Name: studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

Vi vil gerne takke vores studenterforskere gennem årene. Især Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim og Laura Jaggy, hvis data er blevet brugt i denne protokol som repræsentative resultater. Forskning fra vores gruppe, der blev præsenteret her, blev finansieret af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) til Armin Huber.

1. Generelle betragtninger
<ol><li>Brug Drosophila-bestande , der udtrykker et permanent rhabdomeralt placeret fluorescensprotein til morfologisk analyse (f.eks. TRP::eGFP, eGFP::NINAC) og translokerende proteiner til analyser vedrørende proteinhandel (f.eks. TRPL::eGFP, Arr2::eGFP).</li>
	<li>Forudbestemme lyseksponeringsbetingelser for udvalgte fluer til den eksperimentelle tilgang.<ol>
<li>For mørk tilpasning skal fluerne opbevares i mørke kasser i den ønskede periode ved 25 °C. Til b...

<ol>
	<li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration.">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).</li><li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina.">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li><li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila.">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pfl&#252;gers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li><li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration:+lessons+from+the+fly.">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li><li>B&#228;hner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current.">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li><li>Cronin, M. A., Lieu, M. -. H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors.">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li><li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade.">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, 2592-2603 (2006).</li><li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin.">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li><li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum.">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li><li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+ph&#233;nom&#233;nes+de+pseudopupille+dans+l'oeil+compose+de+Drosophila.">Les ph&#233;nom&#233;nes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li><li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia.">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li><li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system.">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li><li>Meyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+light-dependent+translocation+of+the+ion+channel+TRPL+in+the+photoreceptors+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer.+nat.">Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2005).</li><li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., D&#252;rr, T. D., Sch&#228;fer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL.">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li><li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye.">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li><li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability.">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li><li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila.">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).</li><li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila.">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li><li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice.">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li><li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila.">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).</li><li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).</li><li>Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+TRP+ion+channels+in+the+photoreceptor+cells+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer,+nat.">Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2007).</li><li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila.">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li><li>Hardie, R. C., Liu, C. -. H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors.">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li><li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4,5+bisphosphate+(PIP2)+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors.">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).</li></ol>

Anvendeligheden af fluorescensproteiner og enkelheden ved screening ved DPP-billeddannelse og retinal vandnedsænkningsmikroskopi har vist sig at være vellykket af mange grupper12. Strategier svarende til dem, der præsenteres her, er blevet brugt i flere genetiske skærme til at detektere defekter i rhodopsinekspressionsniveauer, homeostase, retinal organisation eller cellulær integritet ved hjælp af Rh1::eGFP 17,18,19,20,21.</sup...

Ved at levere og fjerne proteiner til og fra plasmamembranen styrer membranproteinhandel i neuroner plasmamembranudstyret med receptorer såvel som ionkanaler og regulerer som følge heraf neuronal funktion. Misregulering eller defekter i proteinhandel har typisk skadelige virkninger på celler og resulterer i neuronal degeneration. Hos mennesker kan dette forårsage neurodegenerative sygdomme som Alzheimers og Parkinsons sygdom eller Retinitis pigmentosa1. Fotoreceptorer i drosophila melanogasters sammensatte øje er blevet et in vivo-modelsystem til undersøgelse af membranproteinhandel2. Dette skyldes ikke kun Drosophilas genetiske alsidighed, der muliggør effektive genetiske skærme, men også fordi alle væsentlige komponenter i den lysabsorberende fotoreceptormembran er karakteriseret i detaljer, og der findes effektive mikroskopiske teknikker, der kan påføres flueøjet. Disse teknikker er i fokus i denne artikel.
I Drosophila fotoreceptorceller danner den apikale plasmamembran en tæt pakket stak mikrovilli langs den ene side af cellen, nævnt rhabdomere. Rhabdomeres af fotoreceptorceller R1-6 er arrangeret i et karakteristisk trapezformet mønster, mens fotoreceptorcellerne R7 og R8 danner en enkelt rhabdomere i midten af denne trapez3. Membranproteinhandel er nødvendig for en reguleret omsætning af rhabdomerale membranproteiner såsom rhodopsin og de lysaktiverede TRP (forbigående receptorpotentiale) og TRPL (TRP-lignende) ionkanaler for at sikre den korrekte mængde af disse fototransduktionsproteiner i rhabdomere. Fotoreceptormembranproteiner syntetiseres i det endoplasmatiske retikulum og transporteres via Golgi-apparatet til rhabdomere. Efter aktivering af rhodopsin ved lys kan et rhodopsinmolekyle enten blive inaktiveret ved absorption af en anden foton eller kan fjernes fra rhabdomere ved clathrinmedieret endocytose. Endocytosed rhodopsin bliver enten nedbrudt i lysosomet eller genbruges tilbage til rhabdomere 4,5. Ionkanalen TRPL internaliseres også efter aktivering af fototransduktionskaskaden og gennemgår en lysafhængig translokation mellem rhabdomere (hvor den er placeret, når fluer holdes i mørket) og et ER-beriget opbevaringsrum i cellelegemet (hvortil det transporteres inden for flere timer ved belysning)6,7,8,9,10 . I modsætning til endocytoseret rhodopsin nedbrydes kun små mængder TRPL via den endolysosomale vej, og størstedelen opbevares intracellulært i stedet og genbruges tilbage til rhabdomere ved mørk tilpasning6. TRPL kan således bruges til at analysere lysudløst handel med plasmamembranproteiner. Drosophila fotoreceptorceller anvendes også til at studere neuronal degeneration. Fotoreceptorcelledegeneration bestemmes ofte ved at vurdere strukturen af rhabdomeres, som opløses som følge af degenerative processer5.
For at studere den subcellulære lokalisering af TRPL og rhodopsin i fotoreceptorceller eller fotoreceptorcelledegeneration er der anvendt to fluorescensmikroskopimetoder, der adskiller sig med hensyn til analysehastighed og opløsning. En meget hurtig, ikke-invasiv metode, der kan bruges til genetiske skærme, men med en begrænset rumlig opløsning, er påvisning af fluorescens i den dybe pseudopupil (DPP). DPP er et optisk fænomen af leddyr sammensatte øjne, hvis geometriske oprindelse er blevet forklaret detaljeret af Franceschini og Kirschfeld i 197111. Kort sagt, på flere optiske planer under nethinden kan overlay-billeder af rhabdomeres fra tilstødende ommatidia observeres. På et brændplan gennem midten af øjets krumning danner disse overlejrede fremspring et billede, der ligner det trapezformede layout af rhabdomeres i et enkelt ommatidium, kun størrelsesordener større. Dette fænomen kan også observeres uafhængigt af eksogen ekspression af fluorescensproteiner (f.eks. TRPL::eGFP8), hvilket ikke desto mindre gør DPP lettere at detektere (figur 1A-A'')12. En anden ikke-invasiv metode er vandnedsænkningsmikroskopi, der er afhængig af billeddannelse af fluorescerende mærkede proteiner efter optisk neutralisering af øjnenes dioptriske apparat med vand (figur 1B-C'')12. Ved hjælp af vandnedsænkningsmetoden kan den relative mængde TRPL::eGFP i rhabdomeres eller cellelegemet vurderes kvantitativt for individuelle fotoreceptorceller. Desuden kan ikke-translokerende fluorescensmærkede proteiner anvendes til at evaluere rhabdomeral integritet og til at bestemme tidsforløbet for en potentiel degeneration på en kvantitativ måde, som beskrevet her.
Mens optagelser af DPP er langt den nemmeste og hurtigste af disse metoder at udføre, er den rumlige opløsning af data, de genererer, begrænset. Derudover er der mange grunde til, at en DPP kan være fraværende, som ikke nødvendigvis kan ses af DPP-billeddannelse selv. Da DPP repræsenterer en summation af flere ommatidia, går information om individuelle celler tabt. DPP-billeddannelse med lav opløsning tjener således en vigtig funktion ved screening af et stort antal fluer, men bør generelt efterfølges af optagelser med højere opløsning ved hjælp af vandnedsænkningsmikroskopi. Vandnedsænkningsmikrografer tillader fortolkninger om individuelle celler, udviklingsdefekter, øjenmorfologi, proteinfejllokalisering eller retinal degeneration samt kvantificering af disse effekter. Denne protokol beskriver disse to teknikker i detaljer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> Figur 1: Oversigt over mikroskopivariationer for Drosophila-øjet, der præsenteres i denne protokol. Skematiske repræsentationer og eksemplariske mikrografer af (A-A'') fluorescerende dyb pseudopupil (DPP) billeddannelse, (B-B'') dødelig vandnedsænkningsmikroskopi af fluorescerende rhabdomere og (C-C'') ikke-dødelig vanddråbemikroskopi af fluorescerende rhabdomere. Skalabjælke (A''): 100 μm. Vægtstænger (B''-C''): 10 μm. Figuren er ændret i forhold til reference13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 anaesthesia fly pad</td>
			<td>Flystuff</td>
			<td>59-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light lamp (KL 1500 LCD)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) 
			[1750 Lux, Ee470nm = 298 &#181;W cm-2, Ee590nm = 215 &#181;W cm-2] 
			and [760 Lux, Ee470nm = 173 &#181;W cm-2, Ee590nm = 147 &#181;W cm-2]</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300518039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pipette (20-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Object slide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0656.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Labsolute</td>
			<td>7695844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine (Blu-Tack)</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>30811745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope (SMZ445)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins

Membranproteinhandel regulerer inkorporeringen og fjernelsen af receptorer og ionkanaler i plasmamembranen. Denne proces er grundlæggende vigtig for neuronernes cellefunktion og celleintegritet. Drosophila fotoreceptorceller er blevet en model til at studere membranproteinhandel. Udover rhodopsin, som ved belysning bliver internaliseret fra fotoreceptormembranen og nedbrydes, udviser den forbigående receptorpotentialelignende (TRPL) ionkanal i Drosophila en lysafhængig translokation mellem den rhabdomerale fotoreceptormembran (hvor den er placeret i mørket) og fotoreceptorcellelegemet (som det transporteres til ved belysning). Denne intracellulære transport af TRPL kan studeres på en enkel og ikke-invasiv måde ved at udtrykke eGFP-mærket TRPL i fotoreceptorceller. eGFP-fluorescensen kan derefter observeres enten i den dybe pseudopupil eller ved vandnedsænkningsmikroskopi. Disse metoder gør det muligt at detektere fluorescens i det intakte øje og er derfor nyttige til assays med høj gennemstrømning og genetiske skærme for Drosophila-mutanter , der er defekte i TRPL-translokation. Her forklares forberedelsen af fluer, de mikroskopiske teknikker samt kvantificeringsmetoder, der anvendes til at studere denne lysudløste translokation af TRPL, detaljeret. Disse metoder kan også anvendes til trafficking undersøgelser på andre Drosophila fotoreceptor proteiner, for eksempel rhodopsin. Derudover kan disse metoder ved hjælp af eGFP-mærkede rhabdomerale proteiner bruges til at vurdere degenereringen af fotoreceptorceller.

Transgene Drosophila fluer, der udtrykker et TRPL: : eGFP fusionsprotein under kontrol af rhodopsin 1 promotoren er blevet genereret. I disse fluer udtrykkes TRPL::eGFP i fotoreceptorceller R1-6 i det sammensatte øje og viser en belysningsafhængig lokalisering. Når fluer holdes i mørke, er TRPL::eGFP inkorporeret i de ydre rhabdomeres. Efter belysning i flere timer translokerer TRPL ind i cellelegemet, hvor det opbevares i et ER-beriget rum. 8,10 Nå...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Her beskrives ikke-invasive metoder til lokalisering af fotoreceptormembranproteiner og vurdering af retinal degeneration i Drosophila-forbindelsens øje ved anvendelse af eGFP-fluorescens.

Undersøgelse af membranproteinhandel i drosophila-fotoreceptorceller ved hjælp af eGFP-mærkede proteiner

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

GFP-mærkede fotoreceptorproteiner, som ionkanalen TRPL GFP, giver os mulighed for at studere proteintransport i neuroner ved hjælp af ikke-invasive teknikker. Denne metode kan også bruges til at overvåge fotoreceptordegeneration. Således kan det molekylære grundlag for arvelige sygdomme, der resulterer i blindhed hos mennesker, studeres i Drosophila-øjet.Cellulær lokalisering af GFP-mærkede proteiner kan vurderes ved at observere fluorescensen i den dybe pseudopupil eller ved vandnedsænkningsmikroskopi. Begge metoder tillader hurtig bestemmelse af lokalisering af visuelle proteiner og observation af strukturelle defekter af rhabdomeres på grund af degenerering af fotoreceptorceller. For at opnå billeder af høj kvalitet er det vigtigste aspekt orienteringen af flueøjet.Mens man udfører denne teknik, bør man fokusere på ommatidia placeret lidt mod øjets periferi. Jeg vil demonstrere proceduren for DPP-billeddannelse, mens de to teknikker, der bruger vandnedsænkningsmikroskopi, vil blive demonstreret af min kollega, Dr. Krystina Wagner, og Matthias Zeger, en ph.d.-studerende i vores gruppe. For at begynde dyb pseudopupil eller DPP-billeddannelse skal du bedøve en til tre dage gamle fluer og placere en af dem i midten af mikroskopmålet på sin side, så enten venstre eller højre øje vender mod målet nøjagtigt radialt.Forøg forstørrelsen, så den passer til hele øjet, og centrer øjets centrale ommatidia. Hvis det er muligt, reducer mikroskopets dybdeskarphed ved at justere dobbelt-irismembranen til en lav indstilling. Tænd derefter mikroskopet UV-lampe ved maksimal intensitet.Vælg derefter mikroskopets fluorescensfiltersæt i henhold til fluorescensproteinet udtrykt i øjnene, og indstil lysstien mod det mikroskopmonterede kamera. Brug live imaging-funktionen i softwaren til at justere billedets lysstyrke til en indstilling, der kun registrerer specifikke signaler fra øjet ved at hæve eksponeringstiden og gevinstværdien. Justering af mikroskopfokus i øjet for at generere det overlejrede billede af DPP.Tag derefter et øjebliksbillede af den fluorescerende DPP. For at forberede en flue i en dødelig variation skal du klæbe et stykke plasticin på et objektglide og et andet stykke ind i midten af en petriskål. Fyld petriskålen med iskølet destilleret vand og nogle isflager.Sæt derefter en isanæstetiseret flue under et stereomikroskop oven på det plasticinbelagte objektdias. Drej fluen på ryggen, og gennembor en insektstift gennem midten af brystkassen. Fastgør stiften vandret på det plasticinbelagte objektglide, og orienter enten venstre eller højre øje på fluen opad.Fastgør derefter forsigtigt objektglideren med den plasticinfrie side nedad i petriskålen, hvilket forhindrer rotation af fluehovedet. Sørg for, at flueøjet er dækket af vand. Alternativt, for at forberede en flue i en ikke-dødelig variation, skal du først overføre det isanæstetiserede fluehoved til en 200 mikroliter pipettespids og forsigtigt skubbe fluen mod spidsen med trykluft.Brug derefter en skalpel til at afskære pipettespidsen lige foran hovedet, og brug en pincet til forsigtigt at skubbe fluen et par millimeter ind i pipettespidsen. Skær pipettespidsen af igen, og skub fluen tilbage mod spidsen med trykluften, så kun fluens hoved stikker ud fra pipettespidsen. Når du har klæbet et stykke plasticin på et objektglide, skal du trykke pipettespidsen ind i den, så venstre eller højre øje vender opad.Sørg for, at øjet er orienteret korrekt under mikroskopet. Til billedoptagelse skal du vælge et mål for nedsænkning af vand. I tilfælde af en ikke-dødelig variation skal du bruge en laboratoriepipette til at klæbe en stor dråbe kølet vand til undersiden af vandnedsænkningsmålet.Placer forsigtigt objektglideren med den forberedte flue på mikroskopstadiet. Sænk derefter vandnedsænkningsmålet manuelt, indtil det kommer i kontakt med vandoverfladen, eller fluens øje rører dråben. Skift derefter lysstien mod mikroskopkameraet, og generer et levende billede.Juster fokus for kameraet, og vurder øjets orientering, i betragtning af at øjet skal vende mod mikroskopets mål radialt. Brug opslagstabelsoftwaren til at registrere overmætning. I tilfælde af ikke-pigmenterede fluer skal du justere eksponeringstiden, så de lyseste pixels er lige under mætningsgrænsen for hvert billede.Optag et billede, og gem det som en raw-fil for at arkivere alle tilsvarende metadata for optagelsen. Eksporter derefter billedet i et tif-format. For at kvantificere relativ eGFP-fluorescens i rhabdomeres af vandnedsænkningsmikrografer skal du justere ImageJ-indstillinger ved at klikke på Analysér, derefter Indstil målinger og kun markere afkrydsningsfeltet for Gennemsnitlig grå værdi.Importer tif-billedet ved at klikke på Filer og derefter Åbn. Vælg et repræsentativt område af billedet i fokus, og forstør det til 200 til 300 % ved gentagne gange at trykke på Kontrol og sammen. Vælg derefter det ovale værktøj, og mens du trykker på Shift-tasten, genererer du et cirkulært valg i billedet, der er betydeligt mindre end en fluorescerende rhabdomere.Se derefter efter den nøjagtige størrelse, der vises under værktøjslinjen i ImageJ-hovedvinduet. Hvis du vil måle fluorescensintensiteterne i det cirkulære valg, skal du flytte cirklen til den første rhabdomere med piletasterne på tastaturet og klikke på Analysér og derefter på Mål. Et resultatvindue, der viser den målte grå værdi, vises.Fortsæt med målinger af rhabdomeres to til seks, og mål også baggrundssignalet. I tilfælde af ikke-pigmenterede fluer skal der foretages yderligere målinger af de tilsvarende cellelegemeområder. Mål fluorescensen af yderligere to ommatidia, hvilket resulterer i tre tekniske replikater.Marker den analyserede ommatidia ved hjælp af blyantværktøjet, og gem dette billede til dokumentation. Vælg og kopier de målte grå værdier fra resultatvinduet, og indsæt dem i regnearkssoftwaren for yderligere beregninger. Sorter fluorescensintensitetsværdierne efter deres oprindelse i kategorierne rhabdomere, cellelegeme og baggrund, og beregn gennemsnitsintensiteten fra hver kategori.Beregn derefter den relative mængde eGFP, der er til stede i rhabdomere, ved hjælp af den første formel for ikke-pigmenterede øjne og den anden for pigmenterede øjne. Alternativt, for at kvantificere øjenmorfologi ved hjælp af eGFP-fluorescens i vandnedsænkningsmikrografer, skal du vælge tre tilstødende ommatidia i et repræsentativt område af billedet, der er i fokus. Evaluer de 18 rhabdomeres af udvælgelsen individuelt i henhold til deres eGFP-intensitet, kantskarphed og kontrast i forhold til det omgivende baggrundssignal.Endelig scores de tydeligt synlige rhabdomeres med en værdi på to, ugentlige synlige rhabdomeres med en værdi på en og fraværende rhabdomeres med en værdi på nul for at generere et degenerationsindeks. I transgene Drosophila fluer, der udtrykker et eGFP TRPL fusionsprotein, forsvinder rhabdomeral fluorescens i lys på grund af translokation af eGFP TRPL. Dette gør det muligt at udføre en genetisk skærm for at identificere mutanter, der er defekte i internaliseringen af eGFP TRPL.I kontrolfluer translokerer eGFP TRPL ud af rhabdomeres ind i cellelegemet efter 16 timers belysning, hvilket resulterer i et signifikant fald i rhabdomeral fluorescens sammenlignet med den mørketilpassede tilstand. Den anden mørke inkubation hæver den rhabdomerale fluorescens igen mod den oprindelige værdi. I TRPL-translokationsdefekte mutant vps35MH20 ændres fluorescensmønsteret imidlertid ikke drastisk efter 16 timers belysning og en efterfølgende mørk tilpasning i 24 timer.Denne kvantificeringsmetode kan påvise en statistisk meget signifikant genvindingsfejl. Hvidøjede fluer tillader påvisning af fluorescenssignaler fra både rhabdomere og cellelegeme. I modsætning hertil kan fluorescenssignaler i rødøjede fluer kun påvises i rhabdomeres, men ikke i cellelegemet.Med hensyn til kvantificering af retinal degeneration kan eGFP TRP fluorescens vurderes i løbet af flere uger. Når de blev holdt i en 12-timers lys, 12-timers mørk cyklus i to uger, faldt degenerationsindekset i mutante fluer, men ikke i kontrolfluer. I denne protokol skal man skelne mellem pigmenterede og ikke-pigmenterede øjne.Da pigmentering påvirker det fluorescerende signal, er kvantitativ vandnedsænkningsmikroskopi optimeret til begge tilfælde individuelt. DPP-billeddannelse og vandnedsænkningsmikroskopi er metoder med høj gennemstrømning med begrænset opløsning. For at undersøge subcellulær lokalisering anbefaler vi immunofluorescensmikroskopi på vævssektioner.For en detaljeret analyse af degenerative fænotyper kan elektronmikroskopi udføres.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studere Mitotisk Checkpoint ved at illustrere Dynamic Kinetochore Protein Adfærd og kromosom Motion i levende<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial Embryoner

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Anvendelse af en robot til Højkapacitetsforskning Krystallisation af membranproteiner i Lipidiske mesofaser

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Høst og Cryo-køling Krystaller af membranproteiner dyrket i Lipidiske mesofaser for Structure Bestemmelse ved makromolekylær krystallografi

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital mikroskopi af Imaging Subcellulære Strukturer Live mus, der udtrykker fluorescerende proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Tomat / GFP-FLP / FRT Metode til Live Imaging af Mosaic Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; fotoreceptorceller

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...