Name: de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data
Uploaded: 2022-02-18T13:45:00
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저자는 Xi'an Jiaotong University의 HPCC 플랫폼이 제공하는 컴퓨팅 리소스의 지원을 인정하고 싶습니다. Z.X.는 Xi'an Jiaotong University의 Young Topnotch Talent Support Plan에 감사드립니다.

1. 환경 설정 및 리보코드 설치
<ol><li>Linux 터미널 창을 열고 conda 환경을 만듭니다. conda create -n RiboCode python=3.8
</li>
	<li>생성 된 환경으로 전환하고 RiboCode 및 종속성을 설치하십시오. 콘다 리보 코드 활성화 conda install -c bioconda ribocode ribominer sra-tools fastx_toolkit cutadapt bowtie star samtools
</li>
</ol>2. 데이터 준비
<ol><li>게놈 참조 파일을 가?...

<ol>
	<li>Eisenberg, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+Initiation+Site+Profiling+Reveals+Widespread+Synthesis+of+Non-AUG-Initiated+Protein+Isoforms+in+Yeast.">Translation Initiation Site Profiling Reveals Widespread Synthesis of Non-AUG-Initiated Protein Isoforms in Yeast.</a> Cell Systems. 11 (2), 145-160 (2020).</li><li>Spealman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+non-AUG+uORFs+revealed+by+a+novel+regression+analysis+of+ribosome+profiling+data.">Conserved non-AUG uORFs revealed by a novel regression analysis of ribosome profiling data.</a> Genome Research. 28 (2), 214-222 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147 (4), 789-802 (2011).</li><li>Bazzini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+ORFs+in+vertebrates+using+ribosome+footprinting+and+evolutionary+conservation.">Identification of small ORFs in vertebrates using ribosome footprinting and evolutionary conservation.</a> The EMBO Journal. 33 (9), 981-993 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell Reports. 8 (5), 1365-1379 (2014).</li><li>Chew, G. L., Pauli, A., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+uORF+repressiveness+and+sequence+features+in+mouse,+human+and+zebrafish.">Conservation of uORF repressiveness and sequence features in mouse, human and zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 11663 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genome-wide+distribution+and+evolution+of+uORFs+in+eukaryotes.">Determinants of genome-wide distribution and evolution of uORFs in eukaryotes.</a> Nature Communications. 12 (1), 1076 (2021).</li><li>Guenther, U. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+helicase+Ded1p+controls+use+of+near-cognate+translation+initiation+codons+in+5'+UTRs.">The helicase Ded1p controls use of near-cognate translation initiation codons in 5' UTRs.</a> Nature. 559 (7712), 130-134 (2018).</li><li>Goldsmith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+a+functional+role+for+autophagy+in+mRNA+translational+control.">Ribosome profiling reveals a functional role for autophagy in mRNA translational control.</a> Communications Biology. 3 (1), 388 (2020).</li><li>Magny, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+regulation+of+cardiac+calcium+uptake+by+peptides+encoded+in+small+open+reading+frames.">Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames.</a> Science. 341 (6150), 1116-1120 (2013).</li><li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Molecular Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress.">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li><li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes.">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biology. 16, 90 (2015).</li><li>Chng, S. C., Ho, L., Tian, J., Reversade, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELABELA:+a+hormone+essential+for+heart+development+signals+via+the+apelin+receptor.">ELABELA: a hormone essential for heart development signals via the apelin receptor.</a> Developmental Cell. 27 (6), 672-680 (2013).</li><li>Pauli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toddler:+an+embryonic+signal+that+promotes+cell+movement+via+Apelin+receptors.">Toddler: an embryonic signal that promotes cell movement via Apelin receptors.</a> Science. 343 (6172), 1248636 (2014).</li><li>Stark, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+functional+elements+in+12+Drosophila+genomes+using+evolutionary+signatures.">Discovery of functional elements in 12 Drosophila genomes using evolutionary signatures.</a> Nature. 450 (7167), 219-232 (2007).</li><li>Lin, M. F., Jungreis, I., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhyloCSF:+a+comparative+genomics+method+to+distinguish+protein+coding+and+non-coding+regions.">PhyloCSF: a comparative genomics method to distinguish protein coding and non-coding regions.</a> Bioinformatics. 27 (13), 275-282 (2011).</li><li>Slavoff, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+discovery+of+short+open+reading+frame-encoded+peptides+in+human+cells.">Peptidomic discovery of short open reading frame-encoded peptides in human cells.</a> Nature Chemical Biology. 9 (1), 59-64 (2013).</li><li>Schwaid, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+discovery+of+cysteine-containing+human+short+open+reading+frames.">Chemoproteomic discovery of cysteine-containing human short open reading frames.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (45), 16750-16753 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation+and+quantitation+of+translation+by+ribosome+profiling.">Genome-wide annotation and quantitation of translation by ribosome profiling.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 1-19 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Xiao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+annotation+and+characterization+of+the+translatome+with+ribosome+profiling+data.">De novo annotation and characterization of the translatome with ribosome profiling data.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 61 (2018).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF3+Associates+with+80S+Ribosomes+to+Promote+Translation+Elongation,+Mitochondrial+Homeostasis,+and+Muscle+Health.">eIF3 Associates with 80S Ribosomes to Promote Translation Elongation, Mitochondrial Homeostasis, and Muscle Health.</a> Molecular Cell. 79 (4), 575-587 (2020).</li><li>. AGAT: Another Gff Analysis Toolkit to handle annotations in any GTF/GFF format Available from: <a target="_blank" href="https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html">https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html</a> (2020)</li><li>. Gene Expression Omnibus Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo">https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo</a> (2002)</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>. STAR manual Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf">https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf</a> (2022)</li><li>. The genetic codes Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi</a> (2019)</li><li>. RiboMiner Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboMiner">https://github.com/xryanglab/RiboMiner</a> (2020)</li><li>Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+global+views+of+translation.">Ribosome profiling: global views of translation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), 032698 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+translation+initiation+sites+in+mammalian+cells+at+single-nucleotide+resolution.">Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+initiating+ribosomes+in+vivo.">Quantitative profiling of initiating ribosomes in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 147-153 (2015).</li><li>Spealman, P., Naik, A., McManus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uORF-seqr:+A+Machine+Learning-Based+approach+to+the+identification+of+upstream+open+reading+frames+in+yeast.">uORF-seqr: A Machine Learning-Based approach to the identification of upstream open reading frames in yeast.</a> Methods in Molecular Biol. 2252, 313-329 (2021).</li><li>. RiboCode Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboCode">https://github.com/xryanglab/RiboCode</a> (2018)</li><li>Sharma, P., Wu, J., Nilges, B. S., Leidel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+and+other+commonly+used+model+organisms+are+resistant+to+cycloheximide-mediated+biases+in+ribosome+profiling+experiments.">Humans and other commonly used model organisms are resistant to cycloheximide-mediated biases in ribosome profiling experiments.</a> Nature Communications. 12 (1), 5094 (2021).</li></ol>

리보솜 프로파일링은 게놈 규모로 세포에서 리보솜의 작용을 연구할 수 있는 전례 없는 기회를 제공합니다. 리보솜 프로파일링 데이터에 의해 전달된 정보를 정확하게 해독하면 유전자 또는 전사체의 어느 영역이 활발히 번역되고 있는지에 대한 통찰력을 얻을 수 있다. 이 단계별 프로토콜은 RiboCode를 사용하여 패키지 설치, 데이터 준비, 명령 실행, 결과 설명 및 데이터 시각화를 포함하여 리보?...

최근에, 연구의 증가는 긴 비 코딩 RNA (lncRNAs) 1,2,3,4,5,6,7,8과 같은 비 코딩 유전자와 이전에 주석이 달린 유전자의 ORFs에서 번역 된 펩티드의 광범위한 생산을 밝혀 냈습니다. 이들 번역된 ORF는 환경 변화, 스트레스 및 세포 분화에 반응하기 위해 세포에 의해 조절되거나 유도된다1,8,9,10,11,12,13. 일부 ORF의 번역 제품은 개발 및 생리학의 다양한 생물학적 과정에서 중요한 규제 역할을 수행하는 것으로 입증되었습니다. 예를 들어, Chng et al.14는 심혈관 발달에 중요한 Elabela (Ela, Apela / Ende / Toddler라고도 함)라는 펩티드 호르몬을 발견했습니다. Pauli et al.은 Ela가 초기 물고기 배아에서 세포 이동을 촉진하는 미토겐 역할을한다고 제안했습니다.15. Magny et al.은 칼슘 수송을 조절하고 초파리 심장의 규칙적인 근육 수축에 영향을 미치는 30 개 미만의 아미노산의 두 가지 마이크로 펩타이드를보고했습니다10.
얼마나 많은 그러한 펩티드가 게놈에 의해 암호화되는지, 그리고 그것들이 생물학적으로 관련이 있는지는 불분명하다. 따라서, 이러한 잠재적으로 코딩되는 ORF들의 체계적인 식별은 매우 바람직하다. 그러나, 진화적 보존16,17 및 질량 분광법18,19와 같은 전통적인 접근법을 사용하여 이들 ORFs(즉, 단백질 또는 펩티드)의 생성물을 직접 결정하는 것은 두 접근법의 검출 효율이 생산된 단백질 또는 펩티드의 길이, 풍부도, 및 아미노산 조성에 의존하기 때문에 도전적이다. 뉴클레오티드 분해능에서 mRNAs에 대한 리보솜 점유를 확인하기 위한 기술인 리보솜 프로파일링의 출현은 그들의 길이와 조성에 관계없이 상이한 전사체3,20,21의 코딩 잠재력을 평가하는 정확한 방법을 제공하였다. 리보솜 프로파일링을 사용하여 능동적으로 ORF를 번역하는 것을 확인하기 위해 중요하고 빈번하게 사용되는 특징은 시작 코돈에서 정지 코돈까지 mRNA에 대한 리보솜의 발자국의 3-뉴클레오티드(3-nt) 주기성이다. 그러나 리보솜 프로파일링 데이터에는 ORF를 따른 낮은 시퀀싱 및 희소 시퀀싱 판독, 높은 시퀀싱 노이즈 및 리보솜 RNA(rRNA) 오염 등 몇 가지 문제가 있는 경우가 많습니다. 따라서, 이러한 데이터에 의해 생성된 왜곡되고 모호한 신호는 mRNA에 대한 리보솜의 발자국의 3-nt 주기성 패턴을 약화시키고, 이는 궁극적으로 고신뢰도 번역된 ORF의 식별을 어렵게 만든다.
"RiboCode"라는 패키지는 수정된 Wilcoxon 서명 순위 테스트 및 P-값 통합 전략을 채택하여 ORF가 오프 프레임 RPFs22보다 훨씬 더 많은 프레임 내 리보솜 보호 단편(RPF)을 가지고 있는지 여부를 조사했습니다. 시뮬레이션된 실제 리보솜 프로파일링 데이터에서 트랜스라톰의 de novo 주석에 대해 매우 효율적이고 민감하며 정확한 것으로 입증되었습니다. 여기에서는 이 도구를 사용하여 이전 연구23에서 생성된 원시 리보솜 프로파일링 시퀀싱 데이터 세트에서 잠재적인 번역 ORF를 탐지하는 방법을 설명합니다. 이들 데이터세트는 대조군(si-Ctrl) 및 EIF3E(si-eIF3e) 소형 간섭 RNA(siRNAs)로 형질감염된 MCF-10A 세포의 리보솜 점유 프로파일을 비교함으로써 번역에서 EIF3 서브유닛 "E"( EIF3E )의 기능을 탐색하는데 사용되었다. 이러한 예제 데이터 세트에 RiboCode를 적용함으로써 잠재적으로 작은 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 5,633개의 새로운 ORF를 발견했습니다. 이들 ORF는 업스트림 ORF(uORF), 다운스트림 ORF(dORF), 중첩된 ORF, 신규한 단백질 코딩 유전자(신규한 PCGs)로부터의 ORF, 및 신규한 비단백질 코딩 유전자(신규한 NonPCGs)로부터의 ORF를 포함하는 코딩 영역에 대한 그들의 위치에 기초하여 다양한 유형으로 분류되었다. uORFs에 대한 RPF 판독 밀도는 대조군 세포에 비해 EIF3E 결핍 세포에서 유의하게 증가하였으며, 이는 적어도 부분적으로 능동적으로 번역하는 리보솜의 농축에 의해 야기될 수 있다. EIF3E 결핍 세포의 25번째 코돈으로부터 75번째 코돈까지의 영역에서의 국소화된 리보솜 축적은 초기 단계에서 번역 신장의 막힘을 나타내었다. 이 프로토콜은 또한 식별된 ORF에서 리보솜 발자국의 3-nt 주기성 패턴을 조사하기 위해 원하는 영역의 RPF 밀도를 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이러한 분석은 ORF를 번역하고 번역 규정을 연구하는 RiboCode의 강력한 역할을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A computer/server running Linux</td>
			<td>Any</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaconda or Miniconda</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>-</td>
			<td>Anaconda: https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data

개방 판독 프레임(ORF), 특히 작은 펩티드를 인코딩하고 특정 생리학적 맥락 하에서 활발히 번역되는 프레임의 확인은 문맥-의존적 경쇄의 포괄적인 주석에 매우 중요하다. 리보솜 프로파일링은 RNA에서 리보솜을 번역하는 결합 위치와 밀도를 검출하는 기술로, 게놈 전체 규모에서 번역이 일어나는 곳을 신속하게 발견할 수 있는 방법을 제공합니다. 그러나 생물 정보학에서 리보솜 프로파일 링을위한 번역 ORF를 효율적이고 포괄적으로 식별하는 것은 사소한 작업이 아닙니다. 여기에 설명된 RiboCode라는 사용하기 쉬운 패키지는 리보솜 프로파일링 데이터의 왜곡되고 모호한 신호로부터 모든 크기의 ORF를 능동적으로 번역하도록 설계되었습니다. 이전에 게시된 데이터 세트를 예로 들어 이 문서에서는 원시 데이터의 전처리부터 최종 출력 결과 파일의 해석에 이르기까지 전체 RiboCode 파이프라인에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 또한, 주석이 달린 ORF의 번역률을 평가하기 위해, 각 ORF에 대한 리보솜 밀도의 시각화 및 정량화를 위한 절차도 상세히 설명된다. 요약하면, 본 기사는 번역, 작은 ORF 및 펩티드와 관련된 연구 분야에 유용하고시기 적절한 지침입니다.

예시적인 리보솜 프로파일링 데이터세트는 수탁 번호 GSE131074 하에 GEO 데이터베이스에 기탁되었다. 이 프로토콜에 사용 된 모든 파일과 코드는 보충 파일 1-4에서 사용할 수 있습니다. 공개된 리보솜 프로파일링 세트23의 세트에 리보코드를 적용함으로써, 우리는 대조군 및 EIF3E siRNA로 처리된 MCF-10A 세포에서 활발히 번역된 신규한 ORF를...

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De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

리보솜을 번역하면 코돈 당 세 개의 뉴클레오티드를 펩티드로 해독합니다. 리보솜 프로파일링에 의해 포착된 mRNA를 따른 그들의 움직임은 특징적인 삼중항 주기성을 나타내는 발자국을 생성한다. 이 프로토콜은 RiboCode를 사용하여 리보솜 프로파일링 데이터에서 이 두드러진 기능을 해독하여 전체 전사체 수준에서 활발하게 번역된 열린 판독 프레임을 식별하는 방법을 설명합니다.

데 노보 리보솜 프로파일링 데이터를 사용하여 능동적으로 번역된 오픈 리딩 프레임 식별

Identification of open reading frames (ORFs), especially those encoding small peptides and being actively translated under specific physiological ...

리보솜 프로파일링 실험에 의해 생성된 시퀀싱 데이터의 해석은 mRNA에서 리보솜의 번역 활동을 정량적으로 측정하고 번역 조절의 메커니즘을 연구하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜에서는 리보솜 프로파일링 데이터를 활용하기 위한 계산 절차와 게놈 전체 규모 및 단일 뉴클레오티드 분해능에서 mRNA 번역을 디코딩하는 커맨드 라인 도구인 RiboCode를 설명합니다. 이 방법은 주석이 달린 단백질 코딩 유전자의 외부 게놈 영역으로부터 발생하는 신규한 펩티드를 검색할 수 있게 하고, mRNA 번역의 속도를 정량화할 기회를 제공한다.시작하려면 Linux 터미널 창을 열고 명령을 실행하여 conda 환경을 만듭니다. 생성된 환경으로 전환하고 명령을 실행하여 RiboCode 및 종속성을 설치합니다. 참조 시퀀스에 대한 게놈 참조 파일을 가져오려면 Ensembl 웹 사이트로 이동한 다음 다운로드를 클릭한 다음 FTP 다운로드를 클릭합니다.DNA FASTA 열에서 FASTA 옵션을 클릭하고 웹 사이트 페이지의 표에 표시된 종은 인간인 행을 선택합니다. Ensembl 웹 사이트 페이지에서 텍스트에 언급 된대로 링크를 복사 한 다음 명령을 실행하여 터미널의 파일을 다운로드하고 압축을 풉니 다. 참조 주석을 보려면 마지막으로 열린 웹 페이지의 열 유전자 세트에서 GTF를 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.링크를 복사하고 명령을 사용하여 다운로드합니다. rRNA 서열을 가져오려면 UCSC 게놈 브라우저를 연 다음 도구를 클릭하고 드롭다운 목록에서 테이블 브라우저를 선택합니다. UCSC 게놈 브라우저 페이지에서 클래드에 대한 포유류, 게놈에 대한 인간, 그룹에 대한 모든 테이블, 테이블에 대한 R 마스크 및 영역에 대한 게놈을 지정합니다.필터의 경우 만들기를 클릭하여 새 페이지로 이동하고 rRNA와 일치하는 rep 클래스를 설정합니다. 제출을 클릭한 다음 출력 형식을 시퀀스로 설정하고 출력 파일 이름을 HG38_rRNA로 설정합니다. 파. 마지막으로 출력 가져오기를 클릭한 다음 시퀀스 가져오기를 선택하여 rRNA 서열을 검색합니다.시퀀스 읽기 아카이브에서 리보솜 프로파일링 데이터 세트를 가져오려면 si-eIFe 처리 그룹의 복제 샘플을 다운로드하고 명령을 실행하여 이름을 바꿉니다. 그런 다음 제어 그룹의 복제 샘플을 다운로드하고 명령을 실행하여 이름을 바꿉니다. rRNA 오염을 제거하려면 명령을 실행하여 rRNA 참조 서열의 인덱싱을 시작하십시오.인덱싱 후 읽기를 rRNA 참조에 정렬하여 명령을 실행하여 rRNA에서 발생하는 읽기를 배제합니다. 먼저 명령을 실행하여 게놈 인덱스를 만듭니다. 그런 다음 rRNA 오염이 없는 클린 읽기를 명령을 실행하여 생성된 참조에 정렬한 다음 명령을 실행하여 정렬 파일을 정렬하고 인덱싱합니다.명령을 실행하여 전사 주석을 준비합니다. 특정 길이의 리보솜으로 보호된 조각을 선택하고 명령을 실행하여 P-사이트 위치를 식별합니다. 각 샘플의 구성 파일을 편집하고 병합합니다.그런 다음 명령을 실행하여 RiboCode를 실행하십시오. 판독의 길이의 주파수 분포는 대부분의 리보솜 보호 단편이 25 내지 35 뉴클레오티드에 상응한다는 것을 보여주었다. 리보솜 보호 단편의 상이한 길이에 대한 P-부위 위치는 그들의 다섯 개의 프라임 말단으로부터 주석이 달린 시작 및 정지 코돈까지의 거리를 조사함으로써 결정되었다.매핑 결과는 10, 394 개의 유전자가 주석이 달린 열린 판독 프레임을 인코딩한다는 것을 보여줍니다. 또한, 509 및 168 유전자는 업스트림 및 다운스트림 오픈 리딩 프레임을 인코딩하는 반면, 939 유전자는 상류 또는 하류 오픈 리딩 프레임을 인코딩하며, 알려진 주석이 달린 오픈 리딩 프레임과 겹쳐진다. 또한, 68개의 단백질 코딩 유전자 및 2,601개의 비-코딩 유전자는 신규한 오픈 리딩 프레임을 인코딩한다.길이 분포는 업스트림, 다운스트림, 소설 및 겹쳐진 열린 판독 프레임이 주석이 달린 열린 판독 프레임보다 짧다는 것을 보여주었습니다. 상대적 리보솜 보호 단편 카운트는 각각의 개방 판독 프레임에 대해 계산되었고, 상류 개방 판독 프레임의 리보솜 밀도가 대조군 세포에서보다 eIF3e 결핍 세포에서 유의하게 더 높았다는 것을 밝혀냈다. 메타유전자 분석은 시작 코돈의 하류에 있는 코돈 25와 75 사이에서 리보솜 덩어리가 멈추는 것을 밝혀냈으며, 이는 번역 신장이 eIF3e 결핍 세포에서 초기에 차단될 수 있음을 시사한다.PSMA6의 업스트림 오픈 리딩 프레임에 대한 P 사이트 밀도 프로파일 및 유전자 SENP3-EIF4A1의 다운스트림 오픈 리딩 프레임을 조사하여, 리보솜 보호 단편의 주기성 패턴 및 밀도를 입증하였다. 공지된 단백질 코딩 영역의 시작 및 정지 코돈 주위의 판독의 위치를 확인하는 것은 각 길이에 대한 판독의 주기적 특성을 평가하기 위해 필요하다. RiboCode는 다른 커맨드 라인 도구와 함께 품질 관리 및 예측 된 오픈 판독 프레임에서 리보솜의 점유를 정량화하고 시각화하는 것과 같은 여러 분석을 수행 할 수 있습니다.이 계산 도구는 특정 생리적 컨텍스트에서 리보솜 프로파일링 데이터로 비정규 번역 이벤트를 식별하고 자극에 대한 응답으로 번역이 어떻게 조절되는지를 식별하는 높은 처리량 방법을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

단백질 지혜 : 용 워크 벤치<em&gt; 실리코에</em&gt;<em&gt; 드 노보</em생체 분자의&gt; 디자인

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

연구

생물학

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

공장 Polysom​​e 프로파일 링을위한 쉬운 방법

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper 슈퍼 해상도 현미경을위한 오픈 소스 단일 입자 분석

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

드 노 보 그렇 구나/TAZ에 의해 체세포 줄기 세포의 생성

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: 말라리아 벡터 아노펠레스 감비아를 위해 설계된 빅 데이터 전사학을 위한 오픈 소스 데이터 통합 도구

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

벌레 정렬 및 Worm_CP, Caenorhabditis elegans에서 얻은 형광 이미지 데이터의 스트레이트 및 정량화를 위한 두 개의 오픈 소스 파이프라인

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans에서 드 노보 단백질 합성 비율의 평가

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...