Name: de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data
Uploaded: 2022-02-18T13:45:00
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Los autores desean agradecer el apoyo de los recursos computacionales proporcionados por la plataforma HPCC de la Universidad Xi'an Jiaotong. Z.X. agradece al Plan de Apoyo al Talento Joven de Primera Categoría de la Universidad Xi'an Jiaotong.

1. Configuración del entorno e instalación de RiboCode
<ol><li>Abra una ventana de terminal Linux y cree un entorno conda: conda create -n RiboCode python=3.8
</li>
	<li>Cambie al entorno creado e instale RiboCode y dependencias: conda activar RiboCode conda install -c bioconda ribocode ribominer sra-tools fastx_toolkit cutadapt bowtie star samtools
</li>
</ol>2. Preparación de datos
<ol><li>Obtener archivos de referencia del geno...

<ol>
	<li>Eisenberg, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+Initiation+Site+Profiling+Reveals+Widespread+Synthesis+of+Non-AUG-Initiated+Protein+Isoforms+in+Yeast.">Translation Initiation Site Profiling Reveals Widespread Synthesis of Non-AUG-Initiated Protein Isoforms in Yeast.</a> Cell Systems. 11 (2), 145-160 (2020).</li><li>Spealman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+non-AUG+uORFs+revealed+by+a+novel+regression+analysis+of+ribosome+profiling+data.">Conserved non-AUG uORFs revealed by a novel regression analysis of ribosome profiling data.</a> Genome Research. 28 (2), 214-222 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147 (4), 789-802 (2011).</li><li>Bazzini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+ORFs+in+vertebrates+using+ribosome+footprinting+and+evolutionary+conservation.">Identification of small ORFs in vertebrates using ribosome footprinting and evolutionary conservation.</a> The EMBO Journal. 33 (9), 981-993 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell Reports. 8 (5), 1365-1379 (2014).</li><li>Chew, G. L., Pauli, A., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+uORF+repressiveness+and+sequence+features+in+mouse,+human+and+zebrafish.">Conservation of uORF repressiveness and sequence features in mouse, human and zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 11663 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genome-wide+distribution+and+evolution+of+uORFs+in+eukaryotes.">Determinants of genome-wide distribution and evolution of uORFs in eukaryotes.</a> Nature Communications. 12 (1), 1076 (2021).</li><li>Guenther, U. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+helicase+Ded1p+controls+use+of+near-cognate+translation+initiation+codons+in+5'+UTRs.">The helicase Ded1p controls use of near-cognate translation initiation codons in 5' UTRs.</a> Nature. 559 (7712), 130-134 (2018).</li><li>Goldsmith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+a+functional+role+for+autophagy+in+mRNA+translational+control.">Ribosome profiling reveals a functional role for autophagy in mRNA translational control.</a> Communications Biology. 3 (1), 388 (2020).</li><li>Magny, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+regulation+of+cardiac+calcium+uptake+by+peptides+encoded+in+small+open+reading+frames.">Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames.</a> Science. 341 (6150), 1116-1120 (2013).</li><li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Molecular Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress.">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li><li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes.">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biology. 16, 90 (2015).</li><li>Chng, S. C., Ho, L., Tian, J., Reversade, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELABELA:+a+hormone+essential+for+heart+development+signals+via+the+apelin+receptor.">ELABELA: a hormone essential for heart development signals via the apelin receptor.</a> Developmental Cell. 27 (6), 672-680 (2013).</li><li>Pauli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toddler:+an+embryonic+signal+that+promotes+cell+movement+via+Apelin+receptors.">Toddler: an embryonic signal that promotes cell movement via Apelin receptors.</a> Science. 343 (6172), 1248636 (2014).</li><li>Stark, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+functional+elements+in+12+Drosophila+genomes+using+evolutionary+signatures.">Discovery of functional elements in 12 Drosophila genomes using evolutionary signatures.</a> Nature. 450 (7167), 219-232 (2007).</li><li>Lin, M. F., Jungreis, I., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhyloCSF:+a+comparative+genomics+method+to+distinguish+protein+coding+and+non-coding+regions.">PhyloCSF: a comparative genomics method to distinguish protein coding and non-coding regions.</a> Bioinformatics. 27 (13), 275-282 (2011).</li><li>Slavoff, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+discovery+of+short+open+reading+frame-encoded+peptides+in+human+cells.">Peptidomic discovery of short open reading frame-encoded peptides in human cells.</a> Nature Chemical Biology. 9 (1), 59-64 (2013).</li><li>Schwaid, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+discovery+of+cysteine-containing+human+short+open+reading+frames.">Chemoproteomic discovery of cysteine-containing human short open reading frames.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (45), 16750-16753 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation+and+quantitation+of+translation+by+ribosome+profiling.">Genome-wide annotation and quantitation of translation by ribosome profiling.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 1-19 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Xiao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+annotation+and+characterization+of+the+translatome+with+ribosome+profiling+data.">De novo annotation and characterization of the translatome with ribosome profiling data.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 61 (2018).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF3+Associates+with+80S+Ribosomes+to+Promote+Translation+Elongation,+Mitochondrial+Homeostasis,+and+Muscle+Health.">eIF3 Associates with 80S Ribosomes to Promote Translation Elongation, Mitochondrial Homeostasis, and Muscle Health.</a> Molecular Cell. 79 (4), 575-587 (2020).</li><li>. AGAT: Another Gff Analysis Toolkit to handle annotations in any GTF/GFF format Available from: <a target="_blank" href="https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html">https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html</a> (2020)</li><li>. Gene Expression Omnibus Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo">https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo</a> (2002)</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>. STAR manual Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf">https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf</a> (2022)</li><li>. The genetic codes Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi</a> (2019)</li><li>. RiboMiner Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboMiner">https://github.com/xryanglab/RiboMiner</a> (2020)</li><li>Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+global+views+of+translation.">Ribosome profiling: global views of translation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), 032698 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+translation+initiation+sites+in+mammalian+cells+at+single-nucleotide+resolution.">Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+initiating+ribosomes+in+vivo.">Quantitative profiling of initiating ribosomes in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 147-153 (2015).</li><li>Spealman, P., Naik, A., McManus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uORF-seqr:+A+Machine+Learning-Based+approach+to+the+identification+of+upstream+open+reading+frames+in+yeast.">uORF-seqr: A Machine Learning-Based approach to the identification of upstream open reading frames in yeast.</a> Methods in Molecular Biol. 2252, 313-329 (2021).</li><li>. RiboCode Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboCode">https://github.com/xryanglab/RiboCode</a> (2018)</li><li>Sharma, P., Wu, J., Nilges, B. S., Leidel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+and+other+commonly+used+model+organisms+are+resistant+to+cycloheximide-mediated+biases+in+ribosome+profiling+experiments.">Humans and other commonly used model organisms are resistant to cycloheximide-mediated biases in ribosome profiling experiments.</a> Nature Communications. 12 (1), 5094 (2021).</li></ol>

El perfil de ribosomas ofrece una oportunidad sin precedentes para estudiar la acción de los ribosomas en las células a escala genómica. Descifrar con precisión la información transportada por los datos de perfiles de ribosomas podría proporcionar información sobre qué regiones de genes o transcripciones se están traduciendo activamente. Este protocolo paso a paso proporciona orientación sobre cómo usar RiboCode para analizar los datos de perfiles de ribosomas en detalle, incluida la instalación de paquetes, ...

Recientemente, un creciente cuerpo de estudios ha revelado una producción generalizada de péptidos traducidos de ORF de genes codificantes y los genes previamente anotados como no codificantes, como los ARN no codificantes largos (lncRNA)1,2,3,4,5,6,7,8. Estos ORF traducidos son regulados o inducidos por las células para responder a los cambios ambientales, el estrés y la diferenciación celular1,8,9,10,11,12,13. Se ha demostrado que los productos de traducción de algunos ORF desempeñan importantes funciones reguladoras en diversos procesos biológicos en desarrollo y fisiología. Por ejemplo, Chng et al.14 descubrieron una hormona peptídica llamada Elabela (Ela, también conocida como Apela/Ende/Toddler), que es crítica para el desarrollo cardiovascular. Pauli et al. sugirieron que Ela también actúa como un mitógeno que promueve la migración celular en el embrión de peces tempranos15. Magny et al. reportaron dos micropéptidos de menos de 30 aminoácidos que regulan el transporte de calcio y afectan la contracción muscular regular en el corazón de Drosophila10.
No está claro cuántos de estos péptidos están codificados por el genoma y si son biológicamente relevantes. Por lo tanto, la identificación sistemática de estos ORF potencialmente codificantes es muy deseable. Sin embargo, determinar directamente los productos de estos ORF (es decir, proteínas o péptidos) utilizando enfoques tradicionales como la conservación evolutiva16,17 y la espectrometría de masas18,19 es un desafío porque la eficiencia de detección de ambos enfoques depende de la longitud, abundancia y composición de aminoácidos de las proteínas o péptidos producidos. El advenimiento del perfil de ribosomas, una técnica para identificar la ocupación del ribosoma en los ARNm a resolución de nucleótidos, ha proporcionado una forma precisa de evaluar el potencial de codificación de diferentes transcripciones3,20,21, independientemente de su longitud y composición. Una característica importante y de uso frecuente para identificar ORF que traducen activamente utilizando perfiles de ribosomas es la periodicidad de tres nucleótidos (3-nt) de las huellas del ribosoma en el ARNm desde el codón de inicio hasta el codón de parada. Sin embargo, los datos de perfiles de ribosomas a menudo tienen varios problemas, incluidas las lecturas de secuenciación bajas y escasas a lo largo de los ORF, el alto ruido de secuenciación y las contaminaciones de ARN ribosómico (ARNr). Por lo tanto, las señales distorsionadas y ambiguas generadas por dichos datos debilitan los patrones de periodicidad de 3-nt de las huellas de los ribosomas en el ARNm, lo que en última instancia dificulta la identificación de los ORF traducidos de alta confianza.
Un paquete llamado "RiboCode" adaptó una prueba modificada de rango firmado por Wilcoxon y una estrategia de integración de valor P para examinar si el ORF tiene significativamente más fragmentos protegidos por ribosomas (RPF) en el marco que los RPF fuera del marco22. Se demostró que es altamente eficiente, sensible y preciso para la anotación de novo del traducoma en datos de perfiles de ribosomas simulados y reales. Aquí, describimos cómo usar esta herramienta para detectar el potencial de traducción de ORFs de los conjuntos de datos de secuenciación de perfiles de ribosomas en bruto generados por el estudio anterior23. Estos conjuntos de datos se habían utilizado para explorar la función de la subunidad EIF3 "E" (EIF3E) en la traducción mediante la comparación de los perfiles de ocupación de ribosomas de células MCF-10A transfectadas con ARN de control (si-Ctrl) y EIF3E (si-eIF3e) de interferencia pequeña (siRNAs). Al aplicar RiboCode a estos conjuntos de datos de ejemplo, detectamos 5.633 nuevos ORF que potencialmente codifican pequeños péptidos o proteínas. Estos ORF se clasificaron en varios tipos en función de sus ubicaciones en relación con las regiones codificantes, incluidos los ORF aguas arriba (uORF), los ORF aguas abajo (dORF), los ORF superpuestos, los ORF de nuevos genes codificantes de proteínas (nuevos PCG) y los ORF de nuevos genes no codificantes de proteínas (nuevos nonPCG). Las densidades de lectura de FPR en los uORF aumentaron significativamente en las células deficientes en EIF3E en comparación con las células de control, lo que podría ser causado al menos parcialmente por el enriquecimiento de ribosomas que traducen activamente. La acumulación localizada de ribosomas en la región del codón 25 al 75 de células deficientes en EIF3E indicó un bloqueo de la elongación de la traducción en la etapa temprana. Este protocolo también muestra cómo visualizar la densidad de RPF de la región deseada para examinar los patrones de periodicidad de 3 nt de huellas de ribosomas en ORF identificados. Estos análisis demuestran el poderoso papel de RiboCode en la identificación de ORF de traducción y el estudio de la regulación de la traducción.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A computer/server running Linux</td>
			<td>Any</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaconda or Miniconda</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>-</td>
			<td>Anaconda: https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data

La identificación de marcos de lectura abiertos (ORF), especialmente aquellos que codifican pequeños péptidos y se traducen activamente en contextos fisiológicos específicos, es fundamental para las anotaciones completas de los traducomas dependientes del contexto. El perfil de ribosomas, una técnica para detectar las ubicaciones de unión y las densidades de la traducción de ribosomas en el ARN, ofrece una vía para descubrir rápidamente dónde se produce la traducción a escala de todo el genoma. Sin embargo, no es una tarea trivial en bioinformática identificar de manera eficiente y exhaustiva los ORF de traducción para el perfil de ribosomas. Aquí se describe un paquete fácil de usar, llamado RiboCode, diseñado para buscar ORF de traducción activa de cualquier tamaño a partir de señales distorsionadas y ambiguas en datos de perfiles de ribosomas. Tomando nuestro conjunto de datos publicado anteriormente como ejemplo, este artículo proporciona instrucciones paso a paso para toda la canalización de RiboCode, desde el preprocesamiento de los datos sin procesar hasta la interpretación de los archivos de resultados de salida final. Además, para evaluar las tasas de traducción de los ORF anotados, también se describen en detalle los procedimientos para la visualización y cuantificación de las densidades de ribosomas en cada ORF. En resumen, el presente artículo es una instrucción útil y oportuna para los campos de investigación relacionados con la traducción, los ORF pequeños y los péptidos.

Los conjuntos de datos de perfiles de ribosomas de ejemplo se depositaron en la base de datos GEO con el número de acceso GSE131074. Todos los archivos y códigos utilizados en este protocolo están disponibles en los archivos complementarios 1-4. Mediante la aplicación de RiboCode a un conjunto de conjuntos de datos de perfiles de ribosomas publicados23, identificamos los nuevos ORF traducidos activamente en células MCF-10A tratadas con siRNAs...

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De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

La traducción de ribosomas decodifica tres nucleótidos por codón en péptidos. Su movimiento a lo largo del ARNm, capturado por el perfil de ribosomas, produce las huellas que exhiben una periodicidad de triplete característica. Este protocolo describe cómo usar RiboCode para descifrar esta característica prominente a partir de los datos de perfiles de ribosomas para identificar marcos de lectura abiertos traducidos activamente a nivel de transcriptoma completo.

De novo Identificación de marcos de lectura abiertos traducidos activamente con datos de perfil de ribosomas

Identification of open reading frames (ORFs), especially those encoding small peptides and being actively translated under specific physiological ...

La interpretación de los datos de secuenciación generados por el experimento de perfilación de ribosomas es fundamental para medir cuantitativamente las actividades traslacionales de los ribosomas en el ARNm y para estudiar los mecanismos de regulación traslacional. En este protocolo, describiremos el procedimiento computacional para utilizar los datos de perfil de ribosomas y RiboCode, una herramienta de línea de comandos para decodificar la traducción de ARNm a escala de todo el genoma y resolución de nucleótido único. Este método permite buscar los nuevos péptidos que surgen de las regiones genómicas fuera de los genes codificantes de proteínas anotadas, y ofrece la oportunidad de cuantificar la tasa de traducción de ARNm.Para comenzar, abra una ventana de terminal Linux y cree un entorno conda ejecutando el comando. Cambie al entorno creado e instale RiboCode y las dependencias ejecutando el comando. Para obtener los archivos de referencia del genoma para la secuencia de referencia, vaya al sitio web de Ensembl y, a continuación, haga clic en descargar, seguido de Descarga FTP.Haga clic en la opción FASTA en la columna DNA FASTA y seleccione la fila donde la especie es humana, que se muestra en la tabla de la página del sitio web. En la página del sitio web de Ensembl, copie el enlace como se menciona en el texto, luego descargue y descomprima los archivos en el terminal ejecutando el comando. Para obtener una anotación de referencia, haga clic con el botón derecho en GTF en los conjuntos de genes de columna de la última página web abierta.Copie el enlace y descárguelo mediante el comando. Para obtener secuencias de ARNr, abra el navegador del genoma UCSC, luego haga clic en herramientas y seleccione navegador de tabla en la lista desplegable. En la página del explorador del genoma UCSC, especifique mamífero para el clado, humano para el genoma, todas las tablas para el grupo, máscara R para la tabla y genoma para la región.Para el filtro, haga clic en crear para ir a una nueva página y establezca la clase de representación como coincide con rRNA. Haga clic en enviar y, a continuación, establezca el formato de salida en secuencia y el nombre del archivo de salida como HG38_rRNA. FA. Finalmente, haga clic en obtener salida y, a continuación, seleccione obtener secuencia para recuperar la secuencia de ARNr.Para obtener conjuntos de datos de perfiles de ribosomas del archivo de lectura de secuencia, descargue los ejemplos de réplica del grupo de tratamiento si-eIFe y cámbieles el nombre ejecutando el comando. A continuación, descargue los ejemplos de réplica del grupo de control y cámbieles el nombre ejecutando el comando. Para eliminar la contaminación de ARNr, comience a indexar secuencias de referencia de ARNr ejecutando el comando.Después de la indexación, alinee las lecturas con la referencia rRNA para descartar las lecturas que se originan en rRNA ejecutando el comando. Comience por crear un índice del genoma ejecutando el comando. A continuación, alinee las lecturas limpias sin contaminación de ARNr con la referencia creada ejecutando el comando y, a continuación, ordene e indexe los archivos de alineación ejecutando el comando.Prepare las anotaciones de transcripción ejecutando el comando. Seleccione fragmentos protegidos de ribosomas de longitudes específicas e identifique sus posiciones en el sitio P ejecutando el comando. Edite los archivos de configuración de cada ejemplo y combínelos.A continuación, ejecute RiboCode ejecutando el comando. La distribución de frecuencia de las longitudes de las lecturas mostró que la mayoría de los fragmentos protegidos por ribosomas corresponden a 25 a 35 nucleótidos. Las ubicaciones del sitio P para diferentes longitudes de fragmentos protegidos por ribosomas se determinaron examinando las distancias desde sus cinco extremos primos hasta los codones de inicio y parada anotados.Los resultados del mapeo muestran que 10, 394 genes codifican para marcos de lectura abiertos anotados. Además, los genes 509 y 168 codifican para marcos de lectura abiertos ascendentes y descendentes, mientras que 939 genes codifican para marcos de lectura abiertos ascendentes o posteriores, superpuestos con marcos de lectura abiertos anotados conocidos. Además, 68 genes codificantes de proteínas y 2.601 genes no codificantes codifican para nuevos marcos de lectura abiertos.La distribución de la longitud mostró que los marcos de lectura abiertos aguas arriba, aguas abajo, novedosos y superpuestos eran más cortos que los marcos de lectura abiertos anotados. Se calcularon recuentos relativos de fragmentos protegidos por ribosomas para cada marco de lectura abierto, lo que revela que las densidades de ribosomas de los marcos de lectura abiertos aguas arriba fueron significativamente más altas en las células deficientes de eIF3e que en las células de control. El análisis metagénico reveló que una masa de ribosomas se estancó entre los codones 25 y 75 aguas abajo del codón de inicio, lo que sugiere que el alargamiento de la traducción podría bloquearse temprano en las células deficientes de eIF3e.Se examinaron los perfiles de densidad de sitios P para marcos de lectura abiertos aguas arriba de PSMA6 y marcos de lectura abiertos aguas abajo del gen SENP3-EIF4A1, demostrando los patrones de periodicidad y densidades de fragmentos protegidos por ribosomas. Es necesario verificar las ubicaciones de las lecturas alrededor de los codones de inicio y parada de las regiones codificantes de proteínas conocidas para evaluar las propiedades periódicas de las lecturas para cada longitud. RiboCode, junto con otra herramienta de línea de comandos, RiboMiner también puede realizar control de calidad y múltiples análisis, como cuantificar y visualizar las ocupaciones de los ribosomas en los marcos de lectura abiertos previstos.Esta herramienta computacional proporciona una forma de alto rendimiento para identificar eventos de traducción no canónicos con datos de perfiles de ribosomas en contextos fisiológicos específicos, y cómo la traducción se modula en respuesta al estímulo.

Research

JoVE Journal

Biology

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

SABIDURÍA Proteína: Un banco de trabajo para<em&gt; En silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Diseño de biomoléculas

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Investigación

Biología

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Análisis de la Traducción Iniciación Durante condiciones de estrés por polisoma Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Flujo de trabajo para de alto contenido, cuantificación de la célula individual de marcadores fluorescentes de Universal Microscopio de datos, apoyados por software de fuente abierta

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina para la Identificación de Arabidopsis proteína-DNA<em&gt; En Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Un método fácil para la planta de perfiles de polisomas

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generación de células somáticas por YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

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IR-TEx: Una herramienta de integración de datos de código abierto para transcriptomica de Big Data diseñada para las anopheles gambiae de vectores de malaria

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Alinee y Worm_CP, dos tuberías de código abierto para el enderezamiento y cuantificación de datos de imagen de fluorescencia obtenidos de Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

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Evaluación de las tasas de síntesis de proteínas de novo en Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...