Name: de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data
Uploaded: 2022-02-18T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data at JoVE.com

著者らは、西安交通大学のHPCCプラットフォームによって提供される計算リソースからの支援に感謝したい。Z.X.は、西安交通大学のヤング・トップ・ノッチ・タレント・サポート・プランに感謝の意を表します。

1. 環境設定とリボコードのインストール
<ol><li>Linux 端末ウィンドウを開き、conda 環境を作成します。 conda create -n RiboCode python=3.8
</li>
	<li>作成した環境に切り替えて、RiboCode と依存関係をインストールします。 コンダはリボコードをアクティブにする conda install -c bioconda ribocode ribominer sra-tools fastx_toolkit cutadapt bowtie star samtools
</li>
</ol>2. ?...

<ol>
	<li>Eisenberg, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+Initiation+Site+Profiling+Reveals+Widespread+Synthesis+of+Non-AUG-Initiated+Protein+Isoforms+in+Yeast.">Translation Initiation Site Profiling Reveals Widespread Synthesis of Non-AUG-Initiated Protein Isoforms in Yeast.</a> Cell Systems. 11 (2), 145-160 (2020).</li><li>Spealman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+non-AUG+uORFs+revealed+by+a+novel+regression+analysis+of+ribosome+profiling+data.">Conserved non-AUG uORFs revealed by a novel regression analysis of ribosome profiling data.</a> Genome Research. 28 (2), 214-222 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147 (4), 789-802 (2011).</li><li>Bazzini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+ORFs+in+vertebrates+using+ribosome+footprinting+and+evolutionary+conservation.">Identification of small ORFs in vertebrates using ribosome footprinting and evolutionary conservation.</a> The EMBO Journal. 33 (9), 981-993 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell Reports. 8 (5), 1365-1379 (2014).</li><li>Chew, G. L., Pauli, A., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+uORF+repressiveness+and+sequence+features+in+mouse,+human+and+zebrafish.">Conservation of uORF repressiveness and sequence features in mouse, human and zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 11663 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genome-wide+distribution+and+evolution+of+uORFs+in+eukaryotes.">Determinants of genome-wide distribution and evolution of uORFs in eukaryotes.</a> Nature Communications. 12 (1), 1076 (2021).</li><li>Guenther, U. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+helicase+Ded1p+controls+use+of+near-cognate+translation+initiation+codons+in+5'+UTRs.">The helicase Ded1p controls use of near-cognate translation initiation codons in 5' UTRs.</a> Nature. 559 (7712), 130-134 (2018).</li><li>Goldsmith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+a+functional+role+for+autophagy+in+mRNA+translational+control.">Ribosome profiling reveals a functional role for autophagy in mRNA translational control.</a> Communications Biology. 3 (1), 388 (2020).</li><li>Magny, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+regulation+of+cardiac+calcium+uptake+by+peptides+encoded+in+small+open+reading+frames.">Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames.</a> Science. 341 (6150), 1116-1120 (2013).</li><li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Molecular Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress.">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li><li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes.">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biology. 16, 90 (2015).</li><li>Chng, S. C., Ho, L., Tian, J., Reversade, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELABELA:+a+hormone+essential+for+heart+development+signals+via+the+apelin+receptor.">ELABELA: a hormone essential for heart development signals via the apelin receptor.</a> Developmental Cell. 27 (6), 672-680 (2013).</li><li>Pauli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toddler:+an+embryonic+signal+that+promotes+cell+movement+via+Apelin+receptors.">Toddler: an embryonic signal that promotes cell movement via Apelin receptors.</a> Science. 343 (6172), 1248636 (2014).</li><li>Stark, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+functional+elements+in+12+Drosophila+genomes+using+evolutionary+signatures.">Discovery of functional elements in 12 Drosophila genomes using evolutionary signatures.</a> Nature. 450 (7167), 219-232 (2007).</li><li>Lin, M. F., Jungreis, I., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhyloCSF:+a+comparative+genomics+method+to+distinguish+protein+coding+and+non-coding+regions.">PhyloCSF: a comparative genomics method to distinguish protein coding and non-coding regions.</a> Bioinformatics. 27 (13), 275-282 (2011).</li><li>Slavoff, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+discovery+of+short+open+reading+frame-encoded+peptides+in+human+cells.">Peptidomic discovery of short open reading frame-encoded peptides in human cells.</a> Nature Chemical Biology. 9 (1), 59-64 (2013).</li><li>Schwaid, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+discovery+of+cysteine-containing+human+short+open+reading+frames.">Chemoproteomic discovery of cysteine-containing human short open reading frames.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (45), 16750-16753 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation+and+quantitation+of+translation+by+ribosome+profiling.">Genome-wide annotation and quantitation of translation by ribosome profiling.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 1-19 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Xiao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+annotation+and+characterization+of+the+translatome+with+ribosome+profiling+data.">De novo annotation and characterization of the translatome with ribosome profiling data.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 61 (2018).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF3+Associates+with+80S+Ribosomes+to+Promote+Translation+Elongation,+Mitochondrial+Homeostasis,+and+Muscle+Health.">eIF3 Associates with 80S Ribosomes to Promote Translation Elongation, Mitochondrial Homeostasis, and Muscle Health.</a> Molecular Cell. 79 (4), 575-587 (2020).</li><li>. AGAT: Another Gff Analysis Toolkit to handle annotations in any GTF/GFF format Available from: <a target="_blank" href="https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html">https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html</a> (2020)</li><li>. Gene Expression Omnibus Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo">https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo</a> (2002)</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>. STAR manual Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf">https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf</a> (2022)</li><li>. The genetic codes Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi</a> (2019)</li><li>. RiboMiner Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboMiner">https://github.com/xryanglab/RiboMiner</a> (2020)</li><li>Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+global+views+of+translation.">Ribosome profiling: global views of translation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), 032698 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+translation+initiation+sites+in+mammalian+cells+at+single-nucleotide+resolution.">Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+initiating+ribosomes+in+vivo.">Quantitative profiling of initiating ribosomes in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 147-153 (2015).</li><li>Spealman, P., Naik, A., McManus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uORF-seqr:+A+Machine+Learning-Based+approach+to+the+identification+of+upstream+open+reading+frames+in+yeast.">uORF-seqr: A Machine Learning-Based approach to the identification of upstream open reading frames in yeast.</a> Methods in Molecular Biol. 2252, 313-329 (2021).</li><li>. RiboCode Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboCode">https://github.com/xryanglab/RiboCode</a> (2018)</li><li>Sharma, P., Wu, J., Nilges, B. S., Leidel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+and+other+commonly+used+model+organisms+are+resistant+to+cycloheximide-mediated+biases+in+ribosome+profiling+experiments.">Humans and other commonly used model organisms are resistant to cycloheximide-mediated biases in ribosome profiling experiments.</a> Nature Communications. 12 (1), 5094 (2021).</li></ol>

リボソームプロファイリングは、細胞におけるリボソームの作用をゲノムスケールで研究する前例のない機会を提供します。リボソームプロファイリングデータによって運ばれる情報を正確に解読することで、遺伝子または転写産物のどの領域が積極的に翻訳されているかについての洞察が得られる可能性があります。このステップバイステップのプロトコルは、パッケージのインストール?...

最近、ますます多くの研究により、コード遺伝子のORFおよび以前に注釈が付けられた遺伝子から翻訳されたペプチドが、長い非コードRNA(lncRNA)1、2、3、4、5、6、7、8などの非コードとして広く産生されることが明らかになりました。これらの翻訳ORFは、環境変化、ストレス、および細胞分化に応答するように細胞によって調節または誘導される1、8、9、10、11、12、13。いくつかのORFの翻訳産物は、発生および生理学における多様な生物学的プロセスにおいて重要な調節的役割を果たすことが実証されている。例えば、Chngら14は、心血管の発達に重要なエラベラ(Ela、Apela/Ende/Toddlerとしても知られている)という名前のペプチドホルモンを発見しました。Pauliらは、エラが初期魚の胚における細胞移動を促進するマイトジェンとしても作用することを示唆した15。Magnyらは、カルシウム輸送を調節し、ショウジョウバエの心臓における規則的な筋肉収縮に影響を及ぼす30アミノ酸未満の2つのマイクロペプチドを報告した10。
そのようなペプチドがゲノムによってコードされている数と、それらが生物学的に関連性があるかどうかは不明のままである。したがって、これらの潜在的にコードORFの系統的同定は非常に望ましい。しかしながら、進化的保存16,17および質量分析18,19などの伝統的なアプローチを用いて、これらのORFの産物(すなわち、タンパク質またはペプチド)を直接決定することは、両方のアプローチの検出効率が産生されたタンパク質またはペプチドの長さ、存在量、およびアミノ酸組成に依存するため、困難である。ヌクレオチド分解能でmRNA上のリボソーム占有率を同定する技術であるリボソームプロファイリングの出現は、その長さおよび組成に関係なく、異なる転写産物のコードポテンシャルを評価する正確な方法を提供しました3、20、21。リボソームプロファイリングを用いて能動的に翻訳するORFを同定するために重要かつ頻繁に使用される特徴は、開始コドンから終止コドンまでのmRNA上のリボソームのフットプリントの3ヌクレオチド(3-nt)周期性である。しかし、リボソームプロファイリングデータには、ORFに沿った低シーケンシングリードとスパースシーケンシングリード、高いシーケンシングノイズ、リボソームRNA(rRNA)汚染など、いくつかの問題があることがよくあります。したがって、このようなデータによって生成される歪んだ曖昧なシグナルは、mRNA上のリボソームのフットプリントの3-nt周期性パターンを弱め、最終的に高信頼の翻訳ORFの同定を困難にする。
「RiboCode」という名前のパッケージは、修正されたウィルコクソン符号化検定とP値統合戦略を適応させ、ORFがオフフレームRPFよりも有意に多くのインフレームリボソーム保護フラグメント(RPF)を有するかどうかを調べた22。これは、シミュレートされた実際のリボソームプロファイリングデータにおける翻訳体のde novo注釈に対して、非常に効率的で、敏感で、正確であることが実証された。ここでは、このツールを使用して、前の研究によって生成された生のリボソームプロファイリングシーケンシングデータセットから潜在的な翻訳ORFを検出する方法について説明します23。これらのデータセットは、コントロール(si-Ctrl)およびEIF3E(si-eIF3e)小干渉RNA(siRNA)を導入したMCF-10A細胞のリボソーム占有プロファイルを比較することによって、翻訳におけるEIF3サブユニット「E」(EIF3E)の機能を探索するために使用されていた。これらのサンプルデータセットにRiboCodeを適用することにより、小さなペプチドまたはタンパク質をコードする可能性のある5,633の新規ORFを検出しました。これらのORFは、上流ORF(uORF)、下流ORF(dORF)、重複ORF、新規タンパク質コード遺伝子由来のORF(新規PCG)、新規非タンパク質コード遺伝子由来のORF(新規NonPCG)など、コード領域に対する位置に基づいて様々なタイプに分類された。uORFのRPF読み取り密度は、対照細胞と比較してEIF3E欠損細胞において有意に増加し、これは少なくとも部分的には、能動的に翻訳されるリボソームの濃縮によって引き起こされる可能性がある。EIF3E欠損細胞のコドン25番目から75番目までの領域に局在するリボソーム蓄積は、初期段階における翻訳伸長の閉塞を示した。このプロトコルはまた、同定されたORF上のリボソームフットプリントの3-nt周期性パターンを調べるために、所望の領域のRPF密度を視覚化する方法も示している。これらの分析は、翻訳ORFを特定し、翻訳の規制を研究する上でのRiboCodeの強力な役割を示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A computer/server running Linux</td>
			<td>Any</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaconda or Miniconda</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>-</td>
			<td>Anaconda: https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data

オープンリーディングフレーム(ORF)、特に小さなペプチドをコードし、特定の生理学的文脈の下で積極的に翻訳されるフレームの同定は、文脈依存性翻訳体の包括的な注釈付けにとって重要である。RNA上の翻訳リボソームの結合位置と密度を検出する技術であるリボソームプロファイリングは、翻訳がゲノムワイドスケールでどこで起こっているかを迅速に発見する手段を提供します。しかし、リボソームプロファイリングのために翻訳ORFを効率的かつ包括的に同定することは、バイオインフォマティクスにおいて些細な作業ではありません。ここでは、RiboCodeという名前の使いやすいパッケージで、リボソームプロファイリングデータ内の歪んだあいまいな信号から任意のサイズのORFを積極的に変換するように設計されています。この記事では、以前に公開したデータセットを例にとり、生データの前処理から最終的な出力結果ファイルの解釈まで、RiboCodeパイプライン全体について段階的な手順を説明します。さらに、注釈付きORFの翻訳速度を評価するための、各ORF上のリボソーム密度の可視化および定量化のための手順も詳細に説明される。要約すると、本稿は、翻訳、小型ORF、およびペプチドに関連する研究分野のための有用かつタイムリーな指示である。

リボソームプロファイリングデータセットの例は、アクセッション番号GSE131074でGEOデータベースに寄託されました。このプロトコルで使用されるすべてのファイルとコードは、補足ファイル 1 ~ 4 から入手できます。リボソームプロファイリングデータセット23の公開セットにRiboCodeを適用することにより、コントロールおよびEIF3E...

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De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

リボソームを翻訳すると、コドンあたり3つのヌクレオチドがペプチドに解読される。リボソームプロファイリングによって捕捉されたmRNAに沿ったそれらの動きは、特徴的な三重項周期性を示すフットプリントを生成する。このプロトコルでは、RiboCodeを使用してリボソームプロファイリングデータからこの顕著な特徴を解読し、トランスクリプトーム全体でアクティブに翻訳されたオープンリーディングフレームを特定する方法について説明します。

De novo リボソームプロファイリングデータによるアクティブに翻訳されたオープンリーディングフレームの同定

Identification of open reading frames (ORFs), especially those encoding small peptides and being actively translated under specific physiological ...

リボソームプロファイリング実験によって生成されたシーケンシングデータの解釈は、mRNA上のリボソームの翻訳活性を定量的に測定し、翻訳調節のメカニズムを研究するために重要です。本プロトコルでは、リボソームプロファイリングデータを利用するための計算手順と、mRNA翻訳をゲノムワイドスケールかつ一塩基分解能で解読するコマンドラインツールであるRiboCodeについて説明する。この方法は、注釈付きタンパク質コード遺伝子の外側のゲノム領域から生じる新規ペプチドを探索することを可能にし、mRNA翻訳速度を定量する機会を提供する。まず、Linux ターミナルウィンドウを開き、コマンドを実行して conda 環境を作成します。作成した環境に切り替え、コマンドを実行してRiboCodeと依存関係をインストールします。参照配列のゲノム参照ファイルを取得するには、Ensembl の Web サイトにアクセスし、[ダウンロード] をクリックし、[FTP ダウンロード] をクリックします。DNA FASTA列のFASTAオプションをクリックし、ウェブサイトページの表に示されている種がヒトである行を選択します。Ensembl Web サイトのページで、テキストに記載されているリンクをコピーし、コマンドを実行してターミナル内のファイルをダウンロードして解凍します。参照アノテーションのために、最後に開いた Web ページの列遺伝子セットの GTF を右クリックします。リンクをコピーし、コマンドを使用してダウンロードします。rRNA配列を取得するには、UCSCゲノムブラウザを開き、[ツール]をクリックし、ドロップダウンリストでテーブルブラウザを選択します。UCSC ゲノム ブラウザー ページで、クレードに哺乳類、ゲノムにヒト、グループにすべてのテーブル、テーブルに R マスク、領域にゲノムを指定します。[フィルター] で、[作成] をクリックして新しいページに移動し、rRNA と一致するように rep クラスを設定します。[送信] をクリックし、出力形式を sequence に設定し、ファイル名をHG38_rRNAとして出力します。ファ。最後に、[出力を取得] をクリックし、[シーケンスの取得] を選択して rRNA シーケンスを取得します。シーケンス読み取りアーカイブからリボソームプロファイリングデータセットを取得するには、si-eIFe 処理グループの複製サンプルをダウンロードし、コマンドを実行して名前を変更します。次に、制御グループの複製サンプルをダウンロードし、コマンドを実行して名前を変更します。rRNA コンタミネーションを除去するには、コマンドを実行して rRNA 参照配列のインデックス作成を開始します。インデックス作成後、コマンドを実行して、読み取りを rRNA 参照に合わせ、rRNA からの読み取りを除外します。まず、コマンドを実行してゲノムインデックスを作成します。次に、コマンドを実行して、rRNA汚染のないクリーン読み取りを作成された参照にアライメントし、コマンドを実行してファイルをソートおよびインデックス付けします。コマンドを実行してトランスクリプト注釈を準備します。特定の長さのリボソーム保護フラグメントを選択し、コマンドを実行してそれらのPサイト位置を特定します。各サンプルの構成ファイルを編集し、マージします。次に、コマンドを実行して RiboCode を実行します。リードの長さの頻度分布は、ほとんどのリボソーム保護断片が25〜35ヌクレオチドに対応することを示した。異なる長さのリボソーム保護断片のPサイト位置は、それらの5つの素数端から注釈付き開始コドンおよび終止コドンまでの距離を調べることによって決定された。マッピング結果は、10, 394の遺伝子が注釈付きオープンリーディングフレームをコードすることを示している。さらに、509および168の遺伝子が上流および下流のオープンリーディングフレームをコードする一方、939の遺伝子が上流または下流のオープンリーディングフレームのいずれかをコードする、既知の注釈付きオープンリーディングフレームと重複している。さらに、68のタンパク質コード遺伝子および2,601の非コード遺伝子が、新規なオープンリーディングフレームをコードする。長さ分布は、上流、下流、新規、および重なり合ったオープンリーディングフレームが、注釈付きオープンリーディングフレームよりも短いことを示した。リボソーム保護断片の相対数は、各オープンリーディングフレームについて計算され、上流のオープンリーディングフレームのリボソーム密度は、対照細胞よりもeIF3e欠損細胞において有意に高かったことが明らかになった。メタジーン解析により、開始コドンの下流のコドン25と75の間でリボソームの塊が失速していることが明らかになり、eIF3e欠損細胞では翻訳伸長が早期に遮断される可能性が示唆された。PSMA6の上流オープンリーディングフレームおよび遺伝子SENP3-EIF4A1のダウンストリームオープンリーディングフレームのPサイト密度プロファイルを調べ、リボソーム保護断片の周期性パターンおよび密度を実証した。既知のタンパク質コード領域の開始コドンおよび終止コドンの周りのリードの位置を確認することは、各長さのリードの周期的特性を評価するために必要である。RiboCodeは、別のコマンドラインツールとともに、品質管理や、予測されたオープンリーディングフレーム上のリボソーム占有率の定量化や視覚化などの複数の分析を実行することもできます。この計算ツールは、特定の生理学的文脈におけるリボソームプロファイリングデータを使用して非正規の翻訳イベントを識別するための高スループットの方法を提供し、刺激に応答して翻訳がどのように変調するかを提供します。

Research

JoVE Journal

Biology

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

プロテインWISDOM：ベンチ用<em&gt;インシリコで</em&gt;<em&gt;デノボ</em生体分子の&gt;デザイン

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

高コンテンツ、オープンソースソフトウェアでサポートされているユニバーサル顕微鏡データからの蛍光マーカー、個々の細胞定量のワークフロー

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

・ デ ・ ノボヤップ/タズによる体細胞の幹細胞の生成

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx:マラリアベクトルアノフェレスガンビア用に設計されたビッグデータトランスクリプトミクスのためのオープンソースデータ統合ツール

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

ワームアライメントとWorm_CP、カエノハブディティス・エレガンスから得られた蛍光画像データの矯正と定量化のための2つのオープンソースパイプライン

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

カエノハブディティス・エレガンスにおけるデノボタンパク質合成率の評価

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...