Name: de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data
Uploaded: 2022-02-18T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר בתמיכת המשאבים החישוביים המסופקים על ידי פלטפורמת HPCC של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג. Z.X. מודה תודה על תוכנית התמיכה בכישרונות טופנוץ' הצעירה של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג.

1. הגדרת סביבה והתקנת RiboCode
<ol><li>פתח חלון מסוף לינוקס וצור סביבת קונדה: conda create -n RiboCode python=3.8
</li>
	<li>עבור לסביבה שנוצרה והתקן את RiboCode ואת יחסי התלות: קונדה להפעיל RiboCode conda install -c bioconda ribocode ribominer sra-tools fastx_toolkit cutadapt עניבת פרפר כוכב samtools
</li>
</ol>2. הכנת נתונים</stro...

<ol>
	<li>Eisenberg, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+Initiation+Site+Profiling+Reveals+Widespread+Synthesis+of+Non-AUG-Initiated+Protein+Isoforms+in+Yeast.">Translation Initiation Site Profiling Reveals Widespread Synthesis of Non-AUG-Initiated Protein Isoforms in Yeast.</a> Cell Systems. 11 (2), 145-160 (2020).</li><li>Spealman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+non-AUG+uORFs+revealed+by+a+novel+regression+analysis+of+ribosome+profiling+data.">Conserved non-AUG uORFs revealed by a novel regression analysis of ribosome profiling data.</a> Genome Research. 28 (2), 214-222 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147 (4), 789-802 (2011).</li><li>Bazzini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+ORFs+in+vertebrates+using+ribosome+footprinting+and+evolutionary+conservation.">Identification of small ORFs in vertebrates using ribosome footprinting and evolutionary conservation.</a> The EMBO Journal. 33 (9), 981-993 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell Reports. 8 (5), 1365-1379 (2014).</li><li>Chew, G. L., Pauli, A., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+uORF+repressiveness+and+sequence+features+in+mouse,+human+and+zebrafish.">Conservation of uORF repressiveness and sequence features in mouse, human and zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 11663 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genome-wide+distribution+and+evolution+of+uORFs+in+eukaryotes.">Determinants of genome-wide distribution and evolution of uORFs in eukaryotes.</a> Nature Communications. 12 (1), 1076 (2021).</li><li>Guenther, U. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+helicase+Ded1p+controls+use+of+near-cognate+translation+initiation+codons+in+5'+UTRs.">The helicase Ded1p controls use of near-cognate translation initiation codons in 5' UTRs.</a> Nature. 559 (7712), 130-134 (2018).</li><li>Goldsmith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+a+functional+role+for+autophagy+in+mRNA+translational+control.">Ribosome profiling reveals a functional role for autophagy in mRNA translational control.</a> Communications Biology. 3 (1), 388 (2020).</li><li>Magny, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+regulation+of+cardiac+calcium+uptake+by+peptides+encoded+in+small+open+reading+frames.">Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames.</a> Science. 341 (6150), 1116-1120 (2013).</li><li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Molecular Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress.">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li><li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes.">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biology. 16, 90 (2015).</li><li>Chng, S. C., Ho, L., Tian, J., Reversade, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELABELA:+a+hormone+essential+for+heart+development+signals+via+the+apelin+receptor.">ELABELA: a hormone essential for heart development signals via the apelin receptor.</a> Developmental Cell. 27 (6), 672-680 (2013).</li><li>Pauli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toddler:+an+embryonic+signal+that+promotes+cell+movement+via+Apelin+receptors.">Toddler: an embryonic signal that promotes cell movement via Apelin receptors.</a> Science. 343 (6172), 1248636 (2014).</li><li>Stark, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+functional+elements+in+12+Drosophila+genomes+using+evolutionary+signatures.">Discovery of functional elements in 12 Drosophila genomes using evolutionary signatures.</a> Nature. 450 (7167), 219-232 (2007).</li><li>Lin, M. F., Jungreis, I., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhyloCSF:+a+comparative+genomics+method+to+distinguish+protein+coding+and+non-coding+regions.">PhyloCSF: a comparative genomics method to distinguish protein coding and non-coding regions.</a> Bioinformatics. 27 (13), 275-282 (2011).</li><li>Slavoff, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+discovery+of+short+open+reading+frame-encoded+peptides+in+human+cells.">Peptidomic discovery of short open reading frame-encoded peptides in human cells.</a> Nature Chemical Biology. 9 (1), 59-64 (2013).</li><li>Schwaid, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+discovery+of+cysteine-containing+human+short+open+reading+frames.">Chemoproteomic discovery of cysteine-containing human short open reading frames.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (45), 16750-16753 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation+and+quantitation+of+translation+by+ribosome+profiling.">Genome-wide annotation and quantitation of translation by ribosome profiling.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 1-19 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Xiao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+annotation+and+characterization+of+the+translatome+with+ribosome+profiling+data.">De novo annotation and characterization of the translatome with ribosome profiling data.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 61 (2018).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF3+Associates+with+80S+Ribosomes+to+Promote+Translation+Elongation,+Mitochondrial+Homeostasis,+and+Muscle+Health.">eIF3 Associates with 80S Ribosomes to Promote Translation Elongation, Mitochondrial Homeostasis, and Muscle Health.</a> Molecular Cell. 79 (4), 575-587 (2020).</li><li>. AGAT: Another Gff Analysis Toolkit to handle annotations in any GTF/GFF format Available from: <a target="_blank" href="https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html">https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html</a> (2020)</li><li>. Gene Expression Omnibus Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo">https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo</a> (2002)</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>. STAR manual Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf">https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf</a> (2022)</li><li>. The genetic codes Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi</a> (2019)</li><li>. RiboMiner Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboMiner">https://github.com/xryanglab/RiboMiner</a> (2020)</li><li>Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+global+views+of+translation.">Ribosome profiling: global views of translation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), 032698 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+translation+initiation+sites+in+mammalian+cells+at+single-nucleotide+resolution.">Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+initiating+ribosomes+in+vivo.">Quantitative profiling of initiating ribosomes in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 147-153 (2015).</li><li>Spealman, P., Naik, A., McManus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uORF-seqr:+A+Machine+Learning-Based+approach+to+the+identification+of+upstream+open+reading+frames+in+yeast.">uORF-seqr: A Machine Learning-Based approach to the identification of upstream open reading frames in yeast.</a> Methods in Molecular Biol. 2252, 313-329 (2021).</li><li>. RiboCode Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboCode">https://github.com/xryanglab/RiboCode</a> (2018)</li><li>Sharma, P., Wu, J., Nilges, B. S., Leidel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+and+other+commonly+used+model+organisms+are+resistant+to+cycloheximide-mediated+biases+in+ribosome+profiling+experiments.">Humans and other commonly used model organisms are resistant to cycloheximide-mediated biases in ribosome profiling experiments.</a> Nature Communications. 12 (1), 5094 (2021).</li></ol>

פרופיל ריבוזום מציע הזדמנות חסרת תקדים ללמוד את פעולת הריבוזומים בתאים בקנה מידה של גנום. פענוח מדויק של המידע הנישאים על ידי נתוני פרופיל הריבוזום יכול לספק תובנה אילו אזורים של גנים או תמלילים מתורגמים באופן פעיל. פרוטוקול שלב אחר שלב זה מספק הדרכה כיצד להשתמש ב- RiboCode כדי לנתח נתוני פרופ...

לאחרונה, גוף גדל והולך של מחקרים חשף ייצור נרחב של פפטידים שתורגמו מ ORFs של גנים קידוד ואת הגנים ביאורים בעבר כמו noncoding, כגון ארוך noncoding RNAs (lncRNAs)1,2,2,3,4,5,6,7,8. ORFs מתורגמים אלה מוסדרים או מושרים על ידי תאים כדי להגיב לשינויים סביבתיים, מתח, ובידול תאים1,8,9,10,11,12,13. מוצרי התרגום של כמה ORFs הוכחו לשחק תפקידים רגולטוריים חשובים בתהליכים ביולוגיים מגוונים בפיתוח ופיזיולוגיה. לדוגמה, Chng et al.14 גילה הורמון פפטיד בשם Elabela (אלה, הידוע גם בשם Apela / Ende / פעוט), אשר קריטי להתפתחות הלב וכלי הדם. פאולי ואח ' הציע כי אלה פועלת גם כמיטוגן המקדם נדידת תאים בעובר הדגים המוקדם15. Magny et al. דיווח על שני micropeptides של פחות מ 30 חומצות אמינו ויסות הובלת סידן ומשפיע על התכווצות שרירים רגילה בלב Drosophila10.
עדיין לא ברור כמה פפטידים כאלה מקודדים על ידי הגנום והאם הם רלוונטיים ביולוגית. לכן, זיהוי שיטתי של ORFs אלה קידוד פוטנציאלי רצוי מאוד. עם זאת, קביעה ישירה של המוצרים של ORFs אלה (כלומר, חלבון או פפטיד) באמצעות גישות מסורתיות כגון שימור אבולוציוני16,17 וספקטרומטריית מסה18,19 היא מאתגרת מכיוון שיעילות הזיהוי של שתי הגישות תלויה באורך, בשפע ובהרכב חומצות האמינו של החלבונים או הפפטידים המיוצרים. הופעתו של פרופיל ריבוזום, טכניקה לזיהוי התפוסה ריבוזום על mRNAs ברזולוציה נוקלאוטיד, סיפקה דרך מדויקת להעריך את פוטנציאל הקידוד של תמלילים שונים3,20,21, ללא קשר לאורכם ולהרכבם. תכונה חשובה ומשמשת לעתים קרובות לזיהוי תרגום פעיל של ORFs באמצעות פרופיל ריבוזום היא תקופת שלושת הנוקלאוטידים (3-nt) של עקבות הריבוזום על mRNA מהקודון ההתחלה ועד קודון העצירה. עם זאת, נתוני פרופיל ריבוזום לעתים קרובות יש מספר בעיות, כולל קריאות רצף נמוכות ודלילות לאורך ORFs, רעש רצף גבוה, וזיהומי RNA ריבוזומי (rRNA). לפיכך, האותות המעוותים והדו-משמעיים הנוצרים על ידי נתונים כאלה מחלישים את דפוסי התקופתיות של 3-nt של עקבות הריבוזומים על mRNA, מה שבסופו של דבר מקשה על זיהוי ה- ORFs המתורגמים בביטחון גבוה.
חבילה בשם "RiboCode" התאימה מבחן כיתה חתום וילקוקסון שונה ואסטרטגיית אינטגרציה P-ערך כדי לבחון אם ORF יש באופן משמעותי יותר בתוך מסגרת שברים מוגנים ריבוזום (RPFs) מאשר מחוץ למסגרת RPFs22. הוא הוכח כיעיל ביותר, רגיש ומדויק לביאור דה נובו של התרגום בנתוני פרופיל ריבוזום מדומים ואמיתיים. כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש בכלי זה כדי לזהות את ORFs התרגום הפוטנציאלי מתוך ערכות נתונים רצף פרופיל ריבוזום גלם שנוצר על ידי המחקר הקודם23. ערכות נתונים אלה שימשו כדי לחקור את הפונקציה של יחידת המשנה EIF3 "E" (EIF3E) בתרגום על ידי השוואת פרופילי תפוסת הריבוזום של תאי MCF-10A שהודבקו בבקרה (si-Ctrl) ו- EIF3E (si-eIF3e) RNAs קטנים מפריעים (siRNAs). על ידי החלת RiboCode על ערכות נתונים לדוגמה אלה, זיהינו 5,633 ORFs רומן פוטנציאל קידוד פפטידים קטנים או חלבונים. ORFs אלה סווגו לסוגים שונים בהתבסס על מיקומם ביחס לאזורי הקידוד, כולל ORFs במעלה הזרם (uORFs), ORFs במורד הזרם (dORFs), ORFs חופפים, ORFs מגנים חדשניים לקידוד חלבונים (PCGs חדשניים), ו- ORFs מ קידוד nonprotein חדשני (גנים חדשניים NonPCGs). צפיפות הקריאה של RPF על UORFs גדלה באופן משמעותי בתאים לקויי EIF3E בהשוואה לתאי בקרה, אשר עשויים להיגרם לפחות באופן חלקי על ידי העשרה של ריבוזומים תרגום פעיל. הצטברות ריבוזום מקומית באזור מן הקודון ה - 25 עד ה - 75 של תאים לקוי EIF3E הצביע על חסימה של התארכות התרגום בשלב המוקדם. פרוטוקול זה גם מראה כיצד לדמיין את צפיפות ה- RPF של האזור הרצוי לבחינת דפוסי המחזור של 3 nt של עקבות ריבוזום על ORFs מזוהים. ניתוחים אלה מדגימים את התפקיד החזק של RiboCode בזיהוי תרגום ORFs וללמוד את הרגולציה של תרגום.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A computer/server running Linux</td>
			<td>Any</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaconda or Miniconda</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>-</td>
			<td>Anaconda: https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data

זיהוי של מסגרות קריאה פתוחות (ORFs), במיוחד אלה קידוד פפטידים קטנים ותרגום פעיל תחת הקשרים פיזיולוגיים ספציפיים, הוא קריטי לביאורים מקיפים של תרגומים תלויי הקשר. פרופיל ריבוזום, טכניקה לזיהוי מיקומים וצפיפות מחייבים של תרגום ריבוזומים ב- RNA, מציע שדרה לגלות במהירות היכן מתרחש תרגום בקנה מידה רחב של הגנום. עם זאת, זה לא משימה טריוויאלית בביואינפורמטיקה לזהות ביעילות ובאופן מקיף את ORFs תרגום עבור פרופיל ריבוזום. מתואר כאן היא חבילה קלה לשימוש, בשם RiboCode, שנועדה לחפש תרגום פעיל ORFs בכל גודל מאותות מעוותים ודו-משמעיים בנתוני פרופיל ריבוזום. אם ניקח את ערכת הנתונים שפורסמה בעבר כדוגמה, מאמר זה מספק הוראות שלב אחר שלב עבור צינור RiboCode כולו, מעיבוד מראש של הנתונים הגולמיים ועד לפרשנות של קבצי תוצאות הפלט הסופיים. יתר על כן, להערכת שיעורי התרגום של ORFs המובאים, הליכים להדמיה וכימות של צפיפות ריבוזום על כל ORF מתוארים גם בפירוט. לסיכום, המאמר הנוכחי הוא הוראה שימושית ומתוזמנת לתחומי המחקר הקשורים לתרגום, ORFs קטנים ופפטידים.

ערכות הנתונים לדוגמה של יצירת פרופיל ריבוזום הופקדו במסד הנתונים של GEO תחת מספר הגישה GSE131074. כל הקבצים והקודים המשמשים בפרוטוקול זה זמינים מקבצים משלימים 1-4. על ידי החלת RiboCode על קבוצה של ערכות נתונים פרופיל ריבוזום שפורסם23, זיהינו את הרומן ORFs בתרגום ...

Watch this Scientific Journal Video about De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data at JoVE.com

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

תרגום ריבוזומים מפענח שלושה נוקלאוטידים לכל קודון לפפטידים. תנועתם לאורך mRNA, שנתפסה על ידי פרופיל ריבוזום, מייצרת את העקבות המציגות תקופת שלישייה אופיינית. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש RiboCode כדי לפענח תכונה בולטת זו מנתוני פרופיל ריבוזום כדי לזהות מסגרות קריאה פתוחות בתרגום פעיל ברמת התמלול המלא.

De novo זיהוי של מסגרות קריאה פתוחות בתרגום פעיל עם נתוני יצירת פרופילים של ריבוזום

Identification of open reading frames (ORFs), especially those encoding small peptides and being actively translated under specific physiological ...

פרשנות נתוני הרצף הנוצרים על ידי ניסוי פרופיל הריבוזום היא קריטית למדידה כמותית של הפעילות התרגומית של ריבוזומים ב- mRNA, וללימוד המנגנונים של רגולציה תרגומית. בפרוטוקול זה, נתאר את ההליך החישובי לניצול נתוני פרופיל הריבוזום ו- RiboCode, כלי שורת פקודה לפענוח תרגום mRNA בקנה מידה רחב הגנום ורזולוציית נוקלאוטיד בודדת. שיטה זו מאפשרת לחפש את הפפטידים החדשניים הנובעים מהאזורים הגנומיים מחוץ לגנים לקידוד חלבונים מובאים, ומציעה הזדמנות לכמת את קצב תרגום ה- mRNA.כדי להתחיל, פתח חלון מסוף Linux וצור סביבת קונדה על-ידי ביצוע הפקודה. עבור לסביבה שנוצרה והתקן את RiboCode ואת יחסי התלות על-ידי ביצוע הפקודה. כדי לקבל את קבצי ההפניה לגנום עבור רצף ההפניות, עבור אל אתר האינטרנט של אנסמבל ולאחר מכן לחץ על הורד ולאחר מכן על הורדת FTP.לחץ על האפשרות FASTA בעמודה DNA FASTA ובחר את השורה שבה מינים הם בני אדם, המוצגת בטבלה בדף האתר. בדף אתר האינטרנט של אנסמבל, העתק את הקישור כאמור בטקסט ולאחר מכן הורד ופתח את הקבצים במסוף על-ידי ביצוע הפקודה. לקבלת ביאור הפניה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על GTF בערכות הגנים של העמודות בדף האינטרנט הפתוח האחרון.העתק את הקישור והורד אותו באמצעות הפקודה. כדי לקבל רצפי rRNA, פתח את דפדפן הגנום של UCSC ולאחר מכן לחץ על כלים ובחר דפדפן טבלה ברשימה הנפתחת. בדף דפדפן הגנום של UCSC, ציין יונק עבור clade, אדם לגנום, כל הטבלאות לקבוצה, מסכת R לשולחן וגנום לאזור.עבור סינון, לחץ על צור כדי לעבור לדף חדש, והגדר מחלקת נציג בהתאם ל- rRNA. לחץ על שלח ולאחר מכן הגדר את תבנית הפלט לרצף ואת שם קובץ הפלט HG38_rRNA. FA. לבסוף, לחץ על קבל פלט ולאחר מכן בחר קבל רצף כדי לאחזר את רצף rRNA.כדי לקבל ערכות נתונים ליצירת פרופילים של ריבוזום מארכיון קריאת רצף, הורד את הדוגמאות המשוכפלות של קבוצת הטיפול si-eIFe ושנה את שמן על-ידי ביצוע הפקודה. לאחר מכן הורד את הדוגמאות המשוכפלות של קבוצת הביקורת ושנה את שמן על-ידי ביצוע הפקודה. כדי להסיר זיהום rRNA, התחל ליצור אינדקס של רצפי הפניות rRNA על-ידי ביצוע הפקודה.לאחר יצירת אינדקס, יישר את הקריאות להפניה ל- rRNA כדי לשלול את הקריאות שמקורן ב- rRNA על-ידי ביצוע הפקודה. התחל ביצירת אינדקס גנום על-ידי ביצוע הפקודה. לאחר מכן יישר את הקריאות הנקיות ללא זיהום rRNA להפניה שנוצרה על-ידי ביצוע הפקודה ולאחר מכן מיין ויישור קבצי יישור אינדקס על-ידי ביצוע הפקודה.הכן את ביאורי התמליל על-ידי ביצוע הפקודה. בחר שברים מוגנים ריבוזום באורכים ספציפיים, וזיהה את מיקומי אתר P שלהם על-ידי ביצוע הפקודה. ערוך את קבצי התצורה עבור כל דוגמה ומזג אותם.לאחר מכן הפעל את RiboCode על-ידי ביצוע הפקודה. התפלגות התדירות של אורכי הקריאות הראתה שרוב הקטעים המוגנים על ריבוזום תואמים ל -25 עד 35 נוקלאוטידים. מיקומי אתר P לאורכים שונים של שברים מוגנים ריבוזום נקבעו על ידי בחינת המרחקים מחמשת הקצוות העיקריים שלהם להתחלה המובאת ולעצירה קודונים.תוצאות המיפוי מראות כי 10, 394 גנים מקודדים עבור מסגרות קריאה פתוחות עם הערות. יתר על כן, 509 ו -168 גנים מקודדים עבור מסגרות קריאה פתוחות במעלה ובמורד הזרם, בעוד 939 גנים מקודדים עבור מסגרות קריאה פתוחות במעלה הזרם או במורד הזרם, חופפים עם מסגרות קריאה פתוחות ידועות. יתר על כן, 68 גנים לקידוד חלבונים ו-2,601 גנים שאינם מקודדים עבור מסגרות קריאה פתוחות חדשניות.התפלגות אורך הראתה כי במעלה הזרם, במורד הזרם, ברומן ובמסגרות הקריאה הפתוחות החופפות היו קצרות יותר ממסגרות הקריאה הפתוחות המובאות. ספירות שברים מוגנים יחסית של ריבוזום חושבו עבור כל מסגרת קריאה פתוחה, וחשפו כי צפיפות הריבוזום של מסגרות קריאה פתוחות במעלה הזרם היו גבוהות משמעותית בתאים לקויים eIF3e מאשר בתאי בקרה. ניתוח המטגן גילה כי מסה של ריבוזומים נתקעה בין קודונים 25 ו 75 במורד הזרם של קודון ההתחלה, מה שמצביע על כך שהארכת התרגום עשויה להיות חסומה בשלב מוקדם בתאים לקויים eIF3e.פרופילי הצפיפות של אתרי P עבור מסגרות קריאה פתוחות במעלה הזרם של PSMA6 ומסגרות קריאה פתוחות במורד הזרם של הגן SENP3-EIF4A1 נבדקו, מדגימים את דפוסי המחזור ואת הצפיפות של שברים מוגנים ריבוזום. בדיקת המיקומים של קריאות סביב קודונים התחלה והפסקה של אזורי קידוד חלבון ידועים נחוצה להערכת המאפיינים התקופתיים של קריאות עבור כל אורך. RiboCode, יחד עם כלי שורת פקודה נוסף, RiboMiner יכול גם לבצע בקרת איכות וניתוחים מרובים כגון כימות והדמיה של תפוסות הריבוזומים על מסגרות הקריאה הפתוחות החזויות.כלי חישובי זה מספק דרך תפוקה גבוהה לזהות אירועי תרגום לא קנוניים עם נתוני פרופיל ריבוזום בהקשרים פיזיולוגיים ספציפיים, וכיצד התרגום מווסת בתגובה לגירוי.

Research

JoVE Journal

Biology

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

חוכמת חלבון: Workbench ל<em&gt; בסיליקון</em&gt;<em&gt; דה נובו</em&gt; עיצוב של ביומולקולות

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

זרימת עבודה עבור גבוהה תוכן, כימות תא יחידה של פלורסנט סמנים מUniversal מיקרוסקופים נתונים, הנתמכים על ידי תוכנות קוד פתוחות

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

דה נובו דור בתאי גזע סומאטית מאת הפה/טאז

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: שילוב נתונים קוד פתוח כלי אינטגרציה עבור נתונים גדולים הטרנססקריפט מיועד וקטור מלריה אנופלס gambiae

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

ליישר תולעת Worm_CP, שני צינורות קוד פתוח ליישור וכימות של נתוני תמונה פלואורסצנטיים המתקבלים מ- Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

הערכה של דה נובו חלבון סינתזה שיעורי Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...