. حركتها على طول الحمض النووي الريبوزي المرسال ، التي تم التقاطها بواسطة التنميط الريبوسومي ، تنتج آثار أقدام تظهر دورية ثلاثية مميزة. يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام RiboCode لفك شفرة هذه الميزة البارزة من بيانات التنميط الريبوسومي لتحديد إطارات القراءة المفتوحة المترجمة بنشاط على مستوى النسخ الكامل.

دي نوفو تحديد إطارات القراءة المفتوحة المترجمة بنشاط باستخدام بيانات التنميط الريبوسومي

Identification of open reading frames (ORFs), especially those encoding small peptides and being actively translated under specific physiological ...

يعد تفسير بيانات التسلسل الناتجة عن تجربة تنميط الريبوسوم أمرا بالغ الأهمية لقياس الأنشطة الانتقالية للريبوسومات على الحمض النووي الريبوزي المرسال كميا ، ولدراسة آليات التنظيم الانتقالي. في هذا البروتوكول ، سنصف الإجراء الحسابي لاستخدام بيانات التنميط الريبوسومي و RiboCode ، وهي أداة سطر أوامر لفك تشفير ترجمة mRNA على نطاق واسع من الجينوم ودقة نيوكليوتيدات واحدة. تسمح هذه الطريقة بالبحث عن الببتيدات الجديدة الناشئة عن المناطق الجينومية خارج جينات ترميز البروتين المشروحة ، وتوفر فرصة لتحديد معدل ترجمة mRNA.للبدء، افتح نافذة محطة لينكس، وقم بإنشاء بيئة conda عن طريق تنفيذ الأمر. قم بالتبديل إلى البيئة التي تم إنشاؤها، وقم بتثبيت RiboCode والتبعيات عن طريق تنفيذ الأمر. للحصول على ملفات مرجع الجينوم للتسلسل المرجعي، انتقل إلى موقع Ensembl على الويب، ثم انقر على تنزيل، متبوعا بتنزيل FTP.انقر فوق الخيار FASTA في العمود DNA FASTA ، وحدد الصف الذي تكون فيه الأنواع بشرية ، كما هو موضح في الجدول على صفحة موقع الويب. في صفحة موقع Ensembl على الويب ، انسخ الرابط كما هو مذكور في النص ، ثم قم بتنزيل الملفات الموجودة في المحطة الطرفية وفك ضغطها عن طريق تنفيذ الأمر. للحصول على تعليق توضيحي مرجعي، انقر بزر الماوس الأيمن فوق GTF في مجموعات جينات العمود في آخر صفحة ويب مفتوحة.انسخ الرابط وقم بتنزيله باستخدام الأمر. للحصول على تسلسلات rRNA، افتح متصفح جينوم UCSC، ثم انقر على أدوات، وحدد متصفح الجدول في القائمة المنسدلة. في صفحة متصفح الجينوم UCSC ، حدد الثدييات للطبقة ، والإنسان للجينوم ، وجميع الجداول للمجموعة ، وقناع R للجدول ، والجينوم للمنطقة.بالنسبة إلى عامل التصفية، انقر فوق إنشاء للانتقال إلى صفحة جديدة، وقم بتعيين فئة المندوب كما تتطابق مع rRNA. انقر فوق إرسال، ثم قم بتعيين تنسيق الإخراج إلى تسلسل، واسم ملف الإخراج كما HG38_rRNA. FA. أخيرا ، انقر فوق الحصول على الإخراج ، ثم حدد الحصول على تسلسل لاسترداد تسلسل rRNA.للحصول على مجموعات بيانات التنميط الريبوسومي من أرشيف قراءة التسلسل، قم بتنزيل عينات النسخ المتماثل لمجموعة المعالجة si-eIFe، وأعد تسميتها عن طريق تنفيذ الأمر. ثم قم بتنزيل عينات النسخ المتماثل لمجموعة التحكم، وأعد تسميتها عن طريق تنفيذ الأمر. لإزالة تلوث rRNA، ابدأ فهرسة تسلسلات مرجع rRNA عن طريق تنفيذ الأمر.بعد الفهرسة، قم بمحاذاة القراءات إلى مرجع rRNA لاستبعاد القراءات الناشئة من rRNA عن طريق تنفيذ الأمر. ابدأ بإنشاء فهرس جينوم عن طريق تنفيذ الأمر. ثم قم بمحاذاة القراءات النظيفة بدون تلوث rRNA إلى المرجع الذي تم إنشاؤه عن طريق تنفيذ الأمر ، ثم فرز ملفات المحاذاة وفهرستها عن طريق تنفيذ الأمر.قم بإعداد التعليقات التوضيحية للنص عن طريق تنفيذ الأمر. حدد شظايا الريبوسوم المحمية بأطوال محددة، وحدد مواضعها في موقع P عن طريق تنفيذ الأمر. قم بتحرير ملفات التكوين لكل نموذج ودمجها.ثم قم بتشغيل RiboCode عن طريق تنفيذ الأمر. أظهر التوزيع الترددي لأطوال القراءات أن معظم شظايا الريبوسوم المحمية تتوافق مع 25 إلى 35 نيوكليوتيدات. تم تحديد مواقع موقع P لأطوال مختلفة من الشظايا المحمية بالريبوسوم من خلال فحص المسافات من نهاياتها الرئيسية الخمسة إلى كودونات البداية والتوقف المشروحة.تظهر نتائج رسم الخرائط أن 10،394 جينا يشفر لإطارات القراءة المفتوحة المشروحة. علاوة على ذلك ، يقوم 509 و 168 جينا بالترميز لإطارات القراءة المفتوحة في المنبع والمصب ، في حين أن 939 جينا يشفرون إما لإطارات القراءة المفتوحة في المنبع أو المصب ، متداخلة مع إطارات القراءة المفتوحة المشروحة المعروفة. علاوة على ذلك ، يتم تشفير 68 جينا لترميز البروتين و 2،601 جينا غير مشفر لإطارات القراءة المفتوحة الجديدة.أظهر توزيع الطول أن إطارات القراءة المفتوحة في المنبع والمصب والرواية والمتداخلة كانت أقصر من إطارات القراءة المفتوحة المشروحة. تم حساب عدد الأجزاء المحمية نسبيا من الريبوسوم لكل إطار قراءة مفتوح، مما كشف عن أن كثافات الريبوسوم لإطارات القراءة المفتوحة في المنبع كانت أعلى بكثير في الخلايا الناقصة eIF3e منها في الخلايا الضابطة. كشف تحليل الميتاجين أن كتلة من الريبوسومات توقفت بين الكودون 25 و 75 في اتجاه مجرى الكودون البادئ، مما يشير إلى أن استطالة الترجمة قد يتم حظرها في وقت مبكر في الخلايا الناقصة eIF3e.تم فحص ملامح كثافة مواقع P لإطارات القراءة المفتوحة في المنبع ل PSMA6 وإطارات القراءة المفتوحة في المصب للجين SENP3-EIF4A1 ، مما يدل على أنماط دورية وكثافات شظايا الريبوسوم المحمية. يعد التحقق من مواقع القراءات حول كودونات البداية والتوقف لمناطق ترميز البروتين المعروفة ضروريا لتقييم الخصائص الدورية للقراءات لكل طول. RiboCode، جنبا إلى جنب مع أداة سطر الأوامر الأخرى، RiboMiner يمكن أيضا إجراء مراقبة الجودة والتحليلات المتعددة مثل تحديد وتصور انشغال الريبوسومات على إطارات القراءة المفتوحة المتوقعة.توفر هذه الأداة الحسابية طريقة عالية الإنتاجية لتحديد أحداث الترجمة غير القانونية باستخدام بيانات التنميط الريبوسومي في سياقات فسيولوجية محددة، وكيفية تعديل الترجمة استجابة للحافز.

Research

JoVE Journal

Biology

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

الحكمة البروتين: A منضدة لل<em&gt; في السيليكون</em&gt;<em&gt; دي نوفو</em&gt; تصميم الجزيئات الحيوية

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

تحليل ترجمة بدء أثناء حالة الإجهاد التي كتبها Polysome التنميط

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

سير العمل عالية المحتوى، الكمي خلية فردية من نيون علامات من المجاهر البيانات العالمي، بدعم من برمجيات المصدر المفتوح

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين<em&gt; في فيفو</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

طريقة سهلة لمحطة Polysome التنميط

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

دي نوفو جيل خلايا الجذعية الجسدية من ياب/طاز

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-تكس: أداه تكامل البيانات المفتوحة المصدر لنسخ البيانات الكبيرة المصممة لمكافحه ناقلات الملاريا

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

دودة الانحياز Worm_CP، خطين أنابيب مفتوحة المصدر لتقويم و كمية بيانات صورة الفلوريسنس التي تم الحصول عليها من Elegans Caenorhabditis

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

تقييم معدلات تخليق البروتينات في Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...