Name: studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

We willen onze student-onderzoekers door de jaren heen bedanken. In het bijzonder Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim en Laura Jaggy, wiens gegevens in dit protocol zijn gebruikt als representatieve resultaten. Het hier gepresenteerde onderzoek van onze groep werd gefinancierd door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) aan Armin Huber.

1. Algemene overwegingen
<ol><li>Gebruik Drosophila-aandelen die een permanent rhabdomeraal gelegen fluorescentie-eiwit tot expressie brengen voor morfologische analyse (bijv. TRP::eGFP, eGFP::NINAC) en translocerende eiwitten voor analyses met betrekking tot eiwithandel (bijv. TRPL::eGFP, Arr2::eGFP).</li>
	<li>Bepaal vooraf de lichtblootstellingsomstandigheden van geselecteerde vliegen voor de experimentele aanpak.<ol>
<li>Voor donkere aanpassing, bewaar de vliegen in donkere dozen gedurende...

<ol>
	<li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration.">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).</li><li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina.">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li><li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila.">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pfl&#252;gers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li><li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration:+lessons+from+the+fly.">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li><li>B&#228;hner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current.">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li><li>Cronin, M. A., Lieu, M. -. H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors.">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li><li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade.">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, 2592-2603 (2006).</li><li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin.">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li><li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum.">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li><li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+ph&#233;nom&#233;nes+de+pseudopupille+dans+l'oeil+compose+de+Drosophila.">Les ph&#233;nom&#233;nes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li><li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia.">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li><li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system.">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li><li>Meyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+light-dependent+translocation+of+the+ion+channel+TRPL+in+the+photoreceptors+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer.+nat.">Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2005).</li><li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., D&#252;rr, T. D., Sch&#228;fer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL.">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li><li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye.">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li><li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability.">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li><li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila.">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).</li><li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila.">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li><li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice.">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li><li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila.">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).</li><li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).</li><li>Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+TRP+ion+channels+in+the+photoreceptor+cells+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer,+nat.">Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2007).</li><li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila.">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li><li>Hardie, R. C., Liu, C. -. H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors.">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li><li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4,5+bisphosphate+(PIP2)+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors.">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).</li></ol>

De toepasbaarheid van fluorescentie-eiwitten en de eenvoud van screening door DPP-beeldvorming en retinale waterdompelingsmicroscopie is door veel groepen12 succesvol gebleken. Strategieën vergelijkbaar met de hier gepresenteerde zijn gebruikt in verschillende genetische schermen om defecten in rhodopsine-expressieniveaus, homeostase, retinale organisatie of cellulaire integriteit te detecteren met behulp van Rh1: : eGFP17, 18,...

Door eiwitten van en naar het plasmamembraan te leveren en te verwijderen, regelt membraaneiwithandel in neuronen de plasmamembraanapparatuur met receptoren en ionkanalen en reguleert als gevolg daarvan de neuronale functie. Misregulatie of defecten in eiwithandel hebben meestal schadelijke effecten op cellen en resulteren in neuronale degeneratie. Bij mensen kan dit neurodegeneratieve ziekten veroorzaken, zoals de ziekte van Alzheimer en Parkinson of Retinitis pigmentosa1. Fotoreceptoren in het samengestelde oog van Drosophila melanogaster zijn een in vivo modelsysteem geworden voor het bestuderen van membraaneiwithandel2. Dit komt niet alleen door de genetische veelzijdigheid van Drosophila die effectieve genetische screenings mogelijk maakt, maar ook omdat alle essentiële componenten van het lichtabsorberende fotoreceptormembraan tot in detail worden gekenmerkt en efficiënte microscopische technieken beschikbaar zijn die op het vliegenoog kunnen worden toegepast. Deze technieken staan centraal in dit artikel.
In Drosophila-fotoreceptorcellen vormt het apicale plasmamembraan een dicht opeengepakte stapel microvilli langs één kant van de cel, rhabdomere genaamd. De rhabdomeres van fotoreceptorcellen R1-6 zijn gerangschikt in een karakteristiek trapeziumvormig patroon, terwijl fotoreceptorcellen R7 en R8 een enkel rhabdomere vormen in het midden van dit trapezium3. Membraaneiwithandel is nodig voor een gereguleerde omzet van rabdomerale membraaneiwitten zoals rhodopsine en de lichtgeactiveerde TRP (transient receptor potential) en TRPL (TRP-achtige) ionkanalen om de juiste hoeveelheid van deze fototransductie-eiwitten in het rabdomere te garanderen. Fotoreceptormembraaneiwitten worden gesynthetiseerd in het endoplasmatisch reticulum en via het Golgi-apparaat naar het rabdomere getransporteerd. Na activering van rhodopsine door licht kan een rhodopsinemolecuul worden geïnactiveerd door absorptie van een tweede foton of kan het uit het rabdomere worden verwijderd door clathrin-gemedieerde endocytose. Endocytosed rhodopsine wordt ofwel afgebroken in het lysosoom of wordt gerecycled naar het rhabdomere 4,5. Het ionkanaal TRPL wordt ook geïnternaliseerd na activering van de fototransductiecascade en ondergaat een lichtafhankelijke translocatie tussen het rhabdomere (waar het zich bevindt wanneer vliegen in het donker worden gehouden) en een ER-verrijkt opslagcompartiment in het cellichaam (waarnaar het binnen enkele uren na verlichting wordt getransporteerd)6,7,8,9,10 . In tegenstelling tot endocytosed rhodopsine worden slechts kleine hoeveelheden TRPL afgebroken via de endolysosomale route, en de meerderheid wordt in plaats daarvan intracellulair opgeslagen en gerecycled naar het rhabdomere bij donkere aanpassing6. TRPL kan dus worden gebruikt voor het analyseren van door licht veroorzaakte handel in plasmamembraaneiwitten. Drosophila fotoreceptorcellen worden ook gebruikt voor het bestuderen van neuronale degeneratie. Fotoreceptorceldegeneratie wordt vaak bepaald door de structuur van rhabdomeres te beoordelen, die desintegreren als gevolg van degeneratieve processen5.
Om de subcellulaire lokalisatie van TRPL en rhodopsine in fotoreceptorcellen of fotoreceptorceldegeneratie te bestuderen, zijn hier twee fluorescentiemicroscopiemethoden toegepast die verschillen met betrekking tot analysesnelheid en resolutie. Een zeer snelle, niet-invasieve methode die kan worden gebruikt voor genetische screening, maar met een beperkte ruimtelijke resolutie, is de detectie van fluorescentie in de diepe pseudopupil (DPP). De DPP is een optisch fenomeen van geleedpotige samengestelde ogen waarvan de geometrische oorsprong in detail is verklaard door Franceschini en Kirschfeld in 197111. Kortom, op verschillende optische vlakken onder de retina-overlay-beelden van rhabdomeres van aangrenzende ommatidia kunnen worden waargenomen. Op een brandpuntsvlak door het midden van de kromming van het oog vormen deze gesuperponeerde projecties een beeld dat lijkt op de trapeziumvormige lay-out van rhabdomeres in een enkel ommatidium dat slechts ordes van grootte groter is. Dit fenomeen kan ook onafhankelijk van exogene expressie van fluorescentie-eiwitten worden waargenomen (bijv. TRPL::eGFP8), die de DPP niettemin gemakkelijker te detecteren maken (figuur 1A-A'')12. Een tweede niet-invasieve methode is wateronderdompelingsmicroscopie die afhankelijk is van beeldvorming van fluorescerend gelabelde eiwitten na het optisch neutraliseren van het dioptrische apparaat van de ogen met water (figuur 1B-C'')12. Met behulp van de onderdompelingsmethode in water kan de relatieve hoeveelheid TRPL::eGFP in het rabdomes of cellichaam kwantitatief worden beoordeeld voor individuele fotoreceptorcellen. Bovendien kunnen niet-translocerende fluorescentie-gelabelde eiwitten worden gebruikt om de integriteit van rhabdomerale te evalueren en om het tijdsverloop van een potentiële degeneratie op een kwantitatieve manier te bepalen, zoals hier beschreven.
Hoewel opnames van de DPP verreweg de gemakkelijkste en snelste van deze methoden zijn om uit te voeren, is de ruimtelijke resolutie van gegevens die ze genereren beperkt. Bovendien zijn er tal van redenen waarom een DPP afwezig kan zijn, die niet noodzakelijkerwijs waarneembaar zijn door DPP-beeldvorming zelf. Omdat de DPP een optelsom van verschillende ommatidia vertegenwoordigt, gaat informatie over individuele cellen verloren. DPP-beeldvorming met lage resolutie heeft dus een belangrijke functie bij het screenen van grote aantallen vliegen, maar moet over het algemeen worden gevolgd door opnames met een hogere resolutie door middel van wateronderdompelingsmicroscopie. Water immersie micrografen maken interpretaties mogelijk over individuele cellen, ontwikkelingsstoornissen, oogmorfologie, eiwitmislokalisatie of retinale degeneratie, evenals kwantificering van deze effecten. Dit protocol beschrijft deze twee technieken in detail.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> Figuur 1: Overzicht van microscopievariaties voor het Drosophila-oog gepresenteerd in dit protocol. Schematische representaties en voorbeeldige micrografieën van (A-A'') fluorescerende diepe pseudopupil (DPP) beeldvorming, (B-B'') letale waterdompelmicroscopie van fluorescerende rabdomeres en (C-C'') niet-dodelijke waterdruppelmicroscopie van fluorescerende rhabdomeres. Schaalbalk (A''): 100 μm. Schaalstaven (B''-C''): 10 μm. Het cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 anaesthesia fly pad</td>
			<td>Flystuff</td>
			<td>59-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light lamp (KL 1500 LCD)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) 
			[1750 Lux, Ee470nm = 298 &#181;W cm-2, Ee590nm = 215 &#181;W cm-2] 
			and [760 Lux, Ee470nm = 173 &#181;W cm-2, Ee590nm = 147 &#181;W cm-2]</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300518039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pipette (20-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Object slide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0656.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Labsolute</td>
			<td>7695844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine (Blu-Tack)</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>30811745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope (SMZ445)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins

Membraaneiwithandel reguleert de opname en verwijdering van receptoren en ionkanalen in het plasmamembraan. Dit proces is van fundamenteel belang voor de celfunctie en celintegriteit van neuronen. Drosophila fotoreceptorcellen zijn een model geworden voor het bestuderen van membraaneiwithandel. Naast rhodopsine, dat bij verlichting wordt geïnternaliseerd uit het fotoreceptormembraan en wordt afgebroken, vertoont het transient receptor potential-like (TRPL) ionkanaal in Drosophila een lichtafhankelijke translocatie tussen het rhabdomerale fotoreceptormembraan (waar het zich in het donker bevindt) en het fotoreceptorcellichaam (waarnaar het wordt getransporteerd bij verlichting). Dit intracellulaire transport van TRPL kan op een eenvoudige en niet-invasieve manier worden bestudeerd door eGFP-gelabelde TRPL in fotoreceptorcellen tot expressie te brengen. De eGFP-fluorescentie kan dan worden waargenomen in de diepe pseudopupil of door waterdompelingsmicroscopie. Deze methoden maken detectie van fluorescentie in het intacte oog mogelijk en zijn daarom nuttig voor high-throughput assays en genetische screenings voor Drosophila-mutanten die defect zijn in TRPL-translocatie. Hier worden de voorbereiding van vliegen, de microscopische technieken en kwantificeringsmethoden die worden gebruikt om deze door licht veroorzaakte translocatie van TRPL te bestuderen, in detail uitgelegd. Deze methoden kunnen ook worden toegepast voor mensenhandelstudies op andere Drosophila-fotoreceptoreiwitten, bijvoorbeeld rhodopsine. Bovendien kunnen deze methoden, door gebruik te maken van eGFP-gelabelde rabdomerale eiwitten, worden gebruikt om de degeneratie van fotoreceptorcellen te beoordelen.

Transgene Drosophila-vliegen die een TRPL::eGFP-fusie-eiwit tot expressie brengen onder controle van de rhodopsine 1-promotor zijn gegenereerd. In deze vliegen wordt TRPL::eGFP uitgedrukt in fotoreceptorcellen R1-6 van het samengestelde oog en geeft een verlichtingsafhankelijke lokalisatie weer. Wanneer vliegen in het donker worden gehouden, wordt TRPL::eGFP opgenomen in de buitenste rhabdomeres. Na enkele uren verlichting verplaatst TRPL zich naar het cellichaam waar het wordt opgeslagen in een ER-verrijkt comp...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Hier worden niet-invasieve methoden beschreven voor de lokalisatie van fotoreceptormembraaneiwitten en de beoordeling van retinale degeneratie in het drosophila samengestelde oog met behulp van eGFP-fluorescentie.

Onderzoek naar membraaneiwithandel in drosophila-fotoreceptorcellen met behulp van eGFP-gelabelde eiwitten

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

GFP-gelabelde fotoreceptoreiwitten, zoals het ionkanaal TRPL GFP, stellen ons in staat om eiwittransport in neuronen te bestuderen met behulp van niet-invasieve technieken. Deze methode kan ook worden gebruikt om fotoreceptordegeneratie te controleren. Zo kan de moleculaire basis van erfelijke ziekten die leiden tot blindheid bij mensen worden bestudeerd in het Drosophila-oog.Cellulaire lokalisatie van GFP-gelabelde eiwitten kan worden beoordeeld door de fluorescentie in de diepe pseudopupil te observeren of door water-onderdompelingsmicroscopie. Beide methoden maken een snelle bepaling van de lokalisatie van visuele eiwitten mogelijk en het observeren van structurele defecten van rhabdomeres als gevolg van de degeneratie van fotoreceptorcellen. Om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen, is het belangrijkste aspect de oriëntatie van het vliegenoog.Tijdens het uitvoeren van deze techniek moet men zich concentreren op ommatidia die zich iets naar de periferie van het oog bevindt. Ik zal de procedure van DPP-beeldvorming demonstreren, terwijl de twee technieken met behulp van water-onderdompelingsmicroscopie zullen worden gedemonstreerd door mijn collega, Dr. Krystina Wagner, en Matthias Zeger, een promovendus in onze groep. Om te beginnen met diepe pseudopupil, of DPP, beeldvorming, verdoven een tot drie dagen oude vliegen, en plaats een van hen in het midden van het microscoopobjectief op zijn kant, zodat het linker- of rechteroog precies radiaal naar het doel is gericht.Verhoog de vergroting om in het hele oog te passen en centreer de centrale ommatidia van het oog. Verklein indien mogelijk de scherptediepte van de microscoop door het dubbele irismembraan aan te passen aan een ondiepe stand. Schakel vervolgens de microscoop UV-lamp op maximale intensiteit in.Selecteer vervolgens de fluorescentiefilterset van de microscoop op basis van het fluorescentie-eiwit dat in de ogen wordt uitgedrukt en stel het lichtpad in naar de op de microscoop gemonteerde camera. Met behulp van de live imaging-functie in de software past u de helderheid van het beeld aan op een instelling die alleen specifieke signalen van het oog detecteert door de belichtingstijd te verhogen en waarde te winnen. Pas de microscoopfocus in het oog aan om het gesuperponeerde beeld van de DPP te genereren.Maak vervolgens een momentopname van de fluorescerende DPP. Om een vlieg in een dodelijke variant te bereiden, plak je een stuk Plasticine op een objectglijbaan en een ander stuk in het midden van een petrischaal. Vul de petrischaal met ijsgekoeld gedestilleerd water en wat ijsvlokken.Leg vervolgens een met ijs verdoofde vlieg onder een stereomicroscoop bovenop de plasticine-gecoate objectglijbaan. Draai de vlieg op zijn rug en prik een insectenpen door het midden van de thorax. Bevestig de pin horizontaal op de objectdia met plasticinecoating en oriënteer het linker- of rechteroog van de vlieg naar boven.Bevestig vervolgens de objectschuif voorzichtig met de Plasticine-vrije kant naar beneden gericht in de petrischaal, waardoor rotatie van de vliegenkop wordt voorkomen. Zorg ervoor dat het vliegenoog bedekt is met water. Als alternatief, om een vlieg in een niet-dodelijke variatie te bereiden, breng de ijsverdoofde vliegkop eerst over in een pipetpunt van 200 microliter en duw de vlieg voorzichtig naar de punt met perslucht.Snijd vervolgens met een scalpel de pipetpunt vlak voor het hoofd af en duw de vlieg met een pincet voorzichtig een paar millimeter in de pipetpunt. Snijd de pipetpunt opnieuw af en duw de vlieg met de perslucht terug naar de punt, zodat alleen de kop van de vlieg uit de pipetpunt steekt. Nadat u een stuk plasticine op een objectdia hebt bevestigd, drukt u de pipetpunt erin zodat het linker- of rechteroog naar boven is gericht.Zorg ervoor dat het oog correct onder de microscoop is georiënteerd. Voor beeldacquisitie selecteert u een doelstelling voor onderdompeling in water. Gebruik in het geval van een niet-dodelijke variant een laboratoriumpipet om een grote druppel gekoeld water aan de onderkant van het waterdompelingsdoel te hechten.Plaats de objectdia met de voorbereide vlieg voorzichtig op het microscooppodium. Laat vervolgens het water-onderdompelingsdoel handmatig zakken totdat het contact maakt met het wateroppervlak of het oog van de vlieg de druppel raakt. Schakel vervolgens het lichtpad naar de microscoopcamera en genereer een live beeld.Pas de focus voor de camera aan en evalueer de oriëntatie van het oog, aangezien het oog radiaal naar het microscoopobjectief moet kijken. Gebruik de opzoektabelsoftware om oververzadiging te detecteren. In het geval van niet-gepigmenteerde vliegen, pas je de belichtingstijd zo aan dat de helderste pixels voor elke afbeelding net onder de verzadigingslimiet liggen.Neem een afbeelding op en sla deze op als een RAW-bestand om alle bijbehorende metagegevens van de opname te archiveren. Exporteer vervolgens de afbeelding in een tif-indeling. Om relatieve eGFP-fluorescentie in de rhabdomeres van water-onderdompelingsmicrografen te kwantificeren, past u de ImageJ-instellingen aan door op Analyseren en vervolgens Op metingen instellen te klikken en alleen het vakje voor Gemiddelde grijswaarde aan te vinken.Importeer de tif-afbeelding door op Bestand en vervolgens op Openen te klikken. Kies een representatief gebied van de afbeelding in focus en vergroot deze tot 200 tot 300% door herhaaldelijk op Control en samen te drukken. Selecteer vervolgens het gereedschap Ovaal en terwijl u op de Shift-toets drukt, genereert u een cirkelvormige selectie in de afbeelding die aanzienlijk kleiner is dan één fluorescerend rhabdomere.Zoek vervolgens naar de exacte grootte die wordt weergegeven onder de werkbalk in het hoofdvenster van ImageJ. Als u de fluorescentie-intensiteiten binnen de cirkelvormige selectie wilt meten, verplaatst u de cirkel naar het eerste rhabdomere met de pijltoetsen op het toetsenbord en klikt u op Analyseren en vervolgens op Meten. Er verschijnt een resultatenvenster met de gemeten grijswaarde.Ga verder met metingen van rhabdomeres twee tot zes, en meet ook het achtergrondsignaal. In het geval van niet-gepigmenteerde vliegen, voer aanvullende metingen uit van de overeenkomstige cellichaamsgebieden. Meet de fluorescentie van nog twee ommatidia, wat resulteert in drie technische replicaties.Markeer de geanalyseerde ommatidia met behulp van het gereedschap Potlood en sla deze afbeelding op voor documentatie. Selecteer en kopieer de gemeten grijswaarden uit het resultaatvenster en plak ze in spreadsheetsoftware voor verdere berekeningen. Sorteer de fluorescentie-intensiteitswaarden op basis van hun oorsprong in de categorieën rhabdomere, cellichaam en achtergrond en bereken de gemiddelde intensiteit van elke categorie.Bereken vervolgens de relatieve hoeveelheid eGFP die aanwezig is in het rhabdomere met behulp van de eerste formule voor niet-gepigmenteerde ogen en de tweede voor gepigmenteerde ogen. Als alternatief, om de oogmorfologie te kwantificeren door eGFP-fluorescentie in water-onderdompelingsmicrografen, kiest u drie aangrenzende ommatidia in een representatief gebied van het beeld dat scherp is. Evalueer de 18 rhabdomeres van de selectie afzonderlijk op basis van hun eGFP-intensiteit, randscherpte en contrast ten opzichte van het omringende achtergrondsignaal.Scoor ten slotte de duidelijk zichtbare rhabdomeres met een waarde van twee, wekelijks zichtbare rhabdomeres met een waarde van één en afwezige rhabdomeres met een waarde van nul om een degeneratie-index te genereren. Bij transgene Drosophila-vliegen die een eGFP TRPL-fusie-eiwit tot expressie brengen, verdwijnt rabdomerale fluorescentie in het licht als gevolg van translocatie van de eGFP TRPL. Dit maakt het mogelijk om een genetische screening uit te voeren om mutanten te identificeren die defect zijn in de internalisatie van de eGFP TRPL.In controlevliegen transloceert eGFP TRPL na 16 uur verlichting uit de rhabdomeres naar het cellichaam, wat resulteert in een significante afname van rabdomerale fluorescentie in vergelijking met de donker-aangepaste toestand. De tweede donkere incubatie verhoogt de rabdomerale fluorescentie weer naar de beginwaarde. In de TRPL-translocatie defecte mutant vps35MH20 verandert het fluorescentiepatroon echter niet drastisch na 16 uur verlichting en een daaropvolgende donkere aanpassing gedurende 24 uur.Deze kwantificeringsmethode kan een statistisch zeer significant recyclingdefect detecteren. Witogige vliegen maken de detectie van fluorescentiesignalen van zowel rhabdomere als cellichaam mogelijk. Bij roodogige vliegen daarentegen zijn fluorescentiesignalen alleen detecteerbaar in rhabdomeres, maar niet in het cellichaam.Met betrekking tot de kwantificering van retinale degeneratie kan eGFP TRP-fluorescentie in de loop van enkele weken worden beoordeeld. Wanneer de degeneratie-index gedurende twee weken in een 12-uur durende lichte, 12-uurs donkere cyclus werd gehouden, daalde de degeneratie-index in gemuteerde vliegen, maar niet in controlevliegen. In dit protocol moet men onderscheid maken tussen gepigmenteerde en niet-gepigmenteerde ogen.Omdat pigmentatie het fluorescerende signaal beïnvloedt, is kwantitatieve waterdompelmicroscopie voor beide gevallen afzonderlijk geoptimaliseerd. DPP-beeldvorming en water-immersiemicroscopie zijn methoden met een hoge doorvoer en een beperkte resolutie. Om subcellulaire lokalisatie te onderzoeken, raden we immunofluorescentiemicroscopie op weefselsecties aan.Voor een gedetailleerde analyse van degeneratieve fenotypen kan elektronenmicroscopie worden uitgevoerd.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Studeren Agressie in Drosophila (fruitvliegjes)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytieel Embryo&#39;s

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Gebruik van een robot voor High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Oogst en Cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten Grown in lipide mesofasen voor structuurbepaling door Macromoleculaire Kristallografie

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

De Tomaat / GFP-FLP / FRT Methode voor Live Imaging van Mozaïek Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptorcellen

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...