Name: de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data
Uploaded: 2022-02-18T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data at JoVE.com

De auteurs willen graag de ondersteuning erkennen van de computationele bronnen die worden geboden door het HPCC-platform van de Xi'an Jiaotong University. Z.X. bedankt dankbaar het Young Topnotch Talent Support Plan van Xi'an Jiaotong University.

1. Omgevingsinstellingen en RiboCode-installatie
<ol><li>Open een Linux-terminalvenster en maak een conda-omgeving: conda create -n RiboCode python=3.8
</li>
	<li>Schakel over naar de gecreëerde omgeving en installeer RiboCode en afhankelijkheden: conda activeer RiboCode conda install -c bioconda ribocode ribominer sra-tools fastx_toolkit cutadapt bowtie star samtools
</li>
</ol>2. Voorbereiding van de gegevens
<ol><li>Krijg genoomr...

<ol>
	<li>Eisenberg, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+Initiation+Site+Profiling+Reveals+Widespread+Synthesis+of+Non-AUG-Initiated+Protein+Isoforms+in+Yeast.">Translation Initiation Site Profiling Reveals Widespread Synthesis of Non-AUG-Initiated Protein Isoforms in Yeast.</a> Cell Systems. 11 (2), 145-160 (2020).</li><li>Spealman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+non-AUG+uORFs+revealed+by+a+novel+regression+analysis+of+ribosome+profiling+data.">Conserved non-AUG uORFs revealed by a novel regression analysis of ribosome profiling data.</a> Genome Research. 28 (2), 214-222 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147 (4), 789-802 (2011).</li><li>Bazzini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+ORFs+in+vertebrates+using+ribosome+footprinting+and+evolutionary+conservation.">Identification of small ORFs in vertebrates using ribosome footprinting and evolutionary conservation.</a> The EMBO Journal. 33 (9), 981-993 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell Reports. 8 (5), 1365-1379 (2014).</li><li>Chew, G. L., Pauli, A., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+uORF+repressiveness+and+sequence+features+in+mouse,+human+and+zebrafish.">Conservation of uORF repressiveness and sequence features in mouse, human and zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 11663 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genome-wide+distribution+and+evolution+of+uORFs+in+eukaryotes.">Determinants of genome-wide distribution and evolution of uORFs in eukaryotes.</a> Nature Communications. 12 (1), 1076 (2021).</li><li>Guenther, U. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+helicase+Ded1p+controls+use+of+near-cognate+translation+initiation+codons+in+5'+UTRs.">The helicase Ded1p controls use of near-cognate translation initiation codons in 5' UTRs.</a> Nature. 559 (7712), 130-134 (2018).</li><li>Goldsmith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+a+functional+role+for+autophagy+in+mRNA+translational+control.">Ribosome profiling reveals a functional role for autophagy in mRNA translational control.</a> Communications Biology. 3 (1), 388 (2020).</li><li>Magny, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+regulation+of+cardiac+calcium+uptake+by+peptides+encoded+in+small+open+reading+frames.">Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames.</a> Science. 341 (6150), 1116-1120 (2013).</li><li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Molecular Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress.">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li><li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes.">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biology. 16, 90 (2015).</li><li>Chng, S. C., Ho, L., Tian, J., Reversade, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELABELA:+a+hormone+essential+for+heart+development+signals+via+the+apelin+receptor.">ELABELA: a hormone essential for heart development signals via the apelin receptor.</a> Developmental Cell. 27 (6), 672-680 (2013).</li><li>Pauli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toddler:+an+embryonic+signal+that+promotes+cell+movement+via+Apelin+receptors.">Toddler: an embryonic signal that promotes cell movement via Apelin receptors.</a> Science. 343 (6172), 1248636 (2014).</li><li>Stark, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+functional+elements+in+12+Drosophila+genomes+using+evolutionary+signatures.">Discovery of functional elements in 12 Drosophila genomes using evolutionary signatures.</a> Nature. 450 (7167), 219-232 (2007).</li><li>Lin, M. F., Jungreis, I., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhyloCSF:+a+comparative+genomics+method+to+distinguish+protein+coding+and+non-coding+regions.">PhyloCSF: a comparative genomics method to distinguish protein coding and non-coding regions.</a> Bioinformatics. 27 (13), 275-282 (2011).</li><li>Slavoff, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+discovery+of+short+open+reading+frame-encoded+peptides+in+human+cells.">Peptidomic discovery of short open reading frame-encoded peptides in human cells.</a> Nature Chemical Biology. 9 (1), 59-64 (2013).</li><li>Schwaid, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+discovery+of+cysteine-containing+human+short+open+reading+frames.">Chemoproteomic discovery of cysteine-containing human short open reading frames.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (45), 16750-16753 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation+and+quantitation+of+translation+by+ribosome+profiling.">Genome-wide annotation and quantitation of translation by ribosome profiling.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 1-19 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Xiao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+annotation+and+characterization+of+the+translatome+with+ribosome+profiling+data.">De novo annotation and characterization of the translatome with ribosome profiling data.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 61 (2018).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF3+Associates+with+80S+Ribosomes+to+Promote+Translation+Elongation,+Mitochondrial+Homeostasis,+and+Muscle+Health.">eIF3 Associates with 80S Ribosomes to Promote Translation Elongation, Mitochondrial Homeostasis, and Muscle Health.</a> Molecular Cell. 79 (4), 575-587 (2020).</li><li>. AGAT: Another Gff Analysis Toolkit to handle annotations in any GTF/GFF format Available from: <a target="_blank" href="https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html">https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html</a> (2020)</li><li>. Gene Expression Omnibus Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo">https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo</a> (2002)</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>. STAR manual Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf">https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf</a> (2022)</li><li>. The genetic codes Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi</a> (2019)</li><li>. RiboMiner Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboMiner">https://github.com/xryanglab/RiboMiner</a> (2020)</li><li>Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+global+views+of+translation.">Ribosome profiling: global views of translation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), 032698 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+translation+initiation+sites+in+mammalian+cells+at+single-nucleotide+resolution.">Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+initiating+ribosomes+in+vivo.">Quantitative profiling of initiating ribosomes in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 147-153 (2015).</li><li>Spealman, P., Naik, A., McManus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uORF-seqr:+A+Machine+Learning-Based+approach+to+the+identification+of+upstream+open+reading+frames+in+yeast.">uORF-seqr: A Machine Learning-Based approach to the identification of upstream open reading frames in yeast.</a> Methods in Molecular Biol. 2252, 313-329 (2021).</li><li>. RiboCode Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboCode">https://github.com/xryanglab/RiboCode</a> (2018)</li><li>Sharma, P., Wu, J., Nilges, B. S., Leidel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+and+other+commonly+used+model+organisms+are+resistant+to+cycloheximide-mediated+biases+in+ribosome+profiling+experiments.">Humans and other commonly used model organisms are resistant to cycloheximide-mediated biases in ribosome profiling experiments.</a> Nature Communications. 12 (1), 5094 (2021).</li></ol>

Ribosoomprofilering biedt een ongekende kans om de werking van de ribosomen in cellen op genoomschaal te bestuderen. Het nauwkeurig ontcijferen van de informatie die door de ribosoomprofileringsgegevens wordt gedragen, kan inzicht geven in welke regio's van genen of transcripten actief worden vertaald. Dit stapsgewijze protocol biedt richtlijnen voor het gebruik van RiboCode om ribosoomprofileringsgegevens in detail te analyseren, inclusief pakketinstallatie, gegevensvoorbereiding, uitvoering van opdrachten, resultaatuit...

Onlangs heeft een groeiend aantal studies een wijdverspreide productie van peptiden onthuld die zijn vertaald uit ORF's van coderende genen en de eerder geannoteerde genen als niet-coderend, zoals lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) 1,2,3,4,5,6,7,8. Deze vertaalde ORF's worden gereguleerd of geïnduceerd door cellen om te reageren op omgevingsveranderingen, stress en celdifferentiatie1,8,9,10,11,12,13. Van de vertaalproducten van sommige ORF's is aangetoond dat ze een belangrijke regulerende rol spelen in diverse biologische processen in ontwikkeling en fysiologie. Chng et al.14 ontdekten bijvoorbeeld een peptidehormoon genaamd Elabela (Ela, ook bekend als Apela / Ende / Toddler), dat van cruciaal belang is voor de cardiovasculaire ontwikkeling. Pauli et al. suggereerden dat Ela ook werkt als een mitogeen dat de celmigratie in het vroege visembryo bevordert15. Magny et al. rapporteerden twee micropeptiden van minder dan 30 aminozuren die het calciumtransport reguleren en de regelmatige spiercontractie in het Drosophila-hart beïnvloeden10.
Het blijft onduidelijk hoeveel van dergelijke peptiden door het genoom worden gecodeerd en of ze biologisch relevant zijn. Daarom is systematische identificatie van deze potentieel coderende ORF's zeer wenselijk. Het direct bepalen van de producten van deze ORF's (d.w.z. eiwit of peptide) met behulp van traditionele benaderingen zoals evolutionaire conservering16,17 en massaspectrometrie18,19 is echter een uitdaging omdat de detectie-efficiëntie van beide benaderingen afhankelijk is van de lengte, abundantie en aminozuursamenstelling van de geproduceerde eiwitten of peptiden. De komst van ribosoomprofilering, een techniek voor het identificeren van de ribosoombezetting op mRNA's met nucleotideresolutie, heeft een precieze manier geboden om het coderingspotentieel van verschillende transcripten3,20,21 te evalueren, ongeacht hun lengte en samenstelling. Een belangrijk en vaak gebruikt kenmerk voor het identificeren van actief vertalende ORF's met behulp van ribosoomprofilering is de drie-nucleotide (3-nt) periodiciteit van de voetafdrukken van het ribosoom op mRNA van het startcodon tot het stopcodon. Ribosoomprofileringsgegevens hebben echter vaak verschillende problemen, waaronder lage en schaarse sequencing-reads langs ORF's, hoge sequencingruis en ribosomale RNA (rRNA) -verontreinigingen. De vervormde en dubbelzinnige signalen die door dergelijke gegevens worden gegenereerd, verzwakken dus de 3-nt periodiciteitspatronen van de voetafdrukken van ribosomen op mRNA, wat uiteindelijk de identificatie van de met hoge betrouwbaarheid vertaalde ORF's moeilijk maakt.
Een pakket met de naam "RiboCode" paste een aangepaste Wilcoxon-signed-rank test en P-value integratiestrategie aan om te onderzoeken of de ORF significant meer in-frame ribosoom-beschermde fragmenten (RPF's) heeft dan off-frame RPFs22. Het bleek zeer efficiënt, gevoelig en nauwkeurig te zijn voor de novo annotatie van het translatoom in gesimuleerde en echte ribosoomprofileringsgegevens. Hier beschrijven we hoe we deze tool kunnen gebruiken om de potentiële vertalende ORF's te detecteren uit de ruwe ribosoomprofileringsequencingsets die door de vorige studie zijn gegenereerd23. Deze datasets werden gebruikt om de functie van EIF3-subeenheid "E" (EIF3E) in vertaling te onderzoeken door de ribosoombezettingsprofielen van MCF-10A-cellen getransfecteerd met controle (si-Ctrl) en EIF3E (si-eIF3e) kleine interfererende RNA's (siRNA's) te vergelijken. Door RiboCode toe te passen op deze voorbeelddatasets, ontdekten we 5.633 nieuwe ORF's die mogelijk coderen voor kleine peptiden of eiwitten. Deze ORF's werden gecategoriseerd in verschillende typen op basis van hun locaties ten opzichte van de coderende regio's, waaronder upstream ORF's (uORF's), downstream ORF's (dORFs), overlappende ORF's, ORF's van nieuwe eiwitcoderende genen (nieuwe PCG's) en ORF's van nieuwe niet-proteïnecoderende genen (nieuwe niet-PCPG's). De RPF-leesdichtheden op uORF's waren significant verhoogd in EIF3E-deficiënte cellen in vergelijking met controlecellen, wat ten minste gedeeltelijk kan worden veroorzaakt door de verrijking van actief translaterende ribosomen. De gelokaliseerde ribosoomaccumulatie in het gebied van het 25e tot 75e codon van EIF3E-deficiënte cellen duidde op een blokkering van translatie-elongatie in het vroege stadium. Dit protocol laat ook zien hoe de RPF-dichtheid van het gewenste gebied kan worden gevisualiseerd voor het onderzoeken van de 3-nt periodiciteitspatronen van ribosoomvoetafdrukken op geïdentificeerde ORF's. Deze analyses tonen de krachtige rol van RiboCode bij het identificeren van vertalende ORF's en het bestuderen van de regulatie van vertaling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A computer/server running Linux</td>
			<td>Any</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaconda or Miniconda</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>-</td>
			<td>Anaconda: https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data

Identificatie van open leesframes (ORF's), met name die welke coderen voor kleine peptiden en actief worden vertaald onder specifieke fysiologische contexten, is van cruciaal belang voor uitgebreide annotaties van contextafhankelijke translatomen. Ribosoomprofilering, een techniek voor het detecteren van de bindingslocaties en dichtheden van het vertalen van ribosomen op RNA, biedt een manier om snel te ontdekken waar translatie plaatsvindt op genoombrede schaal. Het is echter geen triviale taak in de bio-informatica om de vertalende ORF's voor ribosoomprofilering efficiënt en uitgebreid te identificeren. Hier beschreven is een eenvoudig te gebruiken pakket, genaamd RiboCode, ontworpen om te zoeken naar actief vertalende ORF's van elke grootte van vervormde en dubbelzinnige signalen in ribosoomprofileringsgegevens. Dit artikel neemt onze eerder gepubliceerde dataset als voorbeeld en biedt stapsgewijze instructies voor de gehele RiboCode-pijplijn, van het voorbewerken van de onbewerkte gegevens tot de interpretatie van de uiteindelijke uitvoerresultaatbestanden. Bovendien worden voor het evalueren van de omrekeningssnelheden van de geannoteerde ORF's ook procedures voor visualisatie en kwantificering van ribosoomdichtheden op elke ORF in detail beschreven. Samenvattend is dit artikel een nuttige en tijdige instructie voor de onderzoeksgebieden met betrekking tot vertaling, kleine ORF's en peptiden.

De voorbeelddatasets voor ribosoomprofilering werden in de GEO-database gedeponeerd onder het toetredingsnummer GSE131074. Alle bestanden en codes die in dit protocol worden gebruikt, zijn beschikbaar in aanvullende bestanden 1-4. Door RiboCode toe te passen op een reeks gepubliceerde ribosoomprofileringsdatasets23, identificeerden we de nieuwe ORF's die actief werden vertaald in MCF-10A-cellen die werden behandeld met controle- en EIF3E siRNA's.<sup class="xref...

Watch this Scientific Journal Video about De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data at JoVE.com

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

Het vertalen van ribosomen decodeert drie nucleotiden per codon in peptiden. Hun beweging langs mRNA, vastgelegd door ribosoomprofilering, produceert de voetafdrukken die karakteristieke triplet periodiciteit vertonen. Dit protocol beschrijft hoe RiboCode te gebruiken om deze prominente functie te ontcijferen uit ribosoomprofileringsgegevens om actief vertaalde open leesframes op het niveau van het hele transcriptoom te identificeren.

De novo Identificatie van actief vertaalde open leesframes met ribosoomprofileringsgegevens

Identification of open reading frames (ORFs), especially those encoding small peptides and being actively translated under specific physiological ...

Interpretatie van de sequencinggegevens gegenereerd door het ribosoomprofileringsexperiment is van cruciaal belang voor het kwantitatief meten van de translationele activiteiten van ribosomen op mRNA en voor het bestuderen van de mechanismen van translationele regulatie. In dit protocol beschrijven we de computationele procedure voor het gebruik van de ribosoomprofileringsgegevens en RiboCode, een opdrachtregelprogramma om mRNA-translatie op genoombrede schaal en enkele nucleotideresolutie te decoderen. Deze methode maakt het mogelijk om te zoeken naar de nieuwe peptiden die voortkomen uit de genomische regio's buiten de geannoteerde eiwitcoderende genen, en biedt de mogelijkheid om de snelheid van mRNA-translatie te kwantificeren.Open om te beginnen een Linux-terminalvenster en maak een conda-omgeving door de opdracht uit te voeren. Schakel over naar de gemaakte omgeving en installeer RiboCode en afhankelijkheden door de opdracht uit te voeren. Om de genoomreferentiebestanden voor de referentiesequentie te krijgen, gaat u naar de Ensembl-website en klikt u op downloaden, gevolgd door FTP-download.Klik op de fasta optie in de kolom DNA FASTA en selecteer de rij waar de soort mens is, weergegeven in de tabel op de website pagina. Kopieer op de ensembl-websitepagina de link zoals vermeld in de tekst en download en pak de bestanden in de terminal uit door de opdracht uit te voeren. Voor referentieannotatie klikt u met de rechtermuisknop op GTF in de kolom genensets op de laatst geopende webpagina.Kopieer de koppeling en download deze met de opdracht. Om rRNA-sequenties te krijgen, opent u UCSC-genoombrowser, klikt u op Gereedschappen en selecteert u tabelbrowser in de vervolgkeuzelijst. Geef op de UCSC-genoombrowserpagina zoogdier op voor clade, mens voor genoom, alle tabellen voor groep, R-masker voor tabel en genoom voor regio.Klik voor filter op maken om naar een nieuwe pagina te gaan en stel de rep-klasse in zoals overeenkomt met rRNA. Klik op verzenden en stel vervolgens de uitvoerindeling in op volgorde en de naam van het uitvoerbestand als HG38_rRNA. FA. Klik ten slotte op uitvoer ophalen en selecteer vervolgens sequentie ophalen om de rRNA-sequentie op te halen.Als u ribosoomprofileringsgegevenssets wilt ophalen uit het sequentieleesarchief, downloadt u de replicaatmonsters van de si-eIFe-behandelingsgroep en wijzigt u de naam ervan door de opdracht uit te voeren. Download vervolgens de replicatievoorbeelden van de controlegroep en wijzig de naam ervan door de opdracht uit te voeren. Als u rRNA-verontreiniging wilt verwijderen, begint u met het indexeren van rRNA-referentiesequenties door de opdracht uit te voeren.Lijn na het indexeren de reads uit op rRNA-referentie om de reads afkomstig van rRNA uit te sluiten door de opdracht uit te voeren. Begin met het maken van een genoomindex door het commando uit te voeren. Lijn vervolgens de clean reads zonder rRNA-besmetting uit op de gemaakte verwijzing door de opdracht uit te voeren en sorteer en indexeer vervolgens uitlijningsbestanden door de opdracht uit te voeren.Bereid de transcriptannotaties voor door de opdracht uit te voeren. Selecteer ribosoombeschermde fragmenten van specifieke lengtes en identificeer hun P-siteposities door de opdracht uit te voeren. Bewerk de configuratiebestanden voor elk voorbeeld en voeg ze samen.Voer vervolgens RiboCode uit door de opdracht uit te voeren. De frequentieverdeling van de lengtes van de metingen toonde aan dat de meeste ribosoom beschermde fragmenten overeenkomen met 25 tot 35 nucleotiden. De P-site locaties voor verschillende lengtes van ribosoom beschermde fragmenten werden bepaald door de afstanden van hun vijf priemeinden tot de geannoteerde start- en stopcodons te onderzoeken.De mappingresultaten laten zien dat 10.394 genen coderen voor geannoteerde open leesframes. Verder coderen 509 en 168 genen voor upstream en downstream open leesframes, terwijl 939 genen coderen voor upstream of downstream open leesframes, overlapt met bekende geannoteerde open leesframes. Verder coderen 68 eiwitcoderende genen en 2.601 niet-coderende genen voor nieuwe open leesframes.Lengteverdeling toonde aan dat stroomopwaarts, stroomafwaarts, nieuwe en overlappende open leesframes korter waren dan de geannoteerde open leesframes. Relatieve ribosoom beschermde fragmenttellingen werden berekend voor elk open leesframe, waaruit bleek dat de ribosoomdichtheden van upstream open leesframes significant hoger waren in eIF3e-deficiënte cellen dan in controlecellen. De metagenanalyse onthulde dat een massa ribosomen vastliep tussen codons 25 en 75 stroomafwaarts van het startcodon, wat suggereert dat de translatie-elongatie vroeg kan worden geblokkeerd in eIF3e-deficiënte cellen.De P-sites dichtheidsprofielen voor upstream open leesframes van PSMA6 en downstream open leesframes van gen SENP3-EIF4A1 werden onderzocht, waarbij de periodiciteitspatronen en dichtheden van ribosoom beschermde fragmenten werden aangetoond. Het controleren van de locaties van reads rond de start- en stopcodons van bekende eiwitcoderende regio's is noodzakelijk voor het evalueren van de periodieke eigenschappen van reads voor elke lengte. RiboCode, samen met een andere opdrachtregeltool, kan RiboMiner ook kwaliteitscontrole en meerdere analyses uitvoeren, zoals het kwantificeren en visualiseren van de bezetting van de ribosomen op de voorspelde open leesframes.Deze computationele tool biedt een high throughput manier om uncanonische translatiegebeurtenissen te identificeren met ribosoomprofileringsgegevens in specifieke fysiologische contexten, en hoe de translatie moduleert als reactie op de stimulus.

Research

JoVE Journal

Biology

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Proteïne WIJSHEID: Een Workbench voor<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Ontwerp van biomoleculen

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Analyse van de translatie-initiatie tijdens stress Voorwaarden door polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Een eenvoudige methode voor Plant polysoomdisplays Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-deeltje Analyse voor Super-resolutie microscopie met VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

DOVO Generatie van somatische stamcellen door YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: een open source data-integratie tool voor Big Data transcriptomics ontworpen voor de malaria vector Anopheles gambiae

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align en Worm_CP, Twee Open-Source Pipelines voor straightening en kwantificering van fluorescentie beeldgegevens verkregen van Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Beoordeling van de novo Eiwit synthese tarieven in Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...