Name: studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

نود أن نشكر طلابنا الباحثين على مر السنين. على وجه الخصوص ، نينا ماير ، سيبيل ماير ، جوليان كايم ، ولورا جاجي ، الذين تم استخدام بياناتهم في هذا البروتوكول كنتائج تمثيلية. تم تمويل أبحاث مجموعتنا المعروضة هنا من خلال منح من Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4 ، Hu 839/7-1) إلى Armin Huber.

1. اعتبارات عامة
<ol><li>استخدم مخزونات ذبابة الفاكهة التي تعبر عن بروتين فلوري دائم الموقع بشكل دائم للتحليل المورفولوجي (على سبيل المثال ، TRP::eGFP ، eGFP::NINAC) ونقل البروتينات للتحليلات المتعلقة بالاتجار بالبروتين (على سبيل المثال ، TRPL::eGFP ، Arr2::eGFP).</li>
	<li>تحديد مسبق لظروف التعرض للض?...

<ol>
	<li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration.">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).</li><li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina.">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li><li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila.">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pfl&#252;gers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li><li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration:+lessons+from+the+fly.">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li><li>B&#228;hner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current.">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li><li>Cronin, M. A., Lieu, M. -. H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors.">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li><li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade.">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, 2592-2603 (2006).</li><li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin.">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li><li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum.">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li><li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+ph&#233;nom&#233;nes+de+pseudopupille+dans+l'oeil+compose+de+Drosophila.">Les ph&#233;nom&#233;nes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li><li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia.">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li><li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system.">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li><li>Meyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+light-dependent+translocation+of+the+ion+channel+TRPL+in+the+photoreceptors+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer.+nat.">Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2005).</li><li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., D&#252;rr, T. D., Sch&#228;fer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL.">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li><li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye.">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li><li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability.">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li><li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila.">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).</li><li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila.">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li><li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice.">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li><li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila.">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).</li><li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).</li><li>Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+TRP+ion+channels+in+the+photoreceptor+cells+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer,+nat.">Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2007).</li><li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila.">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li><li>Hardie, R. C., Liu, C. -. H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors.">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li><li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4,5+bisphosphate+(PIP2)+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors.">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).</li></ol>

وقد ثبت أن قابلية تطبيق البروتينات الفلورية وبساطة الفحص عن طريق تصوير DPP والفحص المجهري للغمر المائي في شبكية العين ناجحان من قبل العديد من المجموعات12. تم استخدام استراتيجيات مماثلة لتلك المعروضة هنا في العديد من الشاشات الجينية للكشف عن العيوب في مستويات التعبير عن رودوبس?...

من خلال توصيل وإزالة البروتينات من وإلى غشاء البلازما ، يتحكم الاتجار بالبروتين الغشائي في الخلايا العصبية في معدات غشاء البلازما مع المستقبلات وكذلك القنوات الأيونية ، ونتيجة لذلك ، ينظم وظيفة الخلايا العصبية. عادة ما يكون لسوء التنظيم أو العيوب في الاتجار بالبروتين آثار ضارة على الخلايا وتؤدي إلى تنكس الخلايا العصبية. في البشر ، قد يسبب هذا الأمراض العصبية التنكسية مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون أو التهاب الشبكية الصباغي1. أصبحت المستقبلات الضوئية في العين المركبة لذبابة الفاكهة الميلانوغاستر نظاما نموذجيا في الجسم الحي لدراسة الاتجار بالبروتين الغشائي2. هذا ليس فقط بسبب التنوع الجيني لذبابة الفاكهة التي تسمح بإجراء فحوصات وراثية فعالة ، ولكن أيضا لأن جميع المكونات الأساسية لغشاء المستقبلات الضوئية الممتص للضوء تتميز بتفصيل كبير وتتوفر تقنيات مجهرية فعالة يمكن تطبيقها على عين الذبابة. هذه التقنيات هي محور هذه المقالة.
في خلايا المستقبلات الضوئية ذبابة الفاكهة ، يشكل غشاء البلازما القمي كومة معبأة بكثافة من الزغابات الدقيقة على طول جانب واحد من الخلية ، تسمى rhabdomere. يتم ترتيب rhabdomeres من خلايا المستقبلات الضوئية R1-6 في نمط شبه منحرف مميز في حين أن خلايا المستقبلات الضوئية R7 و R8 تشكل rhabdomere واحد في وسط هذا شبه المنحرف3. هناك حاجة إلى الاتجار بالبروتين الغشائي من أجل دوران منظم لبروتينات غشاء rhabdomeral مثل رودوبسين و TRP المنشط بالضوء (إمكانات المستقبلات العابرة) وقنوات أيون TRPL (الشبيهة ب TRP) لضمان الكمية المناسبة من بروتينات النقل الضوئي هذه في rhabdomere. يتم تصنيع بروتينات غشاء المستقبلات الضوئية في الشبكة الإندوبلازمية ونقلها عبر جهاز غولجي إلى الرابدومير. بعد تنشيط رودوبسين بواسطة الضوء ، يمكن أن يصبح جزيء رودوبسين إما معطلا عن طريق امتصاص فوتون ثان أو يمكن إزالته من الرابدومير عن طريق داء الخلايا الداخلية بوساطة كلاثرين. رودوبسين إندوسيتوسيد إما أن يتحلل في الليزوسوم أو يعاد تدويره مرة أخرى إلى رابدومير 4,5. يتم استيعاب القناة الأيونية TRPL أيضا بعد تنشيط شلال النقل الضوئي وتخضع لعملية نقل تعتمد على الضوء بين rhabdomere (حيث توجد عندما يتم الاحتفاظ بالذباب في الظلام) وحجرة تخزين غنية ب ER في جسم الخلية (والتي يتم نقلها إليها في غضون عدة ساعات عند الإضاءة)6,7,8,9,10 . على النقيض من رودوبسين endocytosed ، يتم تحلل كميات صغيرة فقط من TRPL عبر المسار الداخلي الصبغي ، ويتم تخزين الغالبية داخل الخلايا بدلا من ذلك وإعادة تدويرها مرة أخرى إلى rhabdomere عند التكيف المظلم6. وبالتالي يمكن استخدام TRPL لتحليل الاتجار ببروتينات غشاء البلازما الناجم عن الضوء. تستخدم خلايا المستقبلات الضوئية ذبابة الفاكهة أيضا لدراسة التنكس العصبي. غالبا ما يتم تحديد تنكس خلايا المستقبلات الضوئية من خلال تقييم بنية rhabdomeres ، والتي تتفكك نتيجة للعمليات التنكسية5.
من أجل دراسة التوطين تحت الخلوي ل TRPL و rhodopsin في خلايا المستقبلات الضوئية أو تنكس خلايا المستقبلات الضوئية ، تم تطبيق طريقتين مجهريتين فلوريتين تختلفان فيما يتعلق بسرعة التحليل والدقة هنا. طريقة سريعة جدا وغير جراحية يمكن استخدامها للشاشات الجينية ولكن بدقة مكانية محدودة هي الكشف عن التألق في التلميذ الكاذب العميق (DPP). DPP هي ظاهرة بصرية للعيون المركبة المفصلية التي تم شرح أصلها الهندسي بالتفصيل من قبل Franceschini و Kirschfeld في 197111. باختصار ، على العديد من المستويات البصرية أسفل تراكب شبكية العين ، يمكن ملاحظة صور الرابدوميرات من ommatidia المجاورة. على المستوى البؤري من خلال مركز انحناء العين ، تشكل هذه الإسقاطات المتراكبة صورة تشبه التخطيط شبه المنحرف للرابدوميرات في أوماتيديوم واحد فقط من الحجم الأكبر. يمكن أيضا ملاحظة هذه الظاهرة بشكل مستقل عن التعبير الخارجي لبروتينات التألق (مثل TRPL::eGFP8) ، والتي مع ذلك تجعل من السهل اكتشاف DPP (الشكل 1A-A'')12. الطريقة الثانية غير الغازية هي الفحص المجهري للغمر المائي الذي يعتمد على تصوير البروتينات الموسومة بالفلورسنت بعد تحييد جهاز العين ثنائي العين بصريا بالماء (الشكل 1B-C'')12. باستخدام طريقة الغمر بالماء ، يمكن تقييم الكمية النسبية من TRPL::eGFP في rhabdomeres أو جسم الخلية كميا لخلايا المستقبلات الضوئية الفردية. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام البروتينات الموسومة بالتألق غير المنقولة لتقييم سلامة rhabdomeral وتحديد المسار الزمني للانحطاط المحتمل بطريقة كمية ، كما هو موضح هنا.
في حين أن تسجيلات DPP هي إلى حد بعيد أسهل وأسرع هذه الطرق في الأداء ، فإن الدقة المكانية للبيانات التي تولدها محدودة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من الأسباب التي تجعل DPP غائبا ، والتي لا يمكن تمييزها بالضرورة عن طريق تصوير DPP نفسه. نظرا لأن DPP يمثل مجموعة من العديد من ommatidia ، يتم فقدان المعلومات حول الخلايا الفردية. وبالتالي ، فإن تصوير DPP منخفض الدقة يؤدي وظيفة مهمة في فحص أعداد كبيرة من الذباب ولكن يجب أن تتبعه عموما تسجيلات عالية الدقة عن طريق الفحص المجهري للغمر بالماء. تسمح الصور المجهرية للغمر المائي بتفسيرات حول الخلايا الفردية أو عيوب النمو أو مورفولوجيا العين أو سوء توطين البروتين أو تنكس الشبكية بالإضافة إلى تحديد كمية هذه الآثار. ويصف هذا البروتوكول هاتين التقنيتين بالتفصيل.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة على الاختلافات المجهرية لعين ذبابة الفاكهة المعروضة في هذا البروتوكول. التمثيلات التخطيطية والرسوم البيانية المجهرية النموذجية للتصوير الفلوري العميق للبؤبؤ الكاذب (DPP) ، (B-B'') المجهر القاتل للغمر المائي للرابدوميرات الفلورية ، و (C-C'') المجهر غير المميت لقطرة الماء من الرابدوميرات الفلورية. شريط المقياس (A''): 100 ميكرومتر. أشرطة المقياس (B''-C''): 10 ميكرومتر. وقد عدل هذا الرقم من المرجع13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 anaesthesia fly pad</td>
			<td>Flystuff</td>
			<td>59-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light lamp (KL 1500 LCD)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) 
			[1750 Lux, Ee470nm = 298 &#181;W cm-2, Ee590nm = 215 &#181;W cm-2] 
			and [760 Lux, Ee470nm = 173 &#181;W cm-2, Ee590nm = 147 &#181;W cm-2]</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300518039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pipette (20-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Object slide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0656.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Labsolute</td>
			<td>7695844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine (Blu-Tack)</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>30811745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope (SMZ445)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins

ينظم الاتجار بالبروتين الغشائي دمج وإزالة المستقبلات والقنوات الأيونية في غشاء البلازما. هذه العملية مهمة بشكل أساسي لوظيفة الخلية وسلامة الخلايا العصبية. أصبحت خلايا المستقبلات الضوئية ذبابة الفاكهة نموذجا لدراسة الاتجار بالبروتين الغشائي. إلى جانب رودوبسين ، الذي يصبح عند الإضاءة مستوعبا من غشاء المستقبلات الضوئية ويتحلل ، فإن القناة الأيونية العابرة الشبيهة بإمكانات المستقبل (TRPL) في ذبابة الفاكهة تظهر انتقالا يعتمد على الضوء بين غشاء المستقبلات الضوئية الرابدوميرال (حيث يقع في الظلام) وجسم خلية المستقبلات الضوئية (التي يتم نقلها إليها عند الإضاءة). يمكن دراسة هذا النقل داخل الخلايا ل TRPL بطريقة بسيطة وغير جراحية عن طريق التعبير عن TRPL الموسوم ب eGFP في خلايا المستقبلات الضوئية. يمكن بعد ذلك ملاحظة تألق eGFP إما في التلميذ الكاذب العميق أو عن طريق الفحص المجهري للغمر المائي. تسمح هذه الطرق بالكشف عن التألق في العين السليمة ، وبالتالي فهي مفيدة للفحوصات عالية الإنتاجية والفحوصات الجينية لطفرات ذبابة الفاكهة المعيبة في نقل TRPL. هنا ، يتم شرح إعداد الذباب ، والتقنيات المجهرية ، وكذلك طرق القياس الكمي المستخدمة لدراسة هذا النقل الناجم عن الضوء من TRPL بالتفصيل. ويمكن تطبيق هذه الأساليب أيضا على دراسات الاتجار على بروتينات المستقبلات الضوئية الأخرى لذبابة الفاكهة ، مثل رودوبسين. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام بروتينات rhabdomeral الموسومة ب eGFP ، يمكن استخدام هذه الطرق لتقييم انحطاط خلايا المستقبلات الضوئية.

ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا الذباب الذي يعبر عن TRPL::eGFP بروتين الانصهار تحت سيطرة المروج رودوبسين 1. في هذه الذباب، يتم التعبير عن TRPL::eGFP في خلايا المستقبلات الضوئية R1-6 من العين المركبة ويعرض توطينا يعتمد على الإضاءة. عندما يتم الاحتفاظ بالذباب في الظلام ، يتم دمج TRPL::eGFP في الرابدوميرا?...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

هنا ، يتم وصف الطرق غير الغازية لتوطين بروتينات غشاء المستقبلات الضوئية وتقييم تنكس الشبكية في العين المركبة ذبابة الفاكهة باستخدام تألق eGFP.

دراسة الاتجار بالبروتين الغشائي في خلايا مستقبلات ذبابة الفاكهة باستخدام البروتينات الموسومة ب eGFP

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

تسمح لنا بروتينات المستقبلات الضوئية الموسومة ب GFP ، مثل القناة الأيونية TRPL GFP ، بدراسة نقل البروتين في الخلايا العصبية باستخدام تقنيات غير جراحية. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لمراقبة انحطاط المستقبلات الضوئية. وبالتالي ، يمكن دراسة الأساس الجزيئي للأمراض الوراثية التي تؤدي إلى العمى لدى البشر في عين ذبابة الفاكهة.يمكن تقييم التوطين الخلوي للبروتينات الموسومة ب GFP من خلال مراقبة التألق في التلميذ الكاذب العميق أو عن طريق الفحص المجهري للغمر بالماء. تسمح كلتا الطريقتين بالتحديد السريع لتوطين البروتينات البصرية ومراقبة العيوب الهيكلية للرابدوميرات بسبب انحطاط خلايا المستقبلات الضوئية. للحصول على صور عالية الجودة ، فإن الجانب الأكثر أهمية هو اتجاه عين الذبابة.أثناء تنفيذ هذه التقنية ، يجب على المرء التركيز على ommatidia الموجودة قليلا نحو محيط العين. سأقوم بعرض إجراء تصوير DPP ، في حين سيتم عرض التقنيتين اللتين تستخدمان الفحص المجهري للغمر بالماء من قبل زميلتي ، الدكتورة كريستينا فاغنر ، وماتياس زيجر ، طالب الدكتوراه في مجموعتنا. لبدء التلميذ الكاذب العميق ، أو DPP ، التصوير ، وتخدير الذباب الذي يتراوح عمره بين يوم واحد وثلاثة أيام ، ووضع أحدهما في وسط هدف المجهر على جانبه بحيث تواجه العين اليسرى أو اليمنى الهدف شعاعيا بدقة.قم بزيادة التكبير ليناسب العين بأكملها ، وتوسيط الأوماتيديا المركزية للعين. إذا كان ذلك ممكنا ، قلل من عمق مجال المجهر عن طريق ضبط الحجاب الحاجز المزدوج القزحية إلى إعداد ضحل. بعد ذلك ، قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية المجهري بأقصى كثافة.بعد ذلك ، حدد مجموعة مرشح التألق للمجهر وفقا لبروتين التألق المعبر عنه في العينين ، واضبط مسار الضوء نحو الكاميرا المثبتة على المجهر. باستخدام ميزة التصوير المباشر داخل البرنامج ، اضبط سطوع الصورة على إعداد يكتشف إشارات محددة فقط من العين عن طريق رفع وقت التعرض واكتساب القيمة. أعد ضبط تركيز المجهر في العين لتوليد الصورة المتراكبة ل DPP.ثم ، التقط لقطة من DPP الفلورسنت. لإعداد ذبابة في شكل قاتل ، قم بلصق قطعة من البلاستيسين على شريحة كائن وقطعة أخرى في وسط طبق بتري. املأ طبق بتري بالماء المقطر المبرد بالثلج وبعض رقائق الثلج.ثم ضع ذبابة واحدة مخدرة بالجليد تحت مجهر ستيريو فوق شريحة الجسم المطلي بالبلاستيسين. أدر الذبابة على ظهرها ، واخترق دبوس حشرة من خلال مركز الصدر. ثبت الدبوس أفقيا على شريحة الجسم المطلي بالبلاستيك ، وقم بتوجيه العين اليسرى أو اليمنى للذبابة لأعلى.بعد ذلك ، قم بإصلاح شريحة الكائن بعناية مع توجيه جانبها الخالي من البلاستيسين لأسفل في طبق Petri ، مما يمنع دوران رأس الذبابة. تأكد من تغطية عين الذبابة بالماء. بدلا من ذلك ، لإعداد ذبابة في شكل غير قاتل ، قم بنقل رأس الذبابة المخدر بالجليد أولا إلى طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، وادفع الذبابة بعناية نحو الطرف بالهواء المضغوط.ثم ، باستخدام مشرط ، اقطع طرف الماصة أمام الرأس مباشرة ، وباستخدام ملاقط ، ادفع الذبابة بعناية بضعة ملليمترات في طرف الماصة. اقطع طرف الماصة مرة أخرى ، وادفع الذبابة مرة أخرى نحو الطرف بالهواء المضغوط بحيث يبرز رأس الذبابة فقط من طرف الماصة. بعد لصق قطعة من البلاستيسين على شريحة كائن ، اضغط على طرف الماصة فيه بحيث تتجه العين اليسرى أو اليمنى إلى الأعلى.تأكد من توجيه العين بشكل صحيح تحت المجهر. للحصول على صورة، حدد هدفا للغمر بالماء. في حالة وجود اختلاف غير قاتل ، استخدم ماصة مختبرية للالتصاق بقطرة كبيرة من الماء المبرد على الجانب السفلي من هدف غمر الماء.ضع شريحة الكائن بعناية مع الذبابة المعدة على مرحلة المجهر. بعد ذلك ، اخفض هدف الغمر بالماء يدويا حتى يلامس سطح الماء أو تلمس عين الذبابة القطرة. ثم قم بتبديل مسار الضوء نحو كاميرا المجهر ، وقم بإنشاء صورة حية.أعد ضبط التركيز البؤري للكاميرا، وقم بتقييم اتجاه العين، مع الأخذ في الاعتبار أن العين يجب أن تواجه هدف المجهر شعاعيا. استخدم برنامج جدول البحث للكشف عن التشبع الزائد. في حالة الذباب غير المصطبغ، اضبط وقت التعرض بحيث تكون ألمع وحدات البكسل أقل بقليل من حد التشبع لكل صورة.قم بتسجيل صورة وحفظها كملف خام لأرشفة جميع البيانات الوصفية المقابلة للتسجيل. ثم قم بتصدير الصورة بتنسيق tif. لتحديد مدى تألق eGFP النسبي في الرابدوميرات الخاصة بالرسوم البيانية المجهرية للغمر بالماء، اضبط إعدادات ImageJ بالنقر فوق تحليل، ثم تعيين القياسات، وحدد فقط مربع القيمة الرمادية المتوسطة.قم باستيراد صورة tif بالنقر فوق ملف، ثم فتح. اختر منطقة تمثيلية للصورة في التركيز البؤري، وقم بتكبيرها إلى 200 إلى 300٪ عن طريق الضغط بشكل متكرر على Control ومعا. بعد ذلك، حدد الأداة البيضاوية، وأثناء الضغط على المفتاح Shift قم بإنشاء تحديد دائري في الصورة أصغر بكثير من رابدومير فلورسنت واحد.بعد ذلك، ابحث عن الحجم الدقيق المعروض أسفل شريط الأدوات في النافذة الرئيسية ImageJ. لقياس شدة التألق داخل التحديد الدائري، حرك الدائرة إلى الرابدومير الأول باستخدام مفاتيح الأسهم على لوحة المفاتيح، وانقر فوق تحليل، ثم قياس. ستظهر نافذة نتيجة تسرد القيمة الرمادية المقاسة.استمر في قياسات الرابدوميرات من اثنين إلى ستة ، وقم أيضا بقياس إشارة الخلفية. في حالة الذباب غير المصطبغ ، قم بإجراء قياسات إضافية لمناطق جسم الخلية المقابلة. قم بقياس تألق اثنين آخرين من الأوماتيديا ، مما يؤدي إلى ثلاث نسخ طبق الأصل تقنية.ضع علامة على ommatidia التي تم تحليلها باستخدام أداة القلم الرصاص، واحفظ هذه الصورة للتوثيق. حدد القيم الرمادية المقاسة وانسخها من نافذة النتائج، والصقها في برنامج جدول البيانات لإجراء مزيد من العمليات الحسابية. فرز قيم كثافة التألق وفقا لأصلها في فئات rhabdomere وجسم الخلية والخلفية ، وحساب متوسط الكثافة من كل فئة.بعد ذلك ، احسب الكمية النسبية من eGFP الموجودة في rhabdomere باستخدام الصيغة الأولى للعيون غير المصطبغة والثانية للعيون المصطبغة. بدلا من ذلك ، لتحديد مورفولوجيا العين عن طريق تألق eGFP في الرسوم البيانية المجهرية للغمر بالماء ، اختر ثلاثة أوماتيديا متجاورة في منطقة تمثيلية للصورة التي هي في بؤرة التركيز. قم بتقييم 18 rhabdomeres من الاختيار بشكل فردي وفقا لكثافة eGFP ، وحدة الحافة ، والتباين فيما يتعلق بإشارة الخلفية المحيطة.وأخيرا، سجل الرابدوميرات المرئية بوضوح بقيمة اثنين، والرابدوميرات المرئية أسبوعيا بقيمة واحد، والرابدوميرات الغائبة بقيمة صفر لتوليد مؤشر انحطاط. في ذباب ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين اندماج eGFP TRPL ، يختفي التألق الرحيدي في الضوء بسبب نقل eGFP TRPL. وهذا يسمح بإجراء فحص جيني لتحديد الطفرات المعيبة في استيعاب eGFP TRPL.في الذباب الضابط، ينتقل eGFP TRPL من الرابدوميرات إلى جسم الخلية بعد 16 ساعة من الإضاءة، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في التألق الرحيدي مقارنة بالحالة المظلمة المتكيفة. الحضانة المظلمة الثانية ترفع التألق الرابدوميرال مرة أخرى نحو القيمة الأولية. ومع ذلك ، في المتحور المعيب لنقل TRPL vps35MH20 ، لا يتغير نمط التألق بشكل كبير بعد 16 ساعة من الإضاءة والتكيف المظلم اللاحق لمدة 24 ساعة.يمكن لطريقة القياس الكمي هذه اكتشاف عيب إعادة تدوير كبير من الناحية الإحصائية. يسمح الذباب ذو العيون البيضاء بالكشف عن إشارات التألق من كل من الرابدومير وجسم الخلية. في المقابل ، في الذباب ذو العيون الحمراء ، لا يمكن اكتشاف إشارات التألق إلا في rhabdomeres ولكن ليس في جسم الخلية.فيما يتعلق بالقياس الكمي لتنكس الشبكية ، يمكن تقييم تألق eGFP TRP على مدار عدة أسابيع. عندما يتم الاحتفاظ به في دورة مظلمة مدتها 12 ساعة و 12 ساعة لمدة أسبوعين ، انخفض مؤشر الانحطاط في الذباب المتحور ولكن ليس في الذباب المسيطر. في هذا البروتوكول ، يحتاج المرء إلى التمييز بين العيون المصطبغة وغير المصطبغة.نظرا لأن التصبغ يؤثر على إشارة الفلورسنت ، فقد تم تحسين الفحص المجهري الكمي للغمر بالماء لكلتا الحالتين بشكل فردي. يعد التصوير DPP والفحص المجهري للغمر بالماء من الطرق عالية الإنتاجية ذات الدقة المحدودة. للتحقيق في التوطين تحت الخلوي ، نوصي بالفحص المجهري المناعي على أقسام الأنسجة.لإجراء تحليل مفصل للأنماط الظاهرية التنكسية ، يمكن إجراء الفحص المجهري الإلكتروني.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

دراسة العدوان في ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

بلورة البروتينات الغشائية لتحديد الهيكل باستخدام Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

بلورة البروتينات في الغشاء Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

الفحص البروتين تراكب الأغشية : بروتوكول لاختبار التفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في المختبر</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

دراسة حاجز الميتوزى بواسطة يوضح الحيوي Kinetochore السلوك البروتين والحركة كروموسوم في المعيشة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الجنين المخلوي

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

الحصاد والبرد تبريد بلورات من بروتينات الغشاء يزرع في Mesophases شحمي لتحديد هيكل للعلم البلورات ضخم الجزيئات

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...