Name: de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data
Uploaded: 2022-02-18T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne anerkjenne støtten fra beregningsressursene fra HPCC-plattformen til Xi'an Jiaotong University. Z.X. takker takknemlig Young Topnotch Talent Support Plan for Xi'an Jiaotong University.

1. Miljøoppsett og RiboCode-installasjon
<ol><li>Åpne et Linux-terminalvindu og opprett et conda-miljø: conda opprette -n RiboCode python=3,8
</li>
	<li>Bytt til det opprettede miljøet og installer RiboCode og avhengigheter: conda aktivere RiboCode conda installere -c bioconda ribocode ribominer sra-verktøy fastx_toolkit cutadapt bowtie stjerne samtools
</li>
</ol>2. Klargjøring av data
<ol><li>Hent genomreferansefiler.<ol>
<li...

<ol>
	<li>Eisenberg, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+Initiation+Site+Profiling+Reveals+Widespread+Synthesis+of+Non-AUG-Initiated+Protein+Isoforms+in+Yeast.">Translation Initiation Site Profiling Reveals Widespread Synthesis of Non-AUG-Initiated Protein Isoforms in Yeast.</a> Cell Systems. 11 (2), 145-160 (2020).</li><li>Spealman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+non-AUG+uORFs+revealed+by+a+novel+regression+analysis+of+ribosome+profiling+data.">Conserved non-AUG uORFs revealed by a novel regression analysis of ribosome profiling data.</a> Genome Research. 28 (2), 214-222 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147 (4), 789-802 (2011).</li><li>Bazzini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+ORFs+in+vertebrates+using+ribosome+footprinting+and+evolutionary+conservation.">Identification of small ORFs in vertebrates using ribosome footprinting and evolutionary conservation.</a> The EMBO Journal. 33 (9), 981-993 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell Reports. 8 (5), 1365-1379 (2014).</li><li>Chew, G. L., Pauli, A., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+uORF+repressiveness+and+sequence+features+in+mouse,+human+and+zebrafish.">Conservation of uORF repressiveness and sequence features in mouse, human and zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 11663 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genome-wide+distribution+and+evolution+of+uORFs+in+eukaryotes.">Determinants of genome-wide distribution and evolution of uORFs in eukaryotes.</a> Nature Communications. 12 (1), 1076 (2021).</li><li>Guenther, U. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+helicase+Ded1p+controls+use+of+near-cognate+translation+initiation+codons+in+5'+UTRs.">The helicase Ded1p controls use of near-cognate translation initiation codons in 5' UTRs.</a> Nature. 559 (7712), 130-134 (2018).</li><li>Goldsmith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+a+functional+role+for+autophagy+in+mRNA+translational+control.">Ribosome profiling reveals a functional role for autophagy in mRNA translational control.</a> Communications Biology. 3 (1), 388 (2020).</li><li>Magny, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+regulation+of+cardiac+calcium+uptake+by+peptides+encoded+in+small+open+reading+frames.">Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames.</a> Science. 341 (6150), 1116-1120 (2013).</li><li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Molecular Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress.">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li><li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes.">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biology. 16, 90 (2015).</li><li>Chng, S. C., Ho, L., Tian, J., Reversade, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELABELA:+a+hormone+essential+for+heart+development+signals+via+the+apelin+receptor.">ELABELA: a hormone essential for heart development signals via the apelin receptor.</a> Developmental Cell. 27 (6), 672-680 (2013).</li><li>Pauli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toddler:+an+embryonic+signal+that+promotes+cell+movement+via+Apelin+receptors.">Toddler: an embryonic signal that promotes cell movement via Apelin receptors.</a> Science. 343 (6172), 1248636 (2014).</li><li>Stark, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+functional+elements+in+12+Drosophila+genomes+using+evolutionary+signatures.">Discovery of functional elements in 12 Drosophila genomes using evolutionary signatures.</a> Nature. 450 (7167), 219-232 (2007).</li><li>Lin, M. F., Jungreis, I., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhyloCSF:+a+comparative+genomics+method+to+distinguish+protein+coding+and+non-coding+regions.">PhyloCSF: a comparative genomics method to distinguish protein coding and non-coding regions.</a> Bioinformatics. 27 (13), 275-282 (2011).</li><li>Slavoff, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+discovery+of+short+open+reading+frame-encoded+peptides+in+human+cells.">Peptidomic discovery of short open reading frame-encoded peptides in human cells.</a> Nature Chemical Biology. 9 (1), 59-64 (2013).</li><li>Schwaid, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+discovery+of+cysteine-containing+human+short+open+reading+frames.">Chemoproteomic discovery of cysteine-containing human short open reading frames.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (45), 16750-16753 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation+and+quantitation+of+translation+by+ribosome+profiling.">Genome-wide annotation and quantitation of translation by ribosome profiling.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 1-19 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Xiao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+annotation+and+characterization+of+the+translatome+with+ribosome+profiling+data.">De novo annotation and characterization of the translatome with ribosome profiling data.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 61 (2018).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF3+Associates+with+80S+Ribosomes+to+Promote+Translation+Elongation,+Mitochondrial+Homeostasis,+and+Muscle+Health.">eIF3 Associates with 80S Ribosomes to Promote Translation Elongation, Mitochondrial Homeostasis, and Muscle Health.</a> Molecular Cell. 79 (4), 575-587 (2020).</li><li>. AGAT: Another Gff Analysis Toolkit to handle annotations in any GTF/GFF format Available from: <a target="_blank" href="https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html">https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html</a> (2020)</li><li>. Gene Expression Omnibus Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo">https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo</a> (2002)</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>. STAR manual Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf">https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf</a> (2022)</li><li>. The genetic codes Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi</a> (2019)</li><li>. RiboMiner Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboMiner">https://github.com/xryanglab/RiboMiner</a> (2020)</li><li>Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+global+views+of+translation.">Ribosome profiling: global views of translation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), 032698 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+translation+initiation+sites+in+mammalian+cells+at+single-nucleotide+resolution.">Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+initiating+ribosomes+in+vivo.">Quantitative profiling of initiating ribosomes in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 147-153 (2015).</li><li>Spealman, P., Naik, A., McManus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uORF-seqr:+A+Machine+Learning-Based+approach+to+the+identification+of+upstream+open+reading+frames+in+yeast.">uORF-seqr: A Machine Learning-Based approach to the identification of upstream open reading frames in yeast.</a> Methods in Molecular Biol. 2252, 313-329 (2021).</li><li>. RiboCode Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboCode">https://github.com/xryanglab/RiboCode</a> (2018)</li><li>Sharma, P., Wu, J., Nilges, B. S., Leidel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+and+other+commonly+used+model+organisms+are+resistant+to+cycloheximide-mediated+biases+in+ribosome+profiling+experiments.">Humans and other commonly used model organisms are resistant to cycloheximide-mediated biases in ribosome profiling experiments.</a> Nature Communications. 12 (1), 5094 (2021).</li></ol>

Ribosomprofilering gir en enestående mulighet til å studere ribosomenes handling i celler i genomskala. Nøyaktig dechiffrering av informasjonen som bæres av ribosomets profileringsdata, kan gi innsikt i hvilke regioner av gener eller transkripsjoner som aktivt oversettes. Denne trinnvise protokollen gir veiledning om hvordan du bruker RiboCode til å analysere ribosomeprofileringsdata i detalj, inkludert pakkeinstallasjon, dataforberedelse, kommandoutførelse, resultatforklaring og datavisualisering. Analyseresultate...

Nylig har en voksende studiemasse avdekket utbredt produksjon av peptider oversatt fra ORF-er av kodingsgener og de tidligere kommenterte genene som nonkoding, for eksempel lange ikke-koding av RNAer (lncRNAer) 1,2,3,4,5,6,7,8. Disse oversatte ORF-ene er regulert eller indusert av celler for å reagere på miljøendringer, stress og celledifferensiering1,8,9,10,11,12,13. Oversettelsesproduktene til noen ORF-er har vist seg å spille viktige regulatoriske roller i ulike biologiske prosesser i utvikling og fysiologi. For eksempel oppdaget Chng et al.14 et peptidhormon kalt Elabela (Ela, også kjent som Apela / Ende / Toddler), som er kritisk for kardiovaskulær utvikling. Pauli et al. foreslo at Ela også fungerer som et mitogen som fremmer cellemigrasjon i det tidlige fiskeembryo15. Magny et al. rapporterte to mikropeptider på mindre enn 30 aminosyrer som regulerer kalsiumtransport og påvirker vanlig muskelkontraksjon i Drosophila-hjertet10.
Det er fortsatt uklart hvor mange slike peptider som er kodet av genomet og om de er biologisk relevante. Derfor er systematisk identifisering av disse potensielt kodende ORF-ene svært ønskelig. Det er imidlertid utfordrende å bestemme produktene til disse ORF-ene (dvs. protein eller peptid) direkte ved hjelp av tradisjonelle tilnærminger som evolusjonær bevaring16,17 og massespektrometri18,19 fordi deteksjonseffektiviteten til begge tilnærmingene er avhengig av lengden, overfloden og aminosyresammensetningen til de produserte proteinene eller peptidene. Fremkomsten av ribosomprofilering, en teknikk for å identifisere ribosomets belegg på mRNAer ved nukleotidoppløsning, har gitt en presis måte å evaluere kodingspotensialet til forskjellige transkripsjoner3,20,21, uavhengig av lengde og sammensetning. En viktig og ofte brukt funksjon for å identifisere aktivt oversette ORFer ved hjelp av ribosomprofilering er tre-nukleotid (3-nt) periodicitet av ribosomets fotavtrykk på mRNA fra start codon til stop codon. Ribosomprofileringsdata har imidlertid ofte flere problemer, inkludert lav og sparsom sekvensering leser langs ORFer, høy sekvenseringsstøy og ribosomale RNA (rRNA) forurensninger. Dermed svekker de forvrengte og tvetydige signalene generert av slike data 3-nt periodicitetsmønstrene til ribosomers fotavtrykk på mRNA, noe som til slutt gjør identifiseringen av de høysikkerhets oversatte ORF-ene vanskelig.
En pakke kalt "RiboCode" tilpasset en modifisert Wilcoxon-signert-rank test og P-verdi integrasjonsstrategi for å undersøke om ORF har betydelig mer in-frame ribosombeskyttede fragmenter (RPFer) enn off-frame RPFer22. Det ble vist å være svært effektiv, følsom og nøyaktig for de novo merknad av translatom i simulerte og ekte ribosomet profileringsdata. Her beskriver vi hvordan du bruker dette verktøyet til å oppdage potensielle oversettelser av ORFer fra de rå ribosomet profileringssekvenseringsdatasett generert av forrige studie23. Disse datasettene hadde blitt brukt til å utforske funksjonen til EIF3 subenhet "E" (EIF3E) i oversettelse ved å sammenligne ribosomets beleggprofiler av MCF-10A-celler transfektert med kontroll (si-Ctrl) og EIF3E (si-eIF3e) små-forstyrrende RNAer (siRNAer). Ved å bruke RiboCode på disse eksempeldatasettene oppdaget vi 5633 nye ORFer som potensielt koder for små peptider eller proteiner. Disse ORF-ene ble kategorisert i forskjellige typer basert på deres plasseringer i forhold til koderegionene, inkludert oppstrøms ORF-er (uORFer), nedstrøms ORF-er (dORFer), overlappede ORF-er, ORFer fra nye proteinkodingsgener (nye PCG-er) og ORFer fra nye ikke-proteinkodingsgener (nye nonPCG-er). RPF-lesetetthetene på uORFer ble betydelig økt i EIF3E-mangelfulle celler sammenlignet med kontrollceller, noe som i det minste delvis kan skyldes berikelse av aktivt oversettelse av ribosomer. Den lokaliserte ribosoleakkumuleringen i regionen fra 25th til 75th codon av EIF3E-mangelfulle celler indikerte en blokkering av oversettelsesforlengelse i tidlig stadium. Denne protokollen viser også hvordan du visualiserer RPF-tettheten i ønsket region for å undersøke 3-nt periodicity mønstre av ribosome fotavtrykk på identifiserte ORFer. Disse analysene viser RiboCodes mektige rolle i å identifisere oversettelse av ORFer og studere regulering av oversettelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A computer/server running Linux</td>
			<td>Any</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaconda or Miniconda</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>-</td>
			<td>Anaconda: https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data

Identifisering av åpne leserammer (ORFer), spesielt de som koder små peptider og blir aktivt oversatt under spesifikke fysiologiske sammenhenger, er avgjørende for omfattende merknader av kontekstavhengige translaktomer. Ribosomprofilering, en teknikk for å oppdage bindingsstedene og tetthetene ved å oversette ribosomer på RNA, tilbyr en mulighet til raskt å oppdage hvor oversettelsen skjer i genomomskalaen. Det er imidlertid ikke en triviell oppgave i bioinformatikk å effektivt og omfattende identifisere oversettelsen av ORFer for ribosomprofilering. Beskrevet her er en brukervennlig pakke, kalt RiboCode, designet for å søke etter aktivt oversette ORFer av hvilken som helst størrelse fra forvrengte og tvetydige signaler i ribosomeprofileringsdata. Denne artikkelen tar vårt tidligere publiserte datasett som et eksempel, og inneholder trinnvise instruksjoner for hele RiboCode-datasamlebåndet, fra forhåndsbehandling av rådataene til tolkning av de endelige utdataresultatfilene. Videre, for å evaluere oversettelsesratene til de kommenterte ORF-ene, er prosedyrer for visualisering og kvantifisering av ribosoletettheter på hver ORF også beskrevet i detalj. Oppsummert er den nåværende artikkelen en nyttig og rettidig instruksjon for forskningsfeltene knyttet til oversettelse, små ORFer og peptider.

Eksempelet på ribosomet profileringsdatasett ble deponert i GEO-databasen under tiltredelsesnummeret GSE131074. Alle filene og kodene som brukes i denne protokollen er tilgjengelige fra tilleggsfiler 1-4. Ved å bruke RiboCode på et sett med publiserte ribosomeprofileringsdatasett23 identifiserte vi de nye ORF-ene som er aktivt oversatt i MCF-10A-celler behandlet med kontroll og EIF3E siRNAer. For å velge RPF-avlesningene som mest sann...

Watch this Scientific Journal Video about De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data at JoVE.com

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

Oversettelse av ribosomer dekoder tre nukleotider per codon til peptider. Deres bevegelse langs mRNA, fanget av ribosomprofilering, produserer fotavtrykkene som viser karakteristisk trilling periodicitet. Denne protokollen beskriver hvordan du bruker RiboCode til å dechiffrere denne fremtredende funksjonen fra ribosomeprofileringsdata for å identifisere aktivt oversatte åpne leserammer på hele transkripsjonsnivå.

De novo Identifisering av aktivt oversatte åpne leserammer med ribosomeprofileringsdata

Identification of open reading frames (ORFs), especially those encoding small peptides and being actively translated under specific physiological ...

Tolkning av sekvenseringsdataene generert av ribosomets profileringseksperiment er avgjørende for kvantitativ måling av translasjonsaktivitetene til ribosomer på mRNA, og for å studere mekanismene for translasjonsregulering. I denne protokollen vil vi beskrive beregningsprosedyren for bruk av ribosomets profileringsdata og RiboCode, et kommandolinjeverktøy for å dekode mRNA-oversettelse i genomomskala og enkelt nukleotidoppløsning. Denne metoden gjør det mulig å søke etter de nye peptidene som oppstår fra de genomiske områdene utenfor de kommenterte proteinkodingsgenene, og gir en mulighet til å kvantifisere frekvensen av mRNA-oversettelse.For å begynne, åpne et Linux-terminalvindu, og opprett et conda-miljø ved å utføre kommandoen. Bytt til det opprettede miljøet, og installer RiboCode og avhengigheter ved å utføre kommandoen. Hvis du vil hente genomreferansefilene for referansesekvensen, går du til ensembl-nettstedet og klikker på last ned etterfulgt av FTP-nedlasting.Klikk på FASTA-alternativet i kolonnen DNA FASTA, og velg raden der arten er menneskelig, vist i tabellen på nettsiden. På Ensembls nettside kopierer du lenken som nevnt i teksten, og deretter laster du ned og pakker ut filene i terminalen ved å utføre kommandoen. For referansemerknad, høyreklikk GTF i kolonnegensettene på den siste åpne nettsiden.Kopier koblingen, og last den ned ved hjelp av kommandoen. Hvis du vil ha rRNA-sekvenser, åpner du UCSC-genomleseren, klikker verktøy og velger tabellleser i rullegardinlisten. På UCSC-genomlesersiden angir du pattedyr for clade, humant for genom, alle tabeller for gruppe, R-maske for bord og genom for region.For filter klikker du opprett for å gå til en ny side, og angi rep-klasse som samsvarer med rRNA. Klikk Send, og sett deretter utdataformatet til sekvens, og utdatafilnavnet som HG38_rRNA. FA. Til slutt klikker du hent utdata, og deretter velger du hent sekvens for å hente rRNA-sekvensen.Hvis du vil hente ribosomeprofileringsdatasett fra sekvenslesearkivet, laster du ned replikeringseksemplene for si-eIFe-behandlingsgruppen og gir dem nytt navn ved å utføre kommandoen. Last deretter ned replikeringseksemplene for kontrollgruppen, og gi dem nytt navn ved å utføre kommandoen. Hvis du vil fjerne rRNA-kontaminering, starter du indeksering av rRNA-referansesekvenser ved å utføre kommandoen.Når du har indeksert, justerer du leseoperasjoner til rRNA-referanse for å utelukke at lesingene kommer fra rRNA ved å utføre kommandoen. Begynn med å opprette en genomindeks ved å utføre kommandoen. Juster deretter renlesningene uten rRNA-forurensning til den opprettede referansen ved å utføre kommandoen, og sorter og indekser deretter justeringsfiler ved å utføre kommandoen.Klargjør transkripsjonsmerknadene ved å utføre kommandoen. Velg ribosomebeskyttede fragmenter av bestemte lengder, og identifiser deres P-områdeposisjoner ved å utføre kommandoen. Rediger konfigurasjonsfilene for hvert eksempel, og slå dem sammen.Kjør deretter RiboCode ved å utføre kommandoen. Frekvensfordelingen av lengdene på lesningene viste at de fleste ribosolebeskyttede fragmenter tilsvarer 25 til 35 nukleotider. P-stedets plasseringer for forskjellige lengder av ribosomebeskyttede fragmenter ble bestemt ved å undersøke avstandene fra de fem hovedendene til de kommenterte start- og stoppkokonene.Kartleggingsresultatene viser at 10 394 gener koder for kommenterte åpne leserammer. Videre koder 509 og 168 gener for oppstrøms og nedstrøms åpne leserammer, mens 939 gener koder for enten oppstrøms eller nedstrøms åpne leserammer, overlappet med kjente kommenterte åpne leserammer. Videre koder 68 proteinkodingsgener og 2601 ikke-kodegener for nye åpne leserammer.Lengdefordelingen viste at oppstrøms, nedstrøms, roman og overlappende åpne leserammer var kortere enn de kommenterte åpne leserammene. Relative ribosomet beskyttede fragmenttall ble beregnet for hver åpne leseramme, og avslørte at ribosoletettheten til oppstrøms åpne leserammer var betydelig høyere i eIF3e mangelfulle celler enn i kontrollceller. Metageneanalysen viste at en masse ribosomer stoppet mellom torsk 25 og 75 nedstrøms startkodon, noe som tyder på at oversettelsesforlengelsen kan bli blokkert tidlig i eIF3e mangelfulle celler.P-sites tetthetsprofiler for oppstrøms åpne leserammer av PSMA6 og nedstrøms åpne leserammer av gen SENP3-EIF4A1 ble undersøkt, og demonstrerte periodicitetsmønstre og tettheter av ribosole beskyttede fragmenter. Å sjekke plasseringen av lesninger rundt starten og stoppe codons av kjente proteinkodingsregioner er nødvendig for å evaluere de periodiske egenskapene til lesninger for hver lengde. RiboCode, sammen med et annet kommandolinjeverktøy, kan RiboMiner også utføre kvalitetskontroll og flere analyser som kvantifisering og visualisering av ribosomenes belegg på de anslåtte åpne leserammene.Dette beregningsverktøyet gir en høy gjennomstrømningsmåte for å identifisere ukanoniske oversettelseshendelser med ribosomprofileringsdata i spesifikke fysiologiske sammenhenger, og hvordan oversettelsen modulerer som svar på stimulansen.

Research

JoVE Journal

Biology

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein visdom; Workbench for<em&gt; I silikon</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Design av biomolekyler

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Analyse av Oversettelse Innvielse Under stressbetingelser ved Polysome Profilering

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Arbeidsflyt for High-innhold, Individuell Cell Kvantifisering av Fluorescent Markers fra Universal Microscope data, som støttes av Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunutfelling analyse for identifikasjon av Arabidopsis Protein-DNA interaksjoner<em&gt; I Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

En enkel metode for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-partikkel Analyse for Super-oppløsning Mikroskopi med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generasjon av somatiske stamceller ved YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: en åpen kilde data integrasjon verktøyet for stor data Transcriptomics designet for malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Orm-juster og Worm_CP, to åpen kildekode rørledninger for retting og kvantifisering av fluorescens bildedata hentet fra Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Vurdering av de novo proteinsyntese priser i caenorhabditt elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...