Name: de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data
Uploaded: 2022-02-18T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны вычислительных ресурсов, предоставляемых платформой HPCC Сианьского университета Цзяотун. Z.X. благодарит План поддержки талантов Young Topnotch Сианьского университета Цзяотун.

1. Настройка среды и установка RiboCode
<ol><li>Откройте окно терминала Linux и создайте среду conda: conda create -n RiboCode python=3.8
</li>
	<li>Переключитесь на созданную среду и установите RiboCode и зависимости: conda активировать RiboCode conda install -c биоконда рибокод рибоминер sra-tools fastx_toolkit cutadapt bowtie star sa...

<ol>
	<li>Eisenberg, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+Initiation+Site+Profiling+Reveals+Widespread+Synthesis+of+Non-AUG-Initiated+Protein+Isoforms+in+Yeast.">Translation Initiation Site Profiling Reveals Widespread Synthesis of Non-AUG-Initiated Protein Isoforms in Yeast.</a> Cell Systems. 11 (2), 145-160 (2020).</li><li>Spealman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+non-AUG+uORFs+revealed+by+a+novel+regression+analysis+of+ribosome+profiling+data.">Conserved non-AUG uORFs revealed by a novel regression analysis of ribosome profiling data.</a> Genome Research. 28 (2), 214-222 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147 (4), 789-802 (2011).</li><li>Bazzini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+ORFs+in+vertebrates+using+ribosome+footprinting+and+evolutionary+conservation.">Identification of small ORFs in vertebrates using ribosome footprinting and evolutionary conservation.</a> The EMBO Journal. 33 (9), 981-993 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell Reports. 8 (5), 1365-1379 (2014).</li><li>Chew, G. L., Pauli, A., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+uORF+repressiveness+and+sequence+features+in+mouse,+human+and+zebrafish.">Conservation of uORF repressiveness and sequence features in mouse, human and zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 11663 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genome-wide+distribution+and+evolution+of+uORFs+in+eukaryotes.">Determinants of genome-wide distribution and evolution of uORFs in eukaryotes.</a> Nature Communications. 12 (1), 1076 (2021).</li><li>Guenther, U. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+helicase+Ded1p+controls+use+of+near-cognate+translation+initiation+codons+in+5'+UTRs.">The helicase Ded1p controls use of near-cognate translation initiation codons in 5' UTRs.</a> Nature. 559 (7712), 130-134 (2018).</li><li>Goldsmith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+a+functional+role+for+autophagy+in+mRNA+translational+control.">Ribosome profiling reveals a functional role for autophagy in mRNA translational control.</a> Communications Biology. 3 (1), 388 (2020).</li><li>Magny, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+regulation+of+cardiac+calcium+uptake+by+peptides+encoded+in+small+open+reading+frames.">Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames.</a> Science. 341 (6150), 1116-1120 (2013).</li><li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Molecular Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress.">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li><li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes.">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biology. 16, 90 (2015).</li><li>Chng, S. C., Ho, L., Tian, J., Reversade, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELABELA:+a+hormone+essential+for+heart+development+signals+via+the+apelin+receptor.">ELABELA: a hormone essential for heart development signals via the apelin receptor.</a> Developmental Cell. 27 (6), 672-680 (2013).</li><li>Pauli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toddler:+an+embryonic+signal+that+promotes+cell+movement+via+Apelin+receptors.">Toddler: an embryonic signal that promotes cell movement via Apelin receptors.</a> Science. 343 (6172), 1248636 (2014).</li><li>Stark, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+functional+elements+in+12+Drosophila+genomes+using+evolutionary+signatures.">Discovery of functional elements in 12 Drosophila genomes using evolutionary signatures.</a> Nature. 450 (7167), 219-232 (2007).</li><li>Lin, M. F., Jungreis, I., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhyloCSF:+a+comparative+genomics+method+to+distinguish+protein+coding+and+non-coding+regions.">PhyloCSF: a comparative genomics method to distinguish protein coding and non-coding regions.</a> Bioinformatics. 27 (13), 275-282 (2011).</li><li>Slavoff, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+discovery+of+short+open+reading+frame-encoded+peptides+in+human+cells.">Peptidomic discovery of short open reading frame-encoded peptides in human cells.</a> Nature Chemical Biology. 9 (1), 59-64 (2013).</li><li>Schwaid, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+discovery+of+cysteine-containing+human+short+open+reading+frames.">Chemoproteomic discovery of cysteine-containing human short open reading frames.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (45), 16750-16753 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation+and+quantitation+of+translation+by+ribosome+profiling.">Genome-wide annotation and quantitation of translation by ribosome profiling.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 1-19 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Xiao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+annotation+and+characterization+of+the+translatome+with+ribosome+profiling+data.">De novo annotation and characterization of the translatome with ribosome profiling data.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 61 (2018).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF3+Associates+with+80S+Ribosomes+to+Promote+Translation+Elongation,+Mitochondrial+Homeostasis,+and+Muscle+Health.">eIF3 Associates with 80S Ribosomes to Promote Translation Elongation, Mitochondrial Homeostasis, and Muscle Health.</a> Molecular Cell. 79 (4), 575-587 (2020).</li><li>. AGAT: Another Gff Analysis Toolkit to handle annotations in any GTF/GFF format Available from: <a target="_blank" href="https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html">https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html</a> (2020)</li><li>. Gene Expression Omnibus Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo">https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo</a> (2002)</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>. STAR manual Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf">https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf</a> (2022)</li><li>. The genetic codes Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi</a> (2019)</li><li>. RiboMiner Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboMiner">https://github.com/xryanglab/RiboMiner</a> (2020)</li><li>Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+global+views+of+translation.">Ribosome profiling: global views of translation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), 032698 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+translation+initiation+sites+in+mammalian+cells+at+single-nucleotide+resolution.">Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+initiating+ribosomes+in+vivo.">Quantitative profiling of initiating ribosomes in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 147-153 (2015).</li><li>Spealman, P., Naik, A., McManus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uORF-seqr:+A+Machine+Learning-Based+approach+to+the+identification+of+upstream+open+reading+frames+in+yeast.">uORF-seqr: A Machine Learning-Based approach to the identification of upstream open reading frames in yeast.</a> Methods in Molecular Biol. 2252, 313-329 (2021).</li><li>. RiboCode Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboCode">https://github.com/xryanglab/RiboCode</a> (2018)</li><li>Sharma, P., Wu, J., Nilges, B. S., Leidel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+and+other+commonly+used+model+organisms+are+resistant+to+cycloheximide-mediated+biases+in+ribosome+profiling+experiments.">Humans and other commonly used model organisms are resistant to cycloheximide-mediated biases in ribosome profiling experiments.</a> Nature Communications. 12 (1), 5094 (2021).</li></ol>

Профилирование рибосом дает беспрецедентную возможность изучить действие рибосом в клетках в масштабе генома. Точная расшифровка информации, переносимой данными профилирования рибосом, может дать представление о том, какие области генов или транскриптов активно транслируются. Этот ...

В последнее время растущее количество исследований выявило широко распространенную продукцию пептидов, переведенных из ORF кодирующих генов и ранее аннотированных генов как некодирующих, таких как длинные некодирующие РНК (lncRNAs)1,2,3,4,5,6,7,8. Эти переведенные ORF регулируются или индуцируются клетками для реагирования на изменения окружающей среды, стресс и дифференцировку клеток1,8,9,10,11,12,13. Было продемонстрировано, что продукты трансляции некоторых ORF играют важную регулирующую роль в различных биологических процессах развития и физиологии. Например, Chng et al.14 обнаружили пептидный гормон под названием Elabela (Ela, также известный как Apela/Ende/Toddler), который имеет решающее значение для развития сердечно-сосудистой системы. Паули и др. предположили, что Эла также действует как митоген, который способствует миграции клеток в раннем эмбрионе рыбы15. Magny et al. сообщили о двух микропептидах менее 30 аминокислот, регулирующих транспорт кальция и влияющих на регулярное сокращение мышц в сердце Drosophila10.
Остается неясным, сколько таких пептидов кодируется геномом и являются ли они биологически значимыми. Поэтому систематическая идентификация этих потенциально кодирующих ORF очень желательна. Однако непосредственное определение продуктов этих ORF (т.е. белка или пептида) с использованием традиционных подходов, таких как эволюционное сохранение16,17 и масс-спектрометрия18,19, является сложной задачей, поскольку эффективность обнаружения обоих подходов зависит от длины, обилия и аминокислотного состава продуцируемых белков или пептидов. Появление рибосомного профилирования, метода идентификации занятости рибосом на мРНК при нуклеотидном разрешении, обеспечило точный способ оценки кодирующего потенциала различных транскриптов3,20,21, независимо от их длины и состава. Важной и часто используемой особенностью для идентификации активно транслируемых ОРФ с использованием рибосомного профилирования является трехнуклеотидная (3-nt) периодичность следов рибосомы на мРНК от начального кодона до стоп-кодона. Тем не менее, данные профилирования рибосом часто имеют несколько проблем, включая низкие и разреженные показания секвенирования вдоль ORF, высокий шум секвенирования и загрязнение рибосомальной РНК (рРНК). Таким образом, искаженные и неоднозначные сигналы, генерируемые такими данными, ослабляют паттерны периодичности 3-х нт следов рибосом на мРНК, что в конечном итоге затрудняет идентификацию высокодоверных транслируемых ORF.
Пакет под названием «RiboCode» адаптировал модифицированный тест Wilcoxon-signed-rank и стратегию интеграции P-value, чтобы проверить, имеет ли ORF значительно больше фрагментов, защищенных рибосомами (RPF), чем внекадровые RPF22. Было продемонстрировано, что он является высокоэффективным, чувствительным и точным для de novo аннотации транслейтома в смоделированных и реальных данных профилирования рибосом. Здесь мы описываем, как использовать этот инструмент для обнаружения потенциального перевода ORF из необработанных наборов данных секвенирования профилирования рибосом, сгенерированных предыдущим исследованием23. Эти наборы данных были использованы для изучения функции субъединицы EIF3 «E» (EIF3E) в трансляции путем сравнения профилей занятости рибосом клеток MCF-10A, трансфектированных контрольными (si-Ctrl) и EIF3E (si-eIF3e) малоинтерферирующими РНК (siRNAs). Применив RiboCode к этим примерам наборов данных, мы обнаружили 5 633 новых ORF, потенциально кодирующих небольшие пептиды или белки. Эти ORF были классифицированы на различные типы в зависимости от их местоположения относительно кодирующих областей, включая вышестоящие ORF (uORFs), нижестоящие ORF (dORFs), перекрывающиеся ORF, ORF из новых генов, кодирующих белки (новые PCG), и ORF из новых генов, не вызывающих рост (новые NonPCG). Плотность считывания RPF на uORF была значительно увеличена в клетках с дефицитом EIF3E по сравнению с контрольными клетками, что может быть, по крайней мере, частично вызвано обогащением активно транслицирующихся рибосом. Локализованное накопление рибосом в области от 25-го по 75-й кодон EIF3E-дефицитных клеток указывало на блокировку удлинения трансляции на ранней стадии. Этот протокол также показывает, как визуализировать плотность RPF в желаемой области для изучения паттернов периодичности 3-nt следов рибосом на идентифицированных ORF. Эти анализы демонстрируют мощную роль RiboCode в выявлении переводческих ORF и изучении регулирования перевода.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A computer/server running Linux</td>
			<td>Any</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaconda or Miniconda</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>-</td>
			<td>Anaconda: https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data

Идентификация открытых кадров чтения (ORF), особенно тех, которые кодируют небольшие пептиды и активно переводятся в конкретных физиологических контекстах, имеет решающее значение для комплексных аннотаций контекстно-зависимых транслейломов. Профилирование рибосом, метод обнаружения мест связывания и плотностей трансляции рибосом на РНК, предлагает способ быстро обнаружить, где происходит трансляция в масштабе всего генома. Тем не менее, в биоинформатике не является тривиальной задачей эффективно и всесторонне идентифицировать переводящие ORF для профилирования рибосом. Здесь описан простой в использовании пакет под названием RiboCode, предназначенный для поиска активного перевода ORF любого размера из искаженных и неоднозначных сигналов в данных профилирования рибосом. Взяв в качестве примера наш ранее опубликованный набор данных, в этой статье приведены пошаговые инструкции для всего конвейера RiboCode, от предварительной обработки необработанных данных до интерпретации конечных выходных файлов результатов. Кроме того, для оценки скорости трансляции аннотированных ORF также подробно описаны процедуры визуализации и количественной оценки плотностей рибосом на каждом ORF. Таким образом, настоящая статья является полезной и своевременной инструкцией для областей исследований, связанных с переводом, малыми ОРФ и пептидами.

Примеры наборов данных профилирования рибосом были депонированы в базе данных ГЭП под номером присоединения GSE131074. Все файлы и коды, используемые в этом протоколе, доступны из дополнительных файлов 1-4. Применяя RiboCode к набору опубликованных наборов данных про...

Watch this Scientific Journal Video about De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data at JoVE.com

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

Перевод рибосом декодирует три нуклеотида на кодон в пептиды. Их движение вдоль мРНК, захваченное профилированием рибосом, производит следы, проявляющие характерную триплетную периодичность. Этот протокол описывает, как использовать RiboCode для расшифровки этой важной функции из данных профилирования рибосом для идентификации активно транслируемых открытых кадров чтения на уровне всего транскриптома.

De novo Идентификация активно транслируемых открытых кадров чтения с данными профилирования рибосом

Identification of open reading frames (ORFs), especially those encoding small peptides and being actively translated under specific physiological ...

Интерпретация данных секвенирования, генерируемых экспериментом по профилированию рибосом, имеет решающее значение для количественного измерения поступательной активности рибосом на мРНК и для изучения механизмов трансляционной регуляции. В этом протоколе мы опишем вычислительную процедуру использования данных профилирования рибосом и RiboCode, инструмент командной строки для декодирования трансляции мРНК в масштабе всего генома и с разрешением одного нуклеотида. Этот метод позволяет искать новые пептиды, возникающие из геномных областей за пределами аннотированных генов, кодирующих белки, и дает возможность количественно оценить скорость трансляции мРНК.Для начала откройте окно терминала Linux и создайте среду conda, выполнив команду. Переключитесь на созданную среду и установите RiboCode и зависимости, выполнив команду. Чтобы получить справочные файлы генома для эталонной последовательности, перейдите на веб-сайт Ensembl, затем нажмите «Загрузить», а затем «Загрузка по FTP».Нажмите на опцию FASTA в столбце DNA FASTA, и выберите строку, где вид является человеком, показанную в таблице на странице сайта. На странице веб-сайта Ensembl скопируйте ссылку, как указано в тексте, затем загрузите и распакуйте файлы в терминале, выполнив команду. Чтобы получить справочную аннотацию, щелкните правой кнопкой мыши GTF в наборах генов столбцов на последней открытой веб-странице.Скопируйте ссылку и загрузите ее с помощью команды. Чтобы получить последовательности рРНК, откройте браузер генома UCSC, затем щелкните Инструменты и выберите браузер таблиц в раскрывающемся списке. На странице браузера генома UCSC укажите mammal для клады, человека для генома, все таблицы для группы, R-маску для таблицы и геном для региона.Для фильтра нажмите кнопку создать, чтобы перейти на новую страницу, и задайте класс rep, соответствующий рРНК. Нажмите кнопку Отправить, а затем задайте для выходного формата последовательность, а для имени выходного файла — HG38_rRNA. ФА. Наконец, нажмите кнопку Получить вывод, а затем выберите получить последовательность, чтобы получить последовательность рРНК.Чтобы получить наборы данных профилирования рибосом из архива чтения последовательностей, загрузите реплицированные образцы группы обработки si-eIFe и переименуйте их, выполнив команду. Затем загрузите реплицированные образцы контрольной группы и переименуйте их, выполнив команду. Чтобы удалить загрязнение рРНК, начните индексацию эталонных последовательностей рРНК, выполнив команду.После индексации выровняйте показания по ссылке на рРНК, чтобы исключить показания, исходящие от рРНК, выполнив команду. Начните с создания индекса генома, выполнив команду. Затем выровняйте чистые чтения без загрязнения рРНК по созданной ссылке, выполнив команду, а затем отсортируйте и индексируйте файлы выравнивания, выполнив команду.Подготовьте аннотации стенограммы, выполнив команду. Выберите защищенные рибосомы фрагменты определенной длины и определите их позиции P-site, выполнив команду. Отредактируйте файлы конфигурации для каждого примера и объедините их.Затем запустите RiboCode, выполнив команду. Частотное распределение длин считывания показало, что большинство защищенных рибосомных фрагментов соответствуют от 25 до 35 нуклеотидов. Местоположения P-участка для различных длин защищенных рибосом фрагментов были определены путем изучения расстояний от их пяти основных концов до аннотированных кодонов запуска и остановки.Результаты картирования показывают, что 10 394 гена кодируют аннотированные открытые кадры чтения. Кроме того, 509 и 168 генов кодируют открытые кадры чтения вверх и вниз по течению, в то время как 939 генов кодируют либо восходящие, либо нисходящие открытые кадры чтения, перекрывающиеся известными аннотированными открытыми кадрами чтения. Кроме того, 68 генов, кодирующих белки, и 2 601 некодирующий ген кодируют новые открытые кадры чтения.Распределение длин показало, что восходящие, нисходящие, новые и перекрывающиеся открытые кадры чтения были короче, чем аннотированные открытые кадры чтения. Относительное количество фрагментов, защищенных рибосомами, было рассчитано для каждого открытого кадра считывания, показав, что плотность рибосом восходящих открытых кадров считывания была значительно выше в клетках с дефицитом eIF3e, чем в контрольных клетках. Анализ метагенов показал, что масса рибосом застряла между кодонами 25 и 75 ниже по течению от стартового кодона, предполагая, что удлинение трансляции может быть заблокировано на ранней стадии клеток с дефицитом eIF3e.Были исследованы профили плотности P-сайтов для восходящих открытых кадров считывания PSMA6 и последующих открытых кадров считывания гена SENP3-EIF4A1, демонстрирующих закономерности периодичности и плотности фрагментов, защищенных рибосомами. Проверка расположения считываний вокруг начальных и стоп-кодонов известных областей кодирования белка необходима для оценки периодических свойств считываний для каждой длины. RiboCode, вместе с другим инструментом командной строки, RiboMiner также может выполнять контроль качества и множественные анализы, такие как количественная оценка и визуализация занятости рибосом на прогнозируемых открытых кадрах чтения.Этот вычислительный инструмент обеспечивает высокую пропускную способность для идентификации неканонических событий трансляции с данными профилирования рибосом в конкретных физиологических контекстах и того, как трансляция модулируется в ответ на стимул.

Research

JoVE Journal

Biology

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Белки МУДРОСТЬ Workbench для<em&gt; В кремнии</em&gt;<em&gt; De Novo</em&gt; Дизайн биомолекул

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Анализ инициации трансляции во время стресса кондиций полисом профилирования

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Workflow для высокого содержания, отдельная клетка количественной флуоресцентных маркеров из Всеобщей микроскоп данных, поддерживаемые ПО с открытым кодом

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Хроматина иммунопреципитации для идентификации Arabidopsis взаимодействий белок-ДНК<em&gt; В Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Легкий способ для растений полисом профилирование

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

С открытым исходным кодом Анализ Одночастичного для супер-разрешение микроскопии с VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Поколение соматических стволовых клеток, YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: Инструмент интеграции данных с открытым исходным кодом для транскриптомики больших данных, предназначенный для гамбии переносчика малярии Anopheles

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Червь выравнивания и Worm_CP, два трубопровода с открытым исходным кодом для выпрямления и количественной оценки флуоресценции изображения данных, полученных от Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Оценка показателей синтеза белка de novo в Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...