Name: studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

我们要感谢多年来我们的学生研究人员。特别是Nina Meyer，Sibylle Mayer，Juliane Kaim和Laura Jaggy，他们的数据已在该协议中用作代表性结果。我们小组在这里介绍的研究是由德国法院（Hu 839/2-4，Hu 839/7-1）向Armin Huber提供的赠款资助的。

1. 一般注意事项
<ol><li>使用表达永久横纹肌位置荧光蛋白的 果蝇 储备进行形态学分析（例如，TRP：：eGFP，eGFP：：NINAC），并将易位蛋白用于蛋白质运输分析（例如，TRPL：：eGFP，Arr2：：eGFP）。</li>
	<li>预先确定所选苍蝇的光照条件，用于实验方法。<ol>
<li>为了适应黑暗，将苍蝇保存在25°C的暗箱中所需的时间。 对于易位实验中长达16小时的照明（例如，TRPL：：eGFP表达苍蝇?...

<ol>
	<li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration.">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).</li><li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina.">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li><li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila.">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pfl&#252;gers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li><li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration:+lessons+from+the+fly.">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li><li>B&#228;hner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current.">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li><li>Cronin, M. A., Lieu, M. -. H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors.">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li><li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade.">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, 2592-2603 (2006).</li><li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin.">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li><li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum.">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li><li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+ph&#233;nom&#233;nes+de+pseudopupille+dans+l'oeil+compose+de+Drosophila.">Les ph&#233;nom&#233;nes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li><li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia.">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li><li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system.">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li><li>Meyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+light-dependent+translocation+of+the+ion+channel+TRPL+in+the+photoreceptors+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer.+nat.">Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2005).</li><li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., D&#252;rr, T. D., Sch&#228;fer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL.">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li><li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye.">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li><li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability.">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li><li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila.">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).</li><li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila.">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li><li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice.">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li><li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila.">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).</li><li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).</li><li>Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+TRP+ion+channels+in+the+photoreceptor+cells+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer,+nat.">Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2007).</li><li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila.">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li><li>Hardie, R. C., Liu, C. -. H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors.">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li><li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4,5+bisphosphate+(PIP2)+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors.">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).</li></ol>

荧光蛋白的适用性以及通过DPP成像和视网膜水浸显微镜筛选的简单性已被许多组12证明是成功的。与这里介绍的策略类似的策略已被用于几种遗传筛选中，以在Rh1：：eGFP 17，18，19，20，21的帮助下检测视紫红质表达水平，稳态，视网膜组织或细胞完整性的缺陷。...

通过向质膜输送和去除蛋白质，神经元中的膜蛋白运输通过受体和离子通道控制质膜设备，从而调节神经元功能。蛋白质运输中的失调错误或缺陷通常会对细胞产生不利影响，并导致神经元变性。在人类中，这可能导致神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏症和帕金森病或 色素性视网膜炎1。 黑腹果蝇 复眼中的光感受器已成为研究膜蛋白运输的 体内 模型系统2。这不仅是由于 果蝇 的遗传多功能性允许有效的遗传筛选，而且还因为吸收光的光感受器膜的所有基本成分都得到了非常详细的表征，并且可以使用有效的微观技术应用于苍蝇眼。这些技术是本文的重点。
在果蝇光感受器细胞中，顶端质膜沿着细胞的一侧形成密集堆积的微绒毛堆叠，称为横纹肌。光感受器细胞R1-6的横纹肌以特征梯形模式排列，而光感受器细胞R7和R8在该梯形3的中心形成单个横纹肌。膜蛋白运输对于调节横纹肌膜蛋白（如视紫红质）和光激活TRP（瞬时受体电位）和TRPL（TRP样）离子通道的周转是必需的，以确保横纹肌中这些光转导蛋白的适当量。光感受器膜蛋白在内质网中合成，并通过高尔基体运输到横纹肌。在通过光激活视紫红质后，视紫红质分子可以通过吸收第二个光子而失活，或者可以通过克拉氏介导的内吞作用从横纹肌中除去。内吞视紫红质要么在溶酶体中降解，要么被回收回横纹肌4，5。离子通道TRPL在光转导级联激活后也被内化，并在横纹肌（当苍蝇保持在黑暗中时它位于那里）和细胞体内富含ER的储物箱（在照明后数小时内运输到该储物室）之间经历光依赖性易位6，7，8，9，10.与内吞视紫红质相反，只有少量的TRPL通过内溶酶体途径降解，并且大多数在细胞内储存并在黑暗适应时循环回横纹肌6。因此，TRPL可用于分析光触发的质膜蛋白运输。果蝇光感受器细胞也用于研究神经元变性。光感受器细胞变性通常通过评估横纹肌的结构来确定，横纹肌由于退行性过程而分解5。
为了研究TRPL和视紫红质在光感受器细胞或光感受器细胞变性中的亚细胞定位，这里应用了两种在分析速度和分辨率方面不同的荧光显微镜方法。一种非常快速，非侵入性的方法可用于遗传筛选，但空间分辨率有限，是检测深部假性pupil（DPP）中的荧光。DPP是节肢动物复眼的光学现象，其几何起源已被Franceschini和Kirschfeld在1971年详细解释过11。简而言之，在视网膜下方的几个光学平面上，可以观察到来自相邻卵形的横纹肌的叠加图像。在穿过眼睛曲率中心的焦平面上，这些叠加的投影形成一个图像，类似于横纹肌的梯形布局，在单个ommatidium中仅大几个数量级。这种现象也可以独立于荧光蛋白的外源性表达（例如TRPL：：eGFP8）观察到，这使得DPP更容易检测（图1A-A''）12。第二种非侵入性方法是水浸显微镜，该显微镜依赖于用水光学中和眼睛的屈光度装置后对荧光标记的蛋白质进行成像（图1B-C''）12。使用水浸法，可以定量评估单个光感受器细胞在横纹肌或细胞体中TRPL：：eGFP的相对量。此外，非易位荧光标记蛋白可用于评估横纹体完整性并以定量方式确定潜在变性的时间过程，如此处所述。
虽然民进党的记录是迄今为止这些方法中最简单，最快捷的，但它们生成的数据的空间分辨率是有限的。此外，DPP缺席的原因有很多，这些原因不一定可以通过DPP成像本身来识别。由于DPP表示几个ommatidia的总和，因此有关单个细胞的信息丢失。因此，低分辨率DPP成像在筛选大量苍蝇方面起着重要作用，但通常应通过水浸显微镜进行更高分辨率的记录。水浸显微照片可以解释单个细胞，发育缺陷，眼睛形态，蛋白质错位或视网膜变性以及这些效应的量化。该协议详细描述了这两种技术。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> 图1：本方案中介绍的果蝇眼的显微镜变化概述。（A-A''）荧光深假性假单胞菌（DPP）成像，（B-B''）荧光横纹肌的致死水浸显微镜和（C-C''）荧光横纹肌的非致命水滴显微镜的示意图和示例性显微照片。比例尺（A''）：100 μm。比例尺（B''-C''）：10 μm。该图已从参考文献13修改而来。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 anaesthesia fly pad</td>
			<td>Flystuff</td>
			<td>59-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light lamp (KL 1500 LCD)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) 
			[1750 Lux, Ee470nm = 298 &#181;W cm-2, Ee590nm = 215 &#181;W cm-2] 
			and [760 Lux, Ee470nm = 173 &#181;W cm-2, Ee590nm = 147 &#181;W cm-2]</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300518039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pipette (20-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Object slide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0656.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Labsolute</td>
			<td>7695844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine (Blu-Tack)</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>30811745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope (SMZ445)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins

膜蛋白运输调节受体和离子通道在质膜中的掺入和去除。这个过程对于神经元的细胞功能和细胞完整性至关重要。 果蝇 光感受器细胞已成为研究膜蛋白运输的模型。除了视紫红质，其在照明时从光感受器膜内化并降解外， 果蝇 中的瞬时受体电位样（TRPL）离子通道在横纹肌光感受器膜（位于黑暗中）和光感受器细胞体（在照明时被输送到）之间表现出光依赖性易位。TRPL的这种细胞内运输可以通过在光感受器细胞中表达eGFP标记的TRPL，以简单和非侵入性的方式进行研究。然后可以在深假瞰孔中或通过水浸显微镜观察eGFP荧光。这些方法允许在完整的眼睛中检测荧光，因此可用于高通量测定和遗传筛查在TRPL易位中有缺陷的 果蝇 突变体。在这里，详细解释了苍蝇的制备，微观技术以及用于研究TRPL的这种光触发易位的定量方法。这些方法也可用于其他 果蝇 光感受器蛋白的贩运研究，例如视紫红质。此外，通过使用eGFP标记的横纹肌蛋白，这些方法可用于评估光感受器细胞的变性。

在视紫红质1启动子的控制下，已经产生了表达TRPL：：eGFP融合蛋白的转基因 果 蝇。在这些苍蝇中，TRPL：：eGFP在复眼的光感受器细胞R1-6中表达，并显示照明依赖性定位。当苍蝇被保存在黑暗中时，TRPL：：eGFP被纳入外部的横纹肌中。照明数小时后，TRPL易位到细胞体内，将其储存在富含ER的隔室中。8，10 当TRPL：：eGFP位于横纹肌中时，其荧光可以?...

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Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

在这里，描述了非侵入性方法，用于光感受器膜蛋白的定位和使用eGFP荧光评估 果蝇 复眼中的视网膜变性。

使用eGFP标记的蛋白质研究 果蝇 光感受器细胞中的膜蛋白运输

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

GFP标记的光感受器蛋白，如离子通道TRPL GFP，使我们能够使用无创技术研究神经元中的蛋白质转运。该方法也可用于监测光感受器变性。因此，可以在果蝇眼中研究导致人类失明的遗传性疾病的分子基础。GFP标记蛋白的细胞定位可以通过观察深部假腮或水浸显微镜中的荧光来评估。这两种方法都可以快速确定视觉蛋白的定位，并观察由于光感受器细胞变性而导致的横纹肌的结构缺陷。要获得高质量的图像，最重要的方面是苍蝇眼的方向。在执行这种技术时，应该关注位于眼睛周围稍微靠近的卵形。我将演示DPP成像的程序，而使用水浸显微镜的两种技术将由我的同事Krystina Wagner博士和我们小组的博士生Matthias Zeger演示。要开始深部假性苍蝇或DPP成像，麻醉一到三天的苍蝇，并将其中一只置于显微镜物镜中心，使其侧面，以便左眼或右眼精确地径向物镜。增加放大倍率以适合整个眼睛，并将眼睛的中央眼睑居中。如果可能，通过将双光圈振膜调整到浅设置来减小显微镜的景深。接下来，以最大强度打开显微镜紫外灯。然后，根据眼睛中表达的荧光蛋白选择显微镜的荧光滤光片组，并设置朝向显微镜安装的相机的光路。使用软件中的实时成像功能，通过提高曝光时间和增益值，将图像亮度调整为仅检测来自眼睛的特定信号的设置。将显微镜焦点重新调整到眼睛中，以生成DPP的叠加图像。然后，拍摄荧光DPP的快照。为了准备致命变化的苍蝇，将一块橡皮泥粘在物体载玻片上，另一块粘在培养皿的中心。在培养皿中加入冰冷的蒸馏水和一些冰片。然后，将一只冰麻醉的苍蝇放在橡皮泥涂层物体载玻片顶部的体视显微镜下。转动苍蝇的背部，刺穿昆虫针穿过胸部中心。将销钉水平固定在涂有橡皮泥的物体滑块上，并将苍蝇的左眼或右眼向上定向。然后，小心地将物体滑块固定在培养皿中，使其无橡皮泥的一面朝下，防止苍蝇头旋转。确保苍蝇的眼睛被水覆盖。或者，为了准备非致命变化的苍蝇，首先将冰麻醉的苍蝇头转移到200微升的移液器吸头中，然后用压缩空气小心地将苍蝇推向尖端。然后，使用手术刀，切掉头部正前方的移液器尖端，然后用镊子小心地将苍蝇推入移液器尖端几毫米。再次切断移液器吸头，并用压缩空气将苍蝇推回吸头，以便只有苍蝇的头部从移液器吸头突出。将一块橡皮泥粘在物体载玻片上后，将移液器尖端按入其中，使左眼或右眼朝上。确保眼睛在显微镜下方向正确。对于图像采集，请选择水浸物镜。在非致命变异的情况下，使用实验室移液器将一大滴冷冻水粘附到水浸物镜的底面。小心地将装有准备好的苍蝇的物体载玻片放在显微镜载物台上。然后，手动降低水浸物镜，直到它接触到水面或苍蝇的眼睛接触到水滴。然后，将光路切换到显微镜相机，并生成实时图像。重新调整相机的焦点，并评估眼睛的方向，考虑到眼睛必须径向面对显微镜物镜。使用查找表软件检测过饱和。对于无色素的苍蝇，请调整曝光时间，使最亮的像素略低于每个图像的饱和度限制。记录图像，并将其另存为原始文件以存档记录的所有相应元数据。然后，以 tif 格式导出图像。要量化水浸式显微照片的横纹肌中的相对eGFP荧光，请通过单击“分析”和“设置测量值”来调整ImageJ设置，并仅选中“平均灰度值”框。通过单击“文件”导入tif图像，然后单击“打开”。选择图像的代表性区域，并通过反复按下Control并一起将其放大到200%至300%。接下来，选择椭圆形工具，并在按 Shift 键的同时，在图像中生成一个明显小于一个荧光横纹肌的圆形选区。然后，查找 ImageJ 主窗口中工具栏下方显示的确切大小。要测量圆形选区中的荧光强度，请使用键盘上的箭头键将圆圈移动到第一个横纹肌，然后单击“分析”，然后单击“测量”。将弹出一个结果窗口，其中列出了测量的灰度值。继续测量横纹肌二到六，并测量背景信号。在无色素苍蝇的情况下，对相应的细胞体区域进行额外的测量。测量另外两个ommatidia的荧光，从而产生三个技术重复。使用铅笔工具标记分析的 ommatidia，并保存此图像以供文档记录。从结果窗口中选择并复制测量的灰度值，然后将其粘贴到电子表格软件中以进行进一步计算。将荧光强度值根据其来源分类为横纹肌，细胞体和背景类别，并计算每个类别的平均强度。然后，使用第一个公式计算横纹肌中存在的eGFP的相对量，第二个公式用于无色素的眼睛，第二个公式用于有色素的眼睛。或者，为了在水浸显微照片中通过eGFP荧光量化眼睛形态，请在聚焦图像的代表性区域中选择三个相邻的ommatidia。根据其eGFP强度，边缘清晰度以及与周围背景信号的对比度，分别评估所选的18个横纹肌。最后，对清晰可见的横纹肌进行评分，值为2，每周可见的横纹肌值为1，缺失的横纹肌值为零，以生成退化指数。在表达eGFP TRPL融合蛋白的转基因果蝇中，由于eGFP TRPL的易位，横纹体荧光在光照下消失。这允许进行遗传筛选以识别在eGFP TRPL内化中存在缺陷的突变体。在对照蝇中，eGFP TRPL在照明16小时后从横纹肌易位到细胞体内，与黑暗适应状态相比，横纹肌荧光显着降低。第二次暗孵育将横纹体荧光再次提高到初始值。然而，在TRPL易位缺陷突变体vps35MH20中，荧光图案在照明16小时和随后的24小时黑暗适应后不会发生巨大变化。这种量化方法可以检测出具有统计意义的回收缺陷。白眼苍蝇可以检测来自横纹肌和细胞体的荧光信号。相比之下，在红眼苍蝇中，荧光信号只能在横纹肌中检测到，但在细胞体内却不能检测到。关于视网膜变性的定量，可以在几周内评估eGFP TRP荧光。当保持在12小时的光照，12小时的黑暗周期中两周时，突变苍蝇的退化指数下降，但不能控制苍蝇。在这个协议中，需要区分有色和非色素的眼睛。由于色素沉着会影响荧光信号，因此定量水浸显微镜已针对这两种情况进行了单独优化。DPP成像和水浸显微镜是分辨率有限的高通量方法。为了研究亚细胞定位，我们建议在组织切片上进行免疫荧光显微镜检查。为了详细分析退行性表型，可以进行电子显微镜检查。

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

学习在果蝇的侵略（果蝇）

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

科研

生物学

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

无有机溶剂和醋酸，蛋白质与考马斯亮蓝G - 250凝胶染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

使用油脂介孔结构的测定结晶膜蛋白

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

在油脂介孔膜蛋白的结晶

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

蛋白膜覆盖含量：一个协议测试可溶性和不溶性蛋白质之间的相互作用在体外</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

龙虎斗动粒蛋白的动态行为与染色体运动，在生活学习有丝分裂关卡<em&gt;果蝇</em&gt;合胞胚胎

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

使用机器人在油脂中间相高通量膜蛋白的结晶

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

在油脂中间相结构的测定生物大分子晶体生长的膜蛋白晶体收获和低温冷

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

活体显微镜成像的亚细胞结构的活体小鼠表达荧光蛋白

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

番茄/ GFP-FLP / FRT方法马赛克成人的实时成像<em&gt;果蝇</em&gt;感光细胞

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

使用eGFP标记的蛋白质研究 果蝇 光感受器细胞中的膜蛋白运输

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