Name: studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

ברצוננו להודות לחוקרים הסטודנטים שלנו לאורך השנים. בפרט, נינה מאייר, סיביל מאייר, ג'וליאן קאים ולורה ג'אגי, שנתוניהם שימשו בפרוטוקול זה כתוצאות מייצגות. המחקר של הקבוצה שלנו שהוצגה כאן מומן על ידי מענקים מ- Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) לארמין הובר.

1. שיקולים כלליים
<ol><li>השתמש במניות Drosophila המבטאות חלבון פלואורסצנטי הממוקם באופן קבוע במיקום רבדומרלי לניתוח מורפולוגי (לדוגמה, TRP::eGFP, eGFP::NINAC) וטרנסלוקציה של חלבונים לניתוחים בנוגע לסחר בחלבונים (לדוגמה, TRPL::eGFP, Arr2::eGFP).</li>
	<li>קבעו מראש תנאי חשיפה לאור של זבובים נבחרים לצורך הג?...

<ol>
	<li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration.">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).</li><li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina.">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li><li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila.">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pfl&#252;gers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li><li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration:+lessons+from+the+fly.">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li><li>B&#228;hner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current.">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li><li>Cronin, M. A., Lieu, M. -. H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors.">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li><li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade.">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, 2592-2603 (2006).</li><li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin.">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li><li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum.">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li><li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+ph&#233;nom&#233;nes+de+pseudopupille+dans+l'oeil+compose+de+Drosophila.">Les ph&#233;nom&#233;nes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li><li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia.">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li><li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system.">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li><li>Meyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+light-dependent+translocation+of+the+ion+channel+TRPL+in+the+photoreceptors+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer.+nat.">Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2005).</li><li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., D&#252;rr, T. D., Sch&#228;fer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL.">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li><li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye.">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li><li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability.">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li><li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila.">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).</li><li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila.">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li><li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice.">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li><li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila.">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).</li><li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).</li><li>Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+TRP+ion+channels+in+the+photoreceptor+cells+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer,+nat.">Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2007).</li><li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila.">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li><li>Hardie, R. C., Liu, C. -. H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors.">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li><li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4,5+bisphosphate+(PIP2)+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors.">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).</li></ol>

הישימות של חלבונים פלואורסצנטיים ופשטות ההקרנה על ידי הדמיית DPP ומיקרוסקופיה של טבילת מים ברשתית הוכחו כמוצלחות על ידי קבוצות רבות12. אסטרטגיות דומות לאלה שהוצגו כאן שימשו במספר בדיקות גנטיות כדי לזהות פגמים ברמות ביטוי רודופסין, הומאוסטזיס, ארגון רשתית או שלמות תאית בעזרת Rh1...

על ידי אספקה והסרה של חלבונים אל קרום הפלזמה וממנו, סחר בחלבון ממברנה בתאי עצב שולט בציוד קרום הפלזמה באמצעות קולטנים כמו גם תעלות יונים, וכתוצאה מכך מווסת את תפקוד העצבים. לרגולציה שגויה או פגמים בסחר בחלבונים יש בדרך כלל השפעות מזיקות על התאים וגורמות לניוון עצבי. בבני אדם, זה עלול לגרום למחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת אלצהיימר ופרקינסון או רטיניטיס פיגמנטוזה1. פוטורצפטורים בעין המורכבת של Drosophila melanogaster הפכו למערכת מודל in vivo לחקר סחר בחלבון ממברנה2. זה לא רק בגלל הרבגוניות הגנטית של Drosophila המאפשרת מסכים גנטיים יעילים, אלא גם משום שכל המרכיבים החיוניים של קרום הפוטורצפטור סופג האור מאופיינים בפירוט רב וטכניקות מיקרוסקופיות יעילות זמינות שניתן ליישם על עין הזבוב. טכניקות אלה הן המוקד של מאמר זה.
בתאי דרוזופילה פוטורצפטורים, קרום הפלזמה האפית יוצר ערימה צפופה של מיקרוווילי לאורך צד אחד של התא, המכונה rhabdomere. הרבדומרים של תאי הפוטורצפטור R1-6 מסודרים בתבנית טרפזית אופיינית בעוד שתאי הפוטורצפטור R7 ו-R8 יוצרים רבדומר יחיד במרכז הטרפז3. יש צורך בסחר בחלבוני ממברנה לצורך תחלופה מוסדרת של חלבוני ממברנה רבדומרליים כגון רודופסין וה-TRP המופעל באור (פוטנציאל קולטן חולף) ותעלות יונים TRPL (דמויות TRP) כדי להבטיח את הכמות הנכונה של חלבוני פוטו-טרנסדוקציה אלה ברבדומר. חלבוני קרום פוטורצפטור מסונתזים ברשתית האנדופלסמית ומועברים דרך מנגנון גולג'י לרבדומר. לאחר הפעלת רודופסין על ידי אור, מולקולת רודופסין יכולה להיות מושתקת על ידי ספיגה של פוטון שני או להיות מוסרת מהרבדומר על ידי אנדוציטוזה בתיווך קלתרין. רודופסין אנדוציטוסי מתפרק בליזוזום או ממוחזר בחזרה לרבדומר 4,5. תעלת היונים TRPL מופנמת גם לאחר הפעלת מפל הפוטו-טרנסדוקציה ועוברת טרנסלוקציה תלוית אור בין הרבדומאר (שם הוא ממוקם כאשר זבובים מוחזקים בחושך) לבין תא אחסון מועשר ב-ER בגוף התא (שאליו הוא מועבר תוך מספר שעות עם ההארה)6,7,8,9,10 . בניגוד לרודופסין אנדוציטוסיטוס, רק כמויות קטנות של TRPL מתפרקות דרך המסלול האנדוליזוזומלי, והרוב מאוחסן במקום זאת תוך-תאי וממוחזר בחזרה לרהבדומר עם הסתגלות כהה6. לפיכך, TRPL יכול לשמש לניתוח סחר המופעל על ידי אור של חלבוני ממברנת פלזמה. תאים פוטורצפטורים של דרוזופילה משמשים גם לחקר ניוון עצבי. ניוון תאי פוטורצפטור נקבע לעתים קרובות על ידי הערכת המבנה של rhabdomeres, אשר מתפרקים כתוצאה מתהליכים ניווניים5.
על מנת לחקור את הלוקליזציה התת-תאית של TRPL ורודופסין בתאי פוטורצפטור או בניוון תאי פוטורצפטור, יושמו כאן שתי שיטות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות הנבדלות זו מזו ביחס למהירות הניתוח ולרזולוציה. שיטה מהירה מאוד, לא פולשנית, שיכולה לשמש למסכים גנטיים אך עם רזולוציה מרחבית מוגבלת היא זיהוי של פלואורסצנציה בפסאודו-פופיל עמוק (DPP). ה- DPP הוא תופעה אופטית של עיניים מורכבות פרוקי רגליים שמקורן הגיאומטרי הוסבר בפירוט על ידי פרנצ'סקיני וקירשפלד בשנת 197111. בקיצור, בכמה מישורים אופטיים מתחת לכיסוי הרשתית ניתן לראות תמונות-על של rhabdomeres מאומטידיה סמוכה. במישור מוקד דרך מרכז עקמומיות העין, הקרנות על-גביות אלה יוצרות תמונה המזכירה את הפריסה הטרפזית של הרבדומרים באומטידיום יחיד רק בסדרי גודל גדולים יותר. תופעה זו יכולה גם להיות נצפית ללא תלות בביטוי אקסוגני של חלבונים פלואורסצנטיים (למשל TRPL::eGFP8), אשר בכל זאת הופכים את ה-DPP לקל יותר לזיהוי (איור 1A-A'')12. שיטה לא פולשנית שנייה היא מיקרוסקופיית טבילה במים המסתמכת על הדמיה של חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי לאחר נטרול אופטי של המנגנון הדיופטרי של העיניים באמצעות מים (איור 1B-C'')12. באמצעות שיטת טבילת המים, ניתן להעריך באופן כמותי את הכמות היחסית של TRPL::eGFP ברבדומרים או בגוף התא עבור תאים פוטורצפטורים בודדים. יתר על כן, ניתן להשתמש בחלבונים שאינם מתויגים בפלואורסצנציה כדי להעריך את שלמות הרבדומרל ולקבוע את מהלך הזמן של התנוונות פוטנציאלית באופן כמותי, כפי שמתואר כאן.
בעוד שהקלטות של ה-DPP הן ללא ספק הקלות והמהירות ביותר מבין השיטות הללו לביצוע, הרזולוציה המרחבית של הנתונים שהן מייצרות מוגבלת. בנוסף, ישנן סיבות רבות מדוע DPP עשוי להיות נעדר, אשר אינם בהכרח ניתן להבחין על ידי הדמיית DPP עצמה. מכיוון שה- DPP מייצג סיכום של מספר אומטידיה, מידע על תאים בודדים הולך לאיבוד. לפיכך, הדמיית DPP ברזולוציה נמוכה משרתת תפקיד חשוב בסינון מספר רב של זבובים, אך בדרך כלל יש לעקוב אחריה הקלטות ברזולוציה גבוהה יותר בדרך של מיקרוסקופיה של טבילה במים. מיקרוגרפים של טבילה במים מאפשרים פרשנויות על תאים בודדים, פגמים התפתחותיים, מורפולוגיה של העיניים, אי-סלוקליזציה של חלבונים או ניוון רשתית, כמו גם כימות של השפעות אלה. פרוטוקול זה מתאר את שתי הטכניקות הללו בפירוט.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> איור 1: סקירה כללית של וריאציות מיקרוסקופיה עבור עין הדרוזופילה המוצגות בפרוטוקול זה. ייצוגים סכמטיים ומיקרוגרפים למופת של הדמיית פסאודו-פופיל עמוק (DPP) פלואורסצנטית (A-A''), מיקרוסקופיית טבילת מים קטלנית (B-B'') של רבדומרים פלואורסצנטיים, ו-(C-C'') מיקרוסקופיית טיפת מים לא קטלנית של רהבדומרים פלואורסצנטיים. סרגל קנה מידה (A''): 100 מיקרומטר. סרגלי קנה מידה (B''-C''): 10 מיקרומטר. הנתון שונה מהפניה13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 anaesthesia fly pad</td>
			<td>Flystuff</td>
			<td>59-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light lamp (KL 1500 LCD)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) 
			[1750 Lux, Ee470nm = 298 &#181;W cm-2, Ee590nm = 215 &#181;W cm-2] 
			and [760 Lux, Ee470nm = 173 &#181;W cm-2, Ee590nm = 147 &#181;W cm-2]</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300518039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pipette (20-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Object slide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0656.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Labsolute</td>
			<td>7695844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine (Blu-Tack)</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>30811745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope (SMZ445)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins

סחר בחלבון ממברנה מווסת את השילוב וההסרה של קולטנים ותעלות יונים בקרום הפלזמה. תהליך זה חשוב ביסודו לתפקוד התא ולשלמות התאים של תאי העצב. תאי דרוזופילה פוטורצפטורים הפכו למודל לחקר סחר בחלבון ממברנה. מלבד רודופסין, אשר עם ההארה מופנם מממברנת הפוטורצפטור ומתפרק, תעלת היונים דמוית פוטנציאל הקולטן הארעי (TRPL) בדרוזופילה מציגה טרנסלוקציה תלוית אור בין קרום הפוטורצפטור הרבדומרלי (שם הוא ממוקם בחושך) לבין גוף התא הפוטורצפטור (שאליו הוא מועבר עם ההארה). ניתן לחקור את ההובלה התוך-תאית הזו של TRPL בצורה פשוטה ולא פולשנית על ידי ביטוי TRPL המתויג על ידי eGFP בתאים פוטורצפטורים. לאחר מכן ניתן לראות את הפלואורסצנציה eGFP בפסאודו-פופיל העמוק או על ידי מיקרוסקופיה של טבילת מים. שיטות אלה מאפשרות זיהוי של פלואורסצנציה בעין שלמה ולכן הן שימושיות לבדיקות בתפוקה גבוהה ולמסכים גנטיים עבור מוטציות דרוזופילה הפגומות בטרנסלוקציה של TRPL. כאן, הכנת זבובים, הטכניקות המיקרוסקופיות, כמו גם שיטות כימות המשמשות לחקר טרנסלוקציה המופעלת על ידי אור זה של TRPL מוסברים בפירוט. שיטות אלה יכולות להיות מיושמות גם עבור מחקרי סחר בבני אדם על חלבונים אחרים של Drosophila photoreceptor, למשל, רודופסין. בנוסף, על ידי שימוש בחלבונים rhabdomeral המתויגים על ידי eGFP, ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי להעריך את התנוונותם של תאים פוטורצפטורים.

נוצרו זבובי דרוזופילה מהונדסים המבטאים חלבון היתוך TRPL::eGFP בשליטת מקדם רודופסין 1. בזבובים אלה, TRPL::eGFP מתבטא בתאי פוטורצפטור R1-6 של העין המורכבת ומציג לוקליזציה תלוית תאורה. כאשר זבובים נשמרים בחושך, TRPL::eGFP משולב ברבדומרים החיצוניים. לאחר ההארה במשך מספר שעות, TRPL מבצע טרנסלוקציה לתוך גוף ...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

כאן מתוארות שיטות לא פולשניות ללוקליזציה של חלבוני קרום פוטורצפטור ולהערכת ניוון הרשתית בעין המורכבת דרוזופילה באמצעות פלואורסצנציה eGFP.

חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי דרוזופילה פוטורצפטור באמצעות חלבונים המתויגים על ידי eGFP

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

חלבונים פוטורצפטורים המתויגים על ידי GFP, כמו ערוץ היונים TRPL GFP, מאפשרים לנו לחקור הובלת חלבונים בתאי עצב באמצעות טכניקות לא פולשניות. שיטה זו יכולה לשמש גם לניטור ניוון פוטורצפטורים. לפיכך, ניתן לחקור את הבסיס המולקולרי של מחלות תורשתיות הגורמות לעיוורון בבני אדם בעין דרוזופילה.ניתן להעריך לוקליזציה תאית של חלבונים המתויגים ב-GFP על-ידי התבוננות בפלואורסצנציה בפסאודו-פופיל העמוק או על-ידי מיקרוסקופיה של טבילה במים. שתי השיטות מאפשרות קביעה מהירה של לוקליזציה של חלבונים חזותיים והתבוננות בפגמים מבניים של rhabdomeres עקב התנוונות של תאים פוטורצפטורים. כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה, ההיבט החשוב ביותר הוא הכיוון של עין הזבוב.בעת ביצוע טכניקה זו, יש להתמקד באומטידיה הממוקמת מעט לכיוון פריפריית העין. אני אדגים את הפרוצדורה של הדמיית DPP, בעוד ששתי הטכניקות המשתמשות במיקרוסקופיה של טבילה במים יודגמו על ידי עמיתתי, ד"ר קריסטינה וגנר, ומתיאס זגר, דוקטורנט בקבוצה שלנו. כדי להתחיל פסאודו-פופיל עמוק, או DPP, הדמיה, להרדים זבובים בני יום עד שלושה ימים, ולמקם אחד מהם במרכז מטרת המיקרוסקופ בצדו, כך שעין שמאל או ימין תעמוד מול המטרה באופן רדיאלי בדיוק.הגדל את ההגדלה כך שתתאים לעין כולה, ומרכז את האומטידיה המרכזית של העין. במידת האפשר, הקטינו את עומק השדה של המיקרוסקופ על ידי התאמת הסרעפת בעלת הקשתית הכפולה לסביבה רדודה. לאחר מכן, הפעל את מנורת ה- UV של המיקרוסקופ בעוצמה מרבית.לאחר מכן, בחר את סט המסנן הפלואורסצנטי של המיקרוסקופ בהתאם לחלבון הפלואורסצנטי המבוטא בעיניים, והגדר את נתיב האור לעבר המצלמה המותקנת במיקרוסקופ. באמצעות תכונת ההדמיה החיה בתוך התוכנה, התאם את בהירות התמונה להגדרה המזהה רק אותות ספציפיים מהעין על ידי העלאת זמן החשיפה וצבר ערך. התאימו מחדש את המיקוד של המיקרוסקופ לעין כדי ליצור את התמונה העל-גבית של ה-DPP.לאחר מכן, צלם תמונה של ה- DPP הפלואורסצנטי. כדי להכין זבוב בווריאציה קטלנית, הדביקו חתיכת פלסטלינה על שקופית אובייקט וחתיכה נוספת למרכז צלחת פטרי. מלאו את צלחת הפטרי במים מזוקקים מקוררים בקרח ובכמה פתיתי קרח.לאחר מכן, שים זבוב אחד מורדם קרח מתחת למיקרוסקופ סטריאו על גבי שקופית האובייקט המצופה פלסטלינה. סובבו את הזבוב על גבו, ונקבו סיכת חרקים דרך מרכז בית החזה. קבעו את הסיכה אופקית בשקופית האובייקט המצופה פלסטלינה, וכיוונו את העין השמאלית או הימנית של הזבוב כלפי מעלה.לאחר מכן, קבעו בזהירות את החלקת האובייקט עם הצד נטול הפלסטלינה שלו הפונה כלפי מטה בצלחת פטרי, ובכך מנעו סיבוב של ראש הזבוב. ודא שעין הזבוב מכוסה במים. לחלופין, כדי להכין זבוב בווריאציה לא קטלנית, העבירו תחילה את ראש הזבוב המורדם בקרח לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, ודחפו בזהירות את הזבוב לכיוון הקצה עם אוויר דחוס.לאחר מכן, באמצעות אזמל, חתכו את קצה הפיפטה ממש מול הראש, ובאמצעות פינצטה דוחפים בזהירות את הזבוב כמה מילימטרים לתוך קצה הפיפטה. חותכים שוב את קצה הפיפטה, ודוחפים את הזבוב בחזרה לכיוון הקצה עם האוויר הדחוס כך שרק ראש הזבוב בולט מקצה הפיפטה. לאחר הדבקת חתיכת פלסטיקין על שקופית אובייקט, לחץ את קצה הפיפטה לתוכה כך שעין שמאל או ימין פונה כלפי מעלה.ודא שהעין מכוונת כראוי מתחת למיקרוסקופ. לרכישת תמונה, בחר מטרה לטבילה במים. במקרה של וריאציה לא קטלנית, השתמש בפיפטה של מעבדה כדי להדביק טיפה גדולה של מים צוננים לחלק התחתון של מטרת טבילת המים.מקם בזהירות את שקופית האובייקט עם הזבוב המוכן על במת המיקרוסקופ. לאחר מכן, הנמיכו את מטרת טבילת המים באופן ידני עד שהיא תיצור קשר עם פני המים או שעינו של הזבוב תיגע בטיפה. לאחר מכן, החלף את נתיב האור לכיוון מצלמת המיקרוסקופ, וצור תמונה חיה.התאימו מחדש את המיקוד למצלמה, והעריכו את כיוון העין, בהתחשב בכך שהעין חייבת להתמודד עם מטרת המיקרוסקופ באופן רדיאלי. השתמש בתוכנת טבלת בדיקת המידע כדי לזהות פיזור יתר. במקרה של זבובים ללא פיגמנט, התאם את זמן החשיפה כך שהפיקסלים הבהירים ביותר יהיו ממש מתחת לגבול הרוויה עבור כל תמונה.הקלט תמונה ושמור אותה כקובץ גולמי כדי לאחסן בארכיון את כל המטא-נתונים המתאימים של ההקלטה. לאחר מכן, ייצא את התמונה בפורמט tif. כדי לכמת פלואורסצנציה יחסית של eGFP ברבדומרים של מיקרוגרפים של טבילת מים, התאם את הגדרות ImageJ על-ידי לחיצה על נתח, לאחר מכן הגדר מדידות, וסמן רק את התיבה עבור ערך אפור ממוצע.ייבא את תמונת ה- tif על-ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן פתח. בחר אזור מייצג של התמונה במיקוד, והגדל אותה ל- 200 עד 300% על-ידי הקשה חוזרת ונשנית על Control ויחד. לאחר מכן, בחר את הכלי סגלגל, ותוך כדי לחיצה על מקש Shift צור בחירה מעגלית בתמונה שהיא קטנה משמעותית מרבדומר פלואורסצנטי אחד.לאחר מכן, חפש את הגודל המדויק המוצג מתחת לסרגל הכלים בחלון הראשי של ImageJ. כדי למדוד את עוצמות הפלואורסצנציה בתוך הסלקציה המעגלית, הזז את המעגל ל-rhabdomere הראשון עם מקשי החצים במקלדת, ולחץ על נתח ולאחר מכן מדוד. חלון תוצאה המפרט את הערך האפור שנמדד יופיע.המשך עם מדידות של rhabdomeres שניים עד שישה, וגם למדוד את אות הרקע. במקרה של זבובים ללא פיגמנט, בצע מדידות נוספות של אזורי גוף התא המתאימים. מדוד את הפלואורסצנציה של שני אומטידיה נוספים, וכתוצאה מכך שלושה שכפולים טכניים.סמן את האומטידיה המנותחת באמצעות הכלי עיפרון ושמור תמונה זו לתיעוד. בחר והעתק את הערכים האפורים שנמדדו מחלון התוצאה והדבק אותם בתוכנת גיליון אלקטרוני לצורך חישובים נוספים. מיין את ערכי עוצמת הפלואורסצנציה לפי מקורם לקטגוריות rhabdomere, גוף התא והרקע, וחשב את העוצמה הממוצעת מכל קטגוריה.לאחר מכן, חשב את הכמות היחסית של eGFP הקיימת ברבדומר באמצעות הנוסחה הראשונה עבור עיניים ללא פיגמנט והשנייה עבור עיניים פיגמנטיות. לחלופין, כדי לכמת את המורפולוגיה של העין על ידי פלואורסצנציה eGFP במיקרוגרפים של טבילת מים, בחר שלושה אומטידיה סמוכים באזור מייצג של התמונה שנמצאת בפוקוס. הערך את 18 ה-rhabdomeres של הבחירה בנפרד על פי עוצמת ה-eGFP, חדות הקצוות והניגודיות שלהם ביחס לאות הרקע שמסביב.לבסוף, תן ציון ל-rhabdomeres הגלויים בבירור עם ערך של שני rhabdomeres הנראים לעין שבועיים עם ערך של אחד, ו-rhabdomeres נעדרים עם ערך של אפס כדי ליצור מדד ניוון. בזבובי דרוזופילה מהונדסים המבטאים חלבון היתוך EGFP TRPL, פלואורסצנציה רבדומרלית נעלמת באור עקב טרנסלוקציה של eGFP TRPL. זה מאפשר ביצוע בדיקה גנטית כדי לזהות מוטנטים פגומים בהפנמה של eGFP TRPL.בזבובי בקרה, eGFP TRPL עובר טרנסלוקציה מתוך הרבדומרים לתוך גוף התא לאחר 16 שעות של תאורה, וכתוצאה מכך נוצרת ירידה משמעותית בפלואורסצנציה הרבדומרלית בהשוואה למצב המותאם לחושך. הדגירה הכהה השנייה מעלה שוב את הפלואורסצנציה הרבדומרלית לעבר הערך ההתחלתי. עם זאת, בטרנסלוקציה TRPL מוטציה פגומה vps35MH20, תבנית הפלואורסצנציה אינה משתנה באופן דרסטי לאחר 16 שעות של תאורה והסתגלות חשוכה לאחר מכן במשך 24 שעות.שיטת כימות זו יכולה לזהות פגם במיחזור מובהק ביותר מבחינה סטטיסטית. זבובים בעלי עיניים לבנות מאפשרים זיהוי של אותות פלואורסצנטיים הן מהרבדומרים והן מגוף התא. לעומת זאת, בזבובים אדומי עיניים, אותות פלואורסצנטיים ניתנים לזיהוי רק ברבדומרים אך לא בגוף התא.לגבי הכימות של ניוון הרשתית, ניתן להעריך את הפלואורסצנציה eGFP TRP במשך מספר שבועות. כאשר הוחזקו במחזור אור של 12 שעות ו-12 שעות חשוך במשך שבועיים, מדד הניוון ירד בזבובים מוטנטיים אך לא בזבובי בקרה. בפרוטוקול זה, יש להבחין בין עיניים פיגמנטיות ללא פיגמנטיות.מאחר שפיגמנטציה משפיעה על האות הפלואורסצנטי, מיקרוסקופיה כמותית של טבילת מים עברה אופטימיזציה לשני המקרים בנפרד. הדמיית DPP ומיקרוסקופיה של טבילה במים הן שיטות בתפוקה גבוהה עם רזולוציה מוגבלת. כדי לחקור לוקליזציה תת-תאית, אנו ממליצים על מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית על חלקי רקמות.לניתוח מפורט של פנוטיפים ניווניים, ניתן לבצע מיקרוסקופיית אלקטרונים.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

לימוד תוקפנות תסיסנית (זבובי פירות)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...