Name: de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data
Uploaded: 2022-02-18T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende støtten fra de beregningsmæssige ressourcer, der leveres af HPCC-platformen fra Xi'an Jiaotong University. Z.X. takker taknemmeligt Young Topnotch Talent Support Plan fra Xi'an Jiaotong University.

1. Miljøopsætning og RiboCode-installation
<ol><li>Åbn et Linux-terminalvindue, og opret et conda-miljø: conda create -n RiboCode python=3.8
</li>
	<li>Skift til det oprettede miljø, og installer RiboCode og afhængigheder: conda aktiver RiboCode conda install -c bioconda ribocode ribominer sra-tools fastx_toolkit cutadapt bowtie star samtools
</li>
</ol>2. Forberedelse af data
<ol><li>Hent genomreferencefiler.<ol>
<li>For refer...

<ol>
	<li>Eisenberg, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+Initiation+Site+Profiling+Reveals+Widespread+Synthesis+of+Non-AUG-Initiated+Protein+Isoforms+in+Yeast.">Translation Initiation Site Profiling Reveals Widespread Synthesis of Non-AUG-Initiated Protein Isoforms in Yeast.</a> Cell Systems. 11 (2), 145-160 (2020).</li><li>Spealman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+non-AUG+uORFs+revealed+by+a+novel+regression+analysis+of+ribosome+profiling+data.">Conserved non-AUG uORFs revealed by a novel regression analysis of ribosome profiling data.</a> Genome Research. 28 (2), 214-222 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147 (4), 789-802 (2011).</li><li>Bazzini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+ORFs+in+vertebrates+using+ribosome+footprinting+and+evolutionary+conservation.">Identification of small ORFs in vertebrates using ribosome footprinting and evolutionary conservation.</a> The EMBO Journal. 33 (9), 981-993 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell Reports. 8 (5), 1365-1379 (2014).</li><li>Chew, G. L., Pauli, A., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+uORF+repressiveness+and+sequence+features+in+mouse,+human+and+zebrafish.">Conservation of uORF repressiveness and sequence features in mouse, human and zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 11663 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genome-wide+distribution+and+evolution+of+uORFs+in+eukaryotes.">Determinants of genome-wide distribution and evolution of uORFs in eukaryotes.</a> Nature Communications. 12 (1), 1076 (2021).</li><li>Guenther, U. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+helicase+Ded1p+controls+use+of+near-cognate+translation+initiation+codons+in+5'+UTRs.">The helicase Ded1p controls use of near-cognate translation initiation codons in 5' UTRs.</a> Nature. 559 (7712), 130-134 (2018).</li><li>Goldsmith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+a+functional+role+for+autophagy+in+mRNA+translational+control.">Ribosome profiling reveals a functional role for autophagy in mRNA translational control.</a> Communications Biology. 3 (1), 388 (2020).</li><li>Magny, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+regulation+of+cardiac+calcium+uptake+by+peptides+encoded+in+small+open+reading+frames.">Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames.</a> Science. 341 (6150), 1116-1120 (2013).</li><li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Molecular Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress.">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li><li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes.">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biology. 16, 90 (2015).</li><li>Chng, S. C., Ho, L., Tian, J., Reversade, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELABELA:+a+hormone+essential+for+heart+development+signals+via+the+apelin+receptor.">ELABELA: a hormone essential for heart development signals via the apelin receptor.</a> Developmental Cell. 27 (6), 672-680 (2013).</li><li>Pauli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toddler:+an+embryonic+signal+that+promotes+cell+movement+via+Apelin+receptors.">Toddler: an embryonic signal that promotes cell movement via Apelin receptors.</a> Science. 343 (6172), 1248636 (2014).</li><li>Stark, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+functional+elements+in+12+Drosophila+genomes+using+evolutionary+signatures.">Discovery of functional elements in 12 Drosophila genomes using evolutionary signatures.</a> Nature. 450 (7167), 219-232 (2007).</li><li>Lin, M. F., Jungreis, I., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhyloCSF:+a+comparative+genomics+method+to+distinguish+protein+coding+and+non-coding+regions.">PhyloCSF: a comparative genomics method to distinguish protein coding and non-coding regions.</a> Bioinformatics. 27 (13), 275-282 (2011).</li><li>Slavoff, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+discovery+of+short+open+reading+frame-encoded+peptides+in+human+cells.">Peptidomic discovery of short open reading frame-encoded peptides in human cells.</a> Nature Chemical Biology. 9 (1), 59-64 (2013).</li><li>Schwaid, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+discovery+of+cysteine-containing+human+short+open+reading+frames.">Chemoproteomic discovery of cysteine-containing human short open reading frames.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (45), 16750-16753 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation+and+quantitation+of+translation+by+ribosome+profiling.">Genome-wide annotation and quantitation of translation by ribosome profiling.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 1-19 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Xiao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+annotation+and+characterization+of+the+translatome+with+ribosome+profiling+data.">De novo annotation and characterization of the translatome with ribosome profiling data.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 61 (2018).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF3+Associates+with+80S+Ribosomes+to+Promote+Translation+Elongation,+Mitochondrial+Homeostasis,+and+Muscle+Health.">eIF3 Associates with 80S Ribosomes to Promote Translation Elongation, Mitochondrial Homeostasis, and Muscle Health.</a> Molecular Cell. 79 (4), 575-587 (2020).</li><li>. AGAT: Another Gff Analysis Toolkit to handle annotations in any GTF/GFF format Available from: <a target="_blank" href="https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html">https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html</a> (2020)</li><li>. Gene Expression Omnibus Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo">https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo</a> (2002)</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>. STAR manual Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf">https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf</a> (2022)</li><li>. The genetic codes Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi</a> (2019)</li><li>. RiboMiner Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboMiner">https://github.com/xryanglab/RiboMiner</a> (2020)</li><li>Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+global+views+of+translation.">Ribosome profiling: global views of translation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), 032698 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+translation+initiation+sites+in+mammalian+cells+at+single-nucleotide+resolution.">Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+initiating+ribosomes+in+vivo.">Quantitative profiling of initiating ribosomes in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 147-153 (2015).</li><li>Spealman, P., Naik, A., McManus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uORF-seqr:+A+Machine+Learning-Based+approach+to+the+identification+of+upstream+open+reading+frames+in+yeast.">uORF-seqr: A Machine Learning-Based approach to the identification of upstream open reading frames in yeast.</a> Methods in Molecular Biol. 2252, 313-329 (2021).</li><li>. RiboCode Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboCode">https://github.com/xryanglab/RiboCode</a> (2018)</li><li>Sharma, P., Wu, J., Nilges, B. S., Leidel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+and+other+commonly+used+model+organisms+are+resistant+to+cycloheximide-mediated+biases+in+ribosome+profiling+experiments.">Humans and other commonly used model organisms are resistant to cycloheximide-mediated biases in ribosome profiling experiments.</a> Nature Communications. 12 (1), 5094 (2021).</li></ol>

Ribosomprofilering giver en hidtil uset mulighed for at studere ribosomernes virkning i celler på genomskala. Præcis dechifrering af de oplysninger, der bæres af ribosomprofileringsdataene, kan give indsigt i, hvilke regioner af gener eller transkripter der aktivt oversættes. Denne trinvise protokol giver vejledning i, hvordan du bruger RiboCode til at analysere ribosomprofileringsdata i detaljer, herunder pakkeinstallation, dataforberedelse, kommandoudførelse, resultatforklaring og datavisualisering. Analyseresulta...

For nylig har en voksende mængde undersøgelser afsløret udbredt produktion af peptider oversat fra ORF'er af kodende gener og de tidligere kommenterede gener som ikke-kodende, såsom lange ikke-kodende RNA'er (lncRNA'er)1,2,3,4,5,6,7,8. Disse oversatte ORF'er reguleres eller induceres af celler til at reagere på miljøændringer, stress og celledifferentiering1,8,9,10,11,12,13. Oversættelsesprodukterne fra nogle ORF'er har vist sig at spille vigtige regulerende roller i forskellige biologiske processer inden for udvikling og fysiologi. For eksempel opdagede Chng et al.14 et peptidhormon ved navn Elabela (Ela, også kendt som Apela / Ende / Toddler), som er kritisk for kardiovaskulær udvikling. Pauli et al. foreslog, at Ela også fungerer som et mitogen, der fremmer cellemigration i det tidlige fiskeembryo15. Magny et al. rapporterede to mikropeptider på mindre end 30 aminosyrer, der regulerer calciumtransport og påvirker regelmæssig muskelkontraktion i Drosophila-hjertet10.
Det er fortsat uklart, hvor mange sådanne peptider der er kodet af genomet, og om de er biologisk relevante. Derfor er systematisk identifikation af disse potentielt kodende ORF'er yderst ønskelig. Direkte bestemmelse af produkterne fra disse ORF'er (dvs. protein eller peptid) ved hjælp af traditionelle tilgange såsom evolutionær bevarelse16,17 og massespektrometri18,19 er imidlertid udfordrende, fordi detektionseffektiviteten af begge tilgange er afhængig af længden, overfloden og aminosyresammensætningen af de producerede proteiner eller peptider. Fremkomsten af ribosomprofilering, en teknik til identifikation af ribosombelægningen på mRNA'er ved nukleotidopløsning, har givet en præcis måde at evaluere kodningspotentialet for forskellige transkripter3,20,21, uanset deres længde og sammensætning. En vigtig og hyppigt anvendt funktion til identifikation af aktivt oversættelse af ORF'er ved hjælp af ribosomprofilering er tre-nukleotid (3-nt) periodiciteten af ribosomets fodaftryk på mRNA fra startkodonen til stopkodonen. Imidlertid har ribosomprofileringsdata ofte flere problemer, herunder lave og sparsomme sekventeringslæsninger langs ORF'er, høj sekventeringsstøj og ribosomal RNA (rRNA) forurening. Således svækker de forvrængede og tvetydige signaler, der genereres af sådanne data, 3-nt periodicitetsmønstrene for ribosomers fodaftryk på mRNA, hvilket i sidste ende gør identifikationen af de højtillidsoversatte ORF'er vanskelig.
En pakke med navnet "RiboCode" tilpassede en modificeret Wilcoxon-signed-rank test og P-værdi integrationsstrategi for at undersøge, om ORF har betydeligt flere ribosombeskyttede fragmenter (RPF'er) i rammen end off-frame RPF'er22. Det blev påvist at være yderst effektivt, følsomt og nøjagtigt for de novo-annotation af translatomet i simulerede og reelle ribosomprofileringsdata. Her beskriver vi, hvordan du bruger dette værktøj til at registrere de potentielle oversættelses-ORF'er fra de rå ribosomprofileringssekventeringsdatasæt, der blev genereret af den foregående undersøgelse23. Disse datasæt var blevet brugt til at undersøge funktionen af EIF3-underenheden "E" (EIF3E) i oversættelse ved at sammenligne ribosombelægningsprofilerne for MCF-10A-celler transfekteret med kontrol (si-Ctrl) og EIF3E (si-eIF3e) småinterfererende RNA'er (siRNA'er). Ved at anvende RiboCode på disse eksempeldatasæt opdagede vi 5.633 nye ORF'er, der potentielt koder for små peptider eller proteiner. Disse ORF'er blev kategoriseret i forskellige typer baseret på deres placering i forhold til de kodende regioner, herunder opstrøms ORF'er (uORF'er), nedstrøms ORF'er (dORF'er), overlappede ORF'er, ORF'er fra nye proteinkodende gener (nye PCG'er) og ORF'er fra nye ikke-proteinkodende gener (nye ikke-PCG'er). RPF-læsetæthederne på uORF'er blev signifikant øget i EIF3E-mangelfulde celler sammenlignet med kontrolceller, hvilket i det mindste delvist kan være forårsaget af berigelsen af aktivt oversættende ribosomer. Den lokaliserede ribosomakkumulering i regionen fra den 25. til 75. codon af EIF3E-mangelfulde celler indikerede en blokering af translationsforlængelse i det tidlige stadium. Denne protokol viser også, hvordan man visualiserer RPF-densiteten i det ønskede område til undersøgelse af 3-nt periodicitetsmønstre af ribosomfodaftryk på identificerede ORF'er. Disse analyser viser RiboCodes stærke rolle i at identificere oversættelse af ORF'er og studere reguleringen af oversættelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A computer/server running Linux</td>
			<td>Any</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaconda or Miniconda</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>-</td>
			<td>Anaconda: https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data

Identifikation af åbne læserammer (ORF'er), især dem, der koder for små peptider og aktivt oversættes under specifikke fysiologiske sammenhænge, er afgørende for omfattende kommentarer til kontekstafhængige translatomer. Ribosomprofilering, en teknik til påvisning af bindingssteder og tætheder ved oversættelse af ribosomer på RNA, giver en mulighed for hurtigt at opdage, hvor translation sker på genom-bred skala. Det er dog ikke en triviel opgave inden for bioinformatik effektivt og omfattende at identificere de oversættende ORF'er til ribosomprofilering. Beskrevet her er en brugervenlig pakke, der hedder RiboCode, designet til aktivt at oversætte ORF'er af enhver størrelse fra forvrængede og tvetydige signaler i ribosomprofileringsdata. Med vores tidligere offentliggjorte datasæt som et eksempel indeholder denne artikel trinvise instruktioner til hele RiboCode-pipelinen, fra forbehandling af de rå data til fortolkning af de endelige outputresultatfiler. For at evaluere oversættelseshastighederne for de kommenterede ORF'er er procedurerne for visualisering og kvantificering af ribosomtætheder på hver ORF også beskrevet detaljeret. Sammenfattende er denne artikel en nyttig og rettidig instruktion for forskningsområderne relateret til oversættelse, små ORF'er og peptider.

Eksemplet med ribosomprofileringsdatasæt blev deponeret i GEO-databasen under tiltrædelsesnummeret GSE131074. Alle de filer og koder, der bruges i denne protokol, er tilgængelige fra supplerende filer 1-4. Ved at anvende RiboCode på et sæt offentliggjorte ribosomprofileringsdatasæt23 identificerede vi de nye ORF'er, der aktivt blev oversat i MCF-10A-celler behandlet med kontrol og EIF3E-siRNA'er. For at vælge de RPF-læsninger, der...

Watch this Scientific Journal Video about De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data at JoVE.com

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

Oversættelse af ribosomer afkoder tre nukleotider pr. Codon til peptider. Deres bevægelse langs mRNA, fanget ved ribosomprofilering, producerer fodsporene, der udviser karakteristisk tripletperioditet. Denne protokol beskriver, hvordan du bruger RiboCode til at dechiffrere denne fremtrædende funktion fra ribosomprofileringsdata for at identificere aktivt oversatte åbne læserammer på hele transkriptomniveau.

De novo Identifikation af aktivt oversatte åbne læserammer med ribosomprofileringsdata

Identification of open reading frames (ORFs), especially those encoding small peptides and being actively translated under specific physiological ...

Fortolkning af de sekventeringsdata, der genereres af ribosomprofileringseksperimentet, er afgørende for kvantitativ måling af ribosomers translationelle aktiviteter på mRNA og for at studere mekanismerne for translationel regulering. I denne protokol vil vi beskrive beregningsproceduren for anvendelse af ribosomprofileringsdataene og RiboCode, et kommandolinjeværktøj til at afkode mRNA-oversættelse på genom-bred skala og enkeltnukleotidopløsning. Denne metode gør det muligt at søge efter de nye peptider, der stammer fra de genomiske regioner uden for de kommenterede proteinkodende gener, og giver mulighed for at kvantificere hastigheden af mRNA-translation.Til at begynde med skal du åbne et Linux-terminalvindue og oprette et conda-miljø ved at udføre kommandoen. Skift til det oprettede miljø, og installer RiboCode og afhængigheder ved at udføre kommandoen. For at hente genomreferencefilerne til referencesekvensen skal du gå til Ensembl-webstedet og derefter klikke på download efterfulgt af FTP-download.Klik på fasta-indstillingen i kolonnen DNA FASTA, og vælg den række, hvor arter er mennesker, vist i tabellen på websidesiden. På Ensembl-webstedssiden skal du kopiere linket som nævnt i teksten og derefter downloade og pakke filerne ud i terminalen ved at udføre kommandoen. For referenceanmærkning skal du højreklikke på GTF i kolonnegensættene på den sidste åbne webside.Kopier linket, og download det ved hjælp af kommandoen. For at få rRNA-sekvenser skal du åbne UCSC-genombrowser, derefter klikke på værktøjer og vælge tabelbrowser på rullelisten. På UCSC-genombrowsersiden skal du angive pattedyr for clade, human for genom, alle tabeller for gruppe, R-maske for tabel og genom for region.For filter skal du klikke på opret for at gå til en ny side og indstille rep-klasse, som det stemmer overens med rRNA. Klik på Send, og indstil derefter outputformatet til rækkefølge og outputfilnavnet som HG38_rRNA. FA. Til sidst skal du klikke på hent output, og vælg derefter hent sekvens for at hente rRNA-sekvensen.Hvis du vil hente ribosomprofileringsdatasæt fra sekvenslæst arkiv, skal du downloade replikatprøverne fra si-eIFe-behandlingsgruppen og omdøbe dem ved at udføre kommandoen. Download derefter replikatprøverne fra kontrolgruppen, og omdøb dem ved at udføre kommandoen. For at fjerne rRNA-forurening skal du begynde at indeksere rRNA-referencesekvenser ved at udføre kommandoen.Efter indeksering skal du justere læsningerne til rRNA-referencen for at udelukke de læsninger, der stammer fra rRNA, ved at udføre kommandoen. Start med at oprette et genomindeks ved at udføre kommandoen. Juster derefter de rene læsninger uden rRNA-forurening til den oprettede reference ved at udføre kommandoen, og sorter og indekser derefter justeringsfiler ved at udføre kommandoen.Forbered afskriftskommentarerne ved at udføre kommandoen. Vælg ribosombeskyttede fragmenter af bestemte længder, og identificer deres P-stedpositioner ved at udføre kommandoen. Rediger konfigurationsfilerne for hvert eksempel, og flet dem.Kør derefter RiboCode ved at udføre kommandoen. Frekvensfordelingen af læsningernes længder viste, at de fleste ribosombeskyttede fragmenter svarer til 25 til 35 nukleotider. P-stedets placeringer for forskellige længder af ribosombeskyttede fragmenter blev bestemt ved at undersøge afstandene fra deres fem primære ender til de kommenterede start- og stopkodoner.Kortlægningsresultaterne viser, at 10.394 gener koder for kommenterede åbne læserammer. Desuden koder 509 og 168 gener for opstrøms og nedstrøms åbne læserammer, mens 939 gener koder for enten opstrøms eller nedstrøms åbne læserammer, overlappede med kendte kommenterede åbne læserammer. Desuden koder 68 proteinkodende gener og 2.601 ikke-kodende gener for nye åbne læserammer.Længdefordelingen viste, at opstrøms, nedstrøms, nye og overlappende åbne læserammer var kortere end de kommenterede åbne læserammer. Relative ribosombeskyttede fragmenttællinger blev beregnet for hver åben læseramme, hvilket afslørede, at ribosomtæthederne i opstrøms åbne læserammer var signifikant højere i eIF3e-mangelfulde celler end i kontrolceller. Metagenanalysen afslørede, at en masse ribosomer gik i stå mellem kodon 25 og 75 nedstrøms for startkodonen, hvilket tyder på, at oversættelsesforlængelsen kan blokeres tidligt i eIF3e-mangelfulde celler.P-stedernes densitetsprofiler for opstrøms åbne læserammer af PSMA6 og nedstrøms åbne læserammer for genet SENP3-EIF4A1 blev undersøgt, hvilket demonstrerede periodicitetsmønstre og tætheder af ribosombeskyttede fragmenter. Kontrol af placeringen af læsninger omkring start- og stopkodoner af kendte proteinkodende regioner er nødvendig for at evaluere de periodiske egenskaber ved læsninger for hver længde. RiboCode, sammen med et andet kommandolinjeværktøj, RiboMiner kan også udføre kvalitetskontrol og flere analyser såsom kvantificering og visualisering af ribosomernes belægninger på de forudsagte åbne læserammer.Dette beregningsværktøj giver en høj gennemstrømningsmåde til at identificere ukanoniske oversættelseshændelser med ribosomprofileringsdata i specifikke fysiologiske sammenhænge, og hvordan oversættelsen moduleres som reaktion på stimulansen.

Research

JoVE Journal

Biology

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein VISDOM: A Workbench for<em&gt; I silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Design af biomolekyler

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Analyse af translationsinitieringskodon under stress betingelser ved Polysomprofiler Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Workflow til High-indhold, individuel celle Kvantificering af fluorescerende markører fra Universal Microscope data, støttet af Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunpræcipitation Assay til identifikation af Arabidopsis Protein-DNA interaktioner<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

En nem metode til Plant Polysomprofiler profilering

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open source Single-partikel Analyse for Super-resolution Microscopy med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation af somatiske stamceller af YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: en open source data integration værktøj til Big data transkriptomics designet til malaria vektor Anopheles malariamyg

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align og Worm_CP, To open source-rørledninger til glatning og kvantificering af Fluorescens Image Data Opnået fra Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Vurdering af de novo proteinsyntese i Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...