Name: de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data
Uploaded: 2022-02-18T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data at JoVE.com

Yazarlar, Xi'an Jiaotong Üniversitesi'nin HPCC platformu tarafından sağlanan hesaplama kaynaklarından gelen desteği kabul etmek istiyor. Z.X., Xi'an Jiaotong Üniversitesi'nin Genç Topnotch Yetenek Destek Planı'na minnetle teşekkür eder.

1. Ortam kurulumu ve RiboCode kurulumu
<ol><li>Bir Linux terminal penceresi açın ve bir conda ortamı oluşturun: conda create -n RiboCode python=3.8
</li>
	<li>Oluşturulan ortama geçin ve RiboCode ve bağımlılıklarını yükleyin: conda RiboCode'u etkinleştir conda yüklemek -c bioconda ribocode ribominer sra-tools fastx_toolkit cutadapt papyon yıldız samtools
</li>
</ol>2. Veri hazırlama
<ol><li>Genom referans dosyaları...

<ol>
	<li>Eisenberg, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+Initiation+Site+Profiling+Reveals+Widespread+Synthesis+of+Non-AUG-Initiated+Protein+Isoforms+in+Yeast.">Translation Initiation Site Profiling Reveals Widespread Synthesis of Non-AUG-Initiated Protein Isoforms in Yeast.</a> Cell Systems. 11 (2), 145-160 (2020).</li><li>Spealman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+non-AUG+uORFs+revealed+by+a+novel+regression+analysis+of+ribosome+profiling+data.">Conserved non-AUG uORFs revealed by a novel regression analysis of ribosome profiling data.</a> Genome Research. 28 (2), 214-222 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147 (4), 789-802 (2011).</li><li>Bazzini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+ORFs+in+vertebrates+using+ribosome+footprinting+and+evolutionary+conservation.">Identification of small ORFs in vertebrates using ribosome footprinting and evolutionary conservation.</a> The EMBO Journal. 33 (9), 981-993 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell Reports. 8 (5), 1365-1379 (2014).</li><li>Chew, G. L., Pauli, A., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+uORF+repressiveness+and+sequence+features+in+mouse,+human+and+zebrafish.">Conservation of uORF repressiveness and sequence features in mouse, human and zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 11663 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genome-wide+distribution+and+evolution+of+uORFs+in+eukaryotes.">Determinants of genome-wide distribution and evolution of uORFs in eukaryotes.</a> Nature Communications. 12 (1), 1076 (2021).</li><li>Guenther, U. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+helicase+Ded1p+controls+use+of+near-cognate+translation+initiation+codons+in+5'+UTRs.">The helicase Ded1p controls use of near-cognate translation initiation codons in 5' UTRs.</a> Nature. 559 (7712), 130-134 (2018).</li><li>Goldsmith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+a+functional+role+for+autophagy+in+mRNA+translational+control.">Ribosome profiling reveals a functional role for autophagy in mRNA translational control.</a> Communications Biology. 3 (1), 388 (2020).</li><li>Magny, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+regulation+of+cardiac+calcium+uptake+by+peptides+encoded+in+small+open+reading+frames.">Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames.</a> Science. 341 (6150), 1116-1120 (2013).</li><li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Molecular Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress.">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li><li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes.">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biology. 16, 90 (2015).</li><li>Chng, S. C., Ho, L., Tian, J., Reversade, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELABELA:+a+hormone+essential+for+heart+development+signals+via+the+apelin+receptor.">ELABELA: a hormone essential for heart development signals via the apelin receptor.</a> Developmental Cell. 27 (6), 672-680 (2013).</li><li>Pauli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toddler:+an+embryonic+signal+that+promotes+cell+movement+via+Apelin+receptors.">Toddler: an embryonic signal that promotes cell movement via Apelin receptors.</a> Science. 343 (6172), 1248636 (2014).</li><li>Stark, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+functional+elements+in+12+Drosophila+genomes+using+evolutionary+signatures.">Discovery of functional elements in 12 Drosophila genomes using evolutionary signatures.</a> Nature. 450 (7167), 219-232 (2007).</li><li>Lin, M. F., Jungreis, I., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhyloCSF:+a+comparative+genomics+method+to+distinguish+protein+coding+and+non-coding+regions.">PhyloCSF: a comparative genomics method to distinguish protein coding and non-coding regions.</a> Bioinformatics. 27 (13), 275-282 (2011).</li><li>Slavoff, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+discovery+of+short+open+reading+frame-encoded+peptides+in+human+cells.">Peptidomic discovery of short open reading frame-encoded peptides in human cells.</a> Nature Chemical Biology. 9 (1), 59-64 (2013).</li><li>Schwaid, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+discovery+of+cysteine-containing+human+short+open+reading+frames.">Chemoproteomic discovery of cysteine-containing human short open reading frames.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (45), 16750-16753 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation+and+quantitation+of+translation+by+ribosome+profiling.">Genome-wide annotation and quantitation of translation by ribosome profiling.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 1-19 (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Xiao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+annotation+and+characterization+of+the+translatome+with+ribosome+profiling+data.">De novo annotation and characterization of the translatome with ribosome profiling data.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 61 (2018).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF3+Associates+with+80S+Ribosomes+to+Promote+Translation+Elongation,+Mitochondrial+Homeostasis,+and+Muscle+Health.">eIF3 Associates with 80S Ribosomes to Promote Translation Elongation, Mitochondrial Homeostasis, and Muscle Health.</a> Molecular Cell. 79 (4), 575-587 (2020).</li><li>. AGAT: Another Gff Analysis Toolkit to handle annotations in any GTF/GFF format Available from: <a target="_blank" href="https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html">https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html</a> (2020)</li><li>. Gene Expression Omnibus Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo">https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo</a> (2002)</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>. STAR manual Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf">https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf</a> (2022)</li><li>. The genetic codes Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi</a> (2019)</li><li>. RiboMiner Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboMiner">https://github.com/xryanglab/RiboMiner</a> (2020)</li><li>Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+global+views+of+translation.">Ribosome profiling: global views of translation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), 032698 (2018).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+translation+initiation+sites+in+mammalian+cells+at+single-nucleotide+resolution.">Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+initiating+ribosomes+in+vivo.">Quantitative profiling of initiating ribosomes in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 147-153 (2015).</li><li>Spealman, P., Naik, A., McManus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uORF-seqr:+A+Machine+Learning-Based+approach+to+the+identification+of+upstream+open+reading+frames+in+yeast.">uORF-seqr: A Machine Learning-Based approach to the identification of upstream open reading frames in yeast.</a> Methods in Molecular Biol. 2252, 313-329 (2021).</li><li>. RiboCode Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/xryanglab/RiboCode">https://github.com/xryanglab/RiboCode</a> (2018)</li><li>Sharma, P., Wu, J., Nilges, B. S., Leidel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+and+other+commonly+used+model+organisms+are+resistant+to+cycloheximide-mediated+biases+in+ribosome+profiling+experiments.">Humans and other commonly used model organisms are resistant to cycloheximide-mediated biases in ribosome profiling experiments.</a> Nature Communications. 12 (1), 5094 (2021).</li></ol>

Ribozom profilleme, ribozomların hücrelerdeki etkisini genom ölçeğinde incelemek için benzeri görülmemiş bir fırsat sunar. Ribozom profilleme verileri tarafından taşınan bilgilerin tam olarak deşifre edilmesi, hangi gen bölgelerinin veya transkriptlerin aktif olarak çevrildiğine dair fikir verebilir. Bu adım adım protokol, ribozom profil oluşturma verilerini paket yükleme, veri hazırlama, komut yürütme, sonuç açıklaması ve veri görselleştirme dahil olmak üzere ayrıntılı olarak analiz etm...

Son zamanlarda, giderek artan bir çalışma grubu, kodlayan genlerin ORF'lerinden ve daha önce açıklanmış genlerden kodlanmamış olarak çevrilmiş peptitlerin yaygın bir şekilde üretildiğini ortaya koymuştur, örneğin uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar)1,2,3,4,5,6,7,8. Bu çevrilmiş ORF'ler, çevresel değişikliklere, strese ve hücre farklılaşmasına yanıt vermek için hücreler tarafından düzenlenir veya uyarılır1,8,9,10,11,12,13. Bazı ORF'lerin çeviri ürünlerinin, gelişim ve fizyolojideki çeşitli biyolojik süreçlerde önemli düzenleyici roller oynadığı gösterilmiştir. Örneğin, Chng ve ark.14, kardiyovasküler gelişim için kritik olan Elabela (Ela, Apela / Ende / Toddler olarak da bilinir) adlı bir peptid hormonu keşfetti. Pauli ve ark., Ela'nın ayrıca erken balık embriyosunda hücre göçünü teşvik eden bir mitojen görevi gördüğünü öne sürdü15. Magny ve ark., kalsiyum taşınımını düzenleyen ve Drosophila kalbindeki düzenli kas kasılmasını etkileyen 30'dan az amino asitten oluşan iki mikropeptit bildirmiştir10.
Bu tür peptitlerin genom tarafından kaç tane kodlandığı ve biyolojik olarak alakalı olup olmadıkları belirsizliğini korumaktadır. Bu nedenle, bu potansiyel olarak kodlayan ORF'lerin sistematik olarak tanımlanması oldukça arzu edilir. Bununla birlikte, evrimsel koruma16,17 ve kütle spektrometrisi18,19 gibi geleneksel yaklaşımları kullanarak bu ORF'lerin (yani protein veya peptit) ürünlerini doğrudan belirlemek zordur, çünkü her iki yaklaşımın da tespit verimliliği, üretilen proteinlerin veya peptitlerin uzunluğuna, bolluğuna ve amino asit bileşimine bağlıdır. Nükleotid çözünürlüğünde mRNA'lar üzerindeki ribozom doluluğunu tanımlamak için bir teknik olan ribozom profillemesinin ortaya çıkışı, uzunluklarına ve bileşimlerine bakılmaksızın farklı transkriptlerin kodlama potansiyelini değerlendirmek için kesin bir yol sağlamıştır3,20,21. Ribozom profillemesini kullanarak aktif olarak çevrilen ORF'leri tanımlamak için önemli ve sık kullanılan bir özellik, ribozomun mRNA üzerindeki ayak izlerinin başlangıç kodonundan durdurma kodonuna kadar üç nükleotid (3-nt) periyodikliğidir. Bununla birlikte, ribozom profilleme verileri genellikle ORF'ler boyunca düşük ve seyrek dizileme okumaları, yüksek dizileme gürültüsü ve ribozomal RNA (rRNA) kontaminasyonları dahil olmak üzere çeşitli sorunlara sahiptir. Bu nedenle, bu tür veriler tarafından üretilen çarpık ve belirsiz sinyaller, ribozomların mRNA üzerindeki ayak izlerinin 3-nt periyodiklik kalıplarını zayıflatır ve bu da sonuçta yüksek güvenilirliğe sahip çevrilmiş ORF'lerin tanımlanmasını zorlaştırır.
"RiboCode" adlı bir paket, ORF'nin çerçeve dışı RPF'lerden önemli ölçüde daha fazla kare içi ribozom korumalı parçaya (RPF) sahip olup olmadığını incelemek için değiştirilmiş bir Wilcoxon imzalı sıralama testi ve P değeri entegrasyon stratejisini uyarladı22. Simüle edilmiş ve gerçek ribozom profil oluşturma verilerinde translatomun de novo ek açıklaması için son derece verimli, hassas ve doğru olduğu gösterilmiştir. Burada, önceki çalışma tarafından oluşturulan ham ribozom profil oluşturma sıralama veri kümelerinden potansiyel çeviri ORF'lerini tespit etmek için bu aracın nasıl kullanılacağını açıklıyoruz23. Bu veri kümeleri, kontrol (si-Ctrl) ve EIF3E (si-eIF3e) küçük müdahale eden RNA'lar (siRNA'lar) ile transfekte edilen MCF-10A hücrelerinin ribozom doluluk profillerini karşılaştırarak çeviride EIF3 alt birimi "E" nin (EIF3E) işlevini araştırmak için kullanılmıştır. RiboCode'u bu örnek veri kümelerine uygulayarak, potansiyel olarak küçük peptitleri veya proteinleri kodlayan 5.633 yeni ORF tespit ettik. Bu ORF'ler, yukarı akış ORF'leri (uORF'ler), aşağı akış ORF'leri (dORF'ler), üst üste binen ORF'ler, yeni protein kodlayan genlerden (yeni PCG'ler) ORF'ler ve yeni protein kodlamayan genlerden (yeni NonPCG'ler) ORF'ler dahil olmak üzere kodlama bölgelerine göre konumlarına göre çeşitli tiplerde kategorize edildi. uORF'ler üzerindeki RPF okuma yoğunlukları, kontrol hücrelerine kıyasla EIF3E eksikliği olan hücrelerde önemli ölçüde artmıştır, bu da en azından kısmen aktif olarak çevrilen ribozomların zenginleşmesinden kaynaklanabilir. EIF3E eksikliği olan hücrelerin 25. ila 75. kodonu arasındaki bölgede lokalize ribozom birikimi, erken evrede translasyon uzamasının tıkandığını göstermiştir. Bu protokol ayrıca, tanımlanan ORF'ler üzerindeki ribozom ayak izlerinin 3-nt periyodiklik modellerini incelemek için istenen bölgenin RPF yoğunluğunun nasıl görselleştirileceğini de göstermektedir. Bu analizler, RiboCode'un ORF'lerin çevirisini tanımlamadaki ve çevirinin düzenlenmesini incelemedeki güçlü rolünü göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A computer/server running Linux</td>
			<td>Any</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaconda or Miniconda</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>-</td>
			<td>Anaconda: https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo identification of actively translated open reading frames with ribosome profiling data

Açık okuma çerçevelerinin (ORF'ler), özellikle küçük peptitleri kodlayan ve belirli fizyolojik bağlamlar altında aktif olarak çevrilenlerin tanımlanması, bağlama bağlı translatomların kapsamlı ek açıklamaları için kritik öneme sahiptir. RNA üzerindeki ribozomları çevirmenin bağlanma yerlerini ve yoğunluklarını tespit etmek için kullanılan bir teknik olan ribozom profilleme, genom çapında çevirinin nerede gerçekleştiğini hızlı bir şekilde keşfetmek için bir yol sunar. Bununla birlikte, biyoinformatikte, ribozom profillemesi için çeviri yapan ORF'leri verimli ve kapsamlı bir şekilde tanımlamak önemsiz bir görev değildir. Burada, ribozom profil oluşturma verilerindeki bozuk ve belirsiz sinyallerden herhangi bir boyuttaki ORF'leri aktif olarak çevirmek için tasarlanmış RiboCode adlı kullanımı kolay bir paket açıklanmaktadır. Daha önce yayımlanmış veri kümemizi örnek alan bu makalede, ham verilerin önceden işlenmesinden nihai çıktı sonucu dosyalarının yorumlanmasına kadar tüm RiboCode işlem hattı için adım adım yönergeler sağlanmaktadır. Ayrıca, açıklamalı ORF'lerin çeviri oranlarını değerlendirmek için, her bir ORF'deki ribozom yoğunluklarının görselleştirilmesi ve ölçülmesi için prosedürler de ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Özetle, bu makale çeviri, küçük ORF'ler ve peptitlerle ilgili araştırma alanları için yararlı ve zamanında bir talimattır.

Örnek ribozom profil oluşturma veri kümeleri, GEO veritabanında GSE131074 katılım numarası altında depolanmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm dosyalar ve kodlar Ek dosyalar 1-4'ten edinilebilir. RiboCode'u bir dizi yayınlanmış ribozom profilleme veri kümesine23 uygulayarak, kontrol ve EIF3E siRNA'ları ile tedavi edilen MCF-10A hücrelerinde aktif olarak çevrilen yeni ORF'leri tanımladık. Büyük olasılıkla çeviri ...

Watch this Scientific Journal Video about De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data at JoVE.com

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

Ribozomların çevrilmesi, kodon başına üç nükleotidin peptitlere şifresini çözer. Ribozom profillemesi ile yakalanan mRNA boyunca hareketleri, karakteristik üçlü periyodiklik sergileyen ayak izlerini üretir. Bu protokol, tüm transkriptom düzeyinde aktif olarak çevrilmiş açık okuma çerçevelerini tanımlamak için ribozom profil oluşturma verilerinden bu belirgin özelliği deşifre etmek için RiboCode'un nasıl kullanılacağını açıklar.

De novo Aktif Olarak Çevrilmiş Açık Okuma Çerçevelerinin Ribozom Profil Oluşturma Verileri ile Tanımlanması

Identification of open reading frames (ORFs), especially those encoding small peptides and being actively translated under specific physiological ...

Ribozom profilleme deneyi tarafından üretilen dizileme verilerinin yorumlanması, ribozomların mRNA üzerindeki translasyonel aktivitelerini nicel olarak ölçmek ve translasyonel düzenleme mekanizmalarını incelemek için kritik öneme sahiptir. Bu protokolde, ribozom profil oluşturma verilerini ve genom çapında ölçekte ve tek nükleotid çözünürlüğünde mRNA translasyonunu çözmek için bir komut satırı aracı olan RiboCode'u kullanmak için hesaplama prosedürünü açıklayacağız. Bu yöntem, açıklamalı protein kodlayan genlerin dışındaki genomik bölgelerden kaynaklanan yeni peptitlerin aranmasına izin verir ve mRNA translasyon hızını ölçmek için bir fırsat sunar.Başlamak için bir Linux terminal penceresi açın ve komutu yürüterek bir conda ortamı oluşturun. Oluşturulan ortama geçin ve komutu yürüterek RiboCode ve bağımlılıklarını yükleyin. Referans dizisinin genom referans dosyalarını almak için Ensembl web sitesine gidin, ardından indir'e ve ardından FTP indirme'ye tıklayın.DNA FESTA sütunundaki FASTA seçeneğini tıklayın ve web sitesi sayfasındaki tabloda gösterilen türlerin insan olduğu satırı seçin. Topluluk web sitesi sayfasında, metni belirtildiği gibi bağlantıyı kopyalayın, ardından komutu yürüterek terminaldeki dosyaları indirin ve sıkıştırmasını açın. Referans ek açıklaması için, son açık web sayfasındaki sütun gen kümelerinde GTF'yi sağ tıklatın.Bağlantıyı kopyalayın ve komutu kullanarak indirin. rRNA dizilerini almak için UCSC genom tarayıcısını açın, ardından araçlar'a tıklayın ve açılır listeden tablo tarayıcısını seçin. UCSC genom tarayıcı sayfasında, klade için memeli, genom için insan, grup için tüm tablolar, tablo için R maskesi ve bölge için genom belirtin.Filtre için, yeni bir sayfaya gitmek üzere oluştur'u tıklatın ve rep sınıfını rRNA ile eşleştiği gibi ayarlayın. Gönder'e tıklayın ve ardından çıktı biçimini sıraya ayarlayın ve çıktı dosyası adını HG38_rRNA olarak ayarlayın. FA. Son olarak, çıktı al'a tıklayın ve ardından rRNA dizisini almak için sırayı al'ı seçin.Sıralı okuma arşivinden ribozom profil oluşturma veri kümeleri almak için, si-eIFe tedavi grubunun çoğaltma örneklerini indirin ve komutu yürüterek bunları yeniden adlandırın. Ardından denetim grubunun çoğaltma örneklerini karşıdan yükleyin ve komutu yürüterek bunları yeniden adlandırın. rRNA kontaminasyonunu gidermek için, komutu yürüterek rRNA referans dizilerini indekslemeye başlayın.İndekslemeden sonra, komutu yürüterek rRNA'dan kaynaklanan okumaları ekarte etmek için okumaları rRNA başvurusuna hizalayın. Komutu yürüterek bir genom indeksi oluşturarak başlayın. Ardından, komutu yürüterek rRNA kontaminasyonu olmadan temiz okumaları oluşturulan referansla hizalayın ve ardından komutu yürüterek hizalama dosyalarını sıralayın ve dizine ekleyin.Komutu yürüterek transkript ek açıklamalarını hazırlayın. Belirli uzunluklardaki ribozom korumalı parçaları seçin ve komutu yürüterek P sitesi konumlarını tanımlayın. Her örnek için yapılandırma dosyalarını düzenleyin ve birleştirin.Ardından komutu yürüterek RiboCode'u çalıştırın. Okumaların uzunluklarının frekans dağılımı, çoğu ribozom korumalı parçanın 25 ila 35 nükleotite karşılık geldiğini göstermiştir. Ribozom korumalı parçaların farklı uzunlukları için P-site konumları, beş ana uçlarından açıklamalı başlangıç ve bitiş kodonlarına olan mesafeler incelenerek belirlendi.Haritalama sonuçları, 10.394 genin açıklamalı açık okuma çerçevelerini kodladığını göstermektedir. Ayrıca, 509 ve 168 gen, yukarı akış ve aşağı akış açık okuma çerçevelerini kodlarken, 939 gen, bilinen açıklamalı açık okuma çerçeveleriyle örtüşen yukarı akış veya aşağı akış açık okuma çerçevelerini kodlar. Ayrıca, 68 protein kodlayan gen ve 2.601 kodlamayan gen, yeni açık okuma çerçeveleri için kodlar.Uzunluk dağılımı, yukarı akış, aşağı akış, yeni ve üst üste binen açık okuma çerçevelerinin açıklamalı açık okuma çerçevelerinden daha kısa olduğunu gösterdi. Her açık okuma çerçevesi için göreceli ribozom korumalı parça sayıları hesaplandı ve yukarı akış açık okuma çerçevelerinin ribozom yoğunluklarının eIF3e eksik hücrelerinde kontrol hücrelerinden önemli ölçüde daha yüksek olduğu ortaya çıktı. Metagen analizi, başlangıç kodonunun aşağı yönündeki 25 ve 75 numaralı kodonlar arasında bir ribozom kütlesinin durduğunu ortaya koydu ve bu da translasyon uzamasının eIF3e eksik hücrelerinde erken bloke edilebileceğini düşündürdü.PSMA6'nın yukarı akış açık okuma çerçeveleri ve SENP3-EIF4A1 geninin aşağı akış açık okuma çerçeveleri için P-siteleri yoğunluk profilleri incelendi ve ribozom korumalı parçaların periyodiklik kalıpları ve yoğunlukları gösterildi. Bilinen protein kodlama bölgelerinin başlangıç ve bitiş kodonları etrafındaki okumaların konumlarını kontrol etmek, her uzunluk için okumaların periyodik özelliklerini değerlendirmek için gereklidir. RiboCode, başka bir komut satırı aracıyla birlikte, RiboMiner ayrıca kalite kontrolü ve ribozomların öngörülen açık okuma çerçevelerindeki doluluklarını ölçmek ve görselleştirmek gibi çoklu analizler gerçekleştirebilir.Bu hesaplama aracı, belirli fizyolojik bağlamlarda ribozom profil oluşturma verileriyle kanonik olmayan çeviri olaylarını ve çevirinin uyarana yanıt olarak nasıl modüle edildiğini tanımlamak için yüksek verimli bir yol sağlar.

Research

JoVE Journal

Biology

De novo Identification of Actively Translated Open Reading Frames with Ribosome Profiling Data

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein AKIL: A Tezgahı<em&gt; Siliko olarak</em&gt;<em&gt; De novo</emBiyomoleküllerin&gt; Tasarım

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Somatik kök hücreleri tarafından YAP/TAZ nesil

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: Sıtma Vektör Anopheles gambiyae için tasarlanmış Büyük Veri Transkripsiyonları için Açık Kaynak Veri Entegrasyon Aracı

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans'tan Elde Edilen Floresan Görüntü Verilerinin Düzleştirilmesi ve Ölçülmesi Için Solucan Hizalama ve Worm_CP İki Açık Kaynak Boru Hattı

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans de novo Protein Sentez Oranlarının Değerlendirilmesi

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...