Name: studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00
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हम वर्षों से हमारे छात्र शोधकर्ताओं को धन्यवाद देना चाहते हैं। विशेष रूप से, नीना मेयर, सिबिले मेयर, जूलियन कैम और लौरा जग्गी, जिनके डेटा का उपयोग इस प्रोटोकॉल में प्रतिनिधि परिणामों के रूप में किया गया है। यहां प्रस्तुत हमारे समूह के अनुसंधान को डॉयचे Forschungsgemeinschaft (हू 839/2-4, हू 839/7-1) से आर्मिन ह्यूबर को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

1. सामान्य विचार
<ol><li>रूपात्मक विश्लेषण के लिए एक स्थायी रूप से स्थित प्रतिदीप्ति प्रोटीन को व्यक्त करने वाले ड्रोसोफिला स्टॉक का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, टीआरपी: ईजीएफपी, ईजीएफपी: : एनआईएनएए?...

<ol>
	<li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration.">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).</li><li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina.">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li><li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila.">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pfl&#252;gers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li><li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration:+lessons+from+the+fly.">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li><li>B&#228;hner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current.">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li><li>Cronin, M. A., Lieu, M. -. H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors.">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li><li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade.">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, 2592-2603 (2006).</li><li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin.">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li><li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum.">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li><li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+ph&#233;nom&#233;nes+de+pseudopupille+dans+l'oeil+compose+de+Drosophila.">Les ph&#233;nom&#233;nes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li><li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia.">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li><li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system.">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li><li>Meyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+light-dependent+translocation+of+the+ion+channel+TRPL+in+the+photoreceptors+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer.+nat.">Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2005).</li><li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., D&#252;rr, T. D., Sch&#228;fer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL.">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li><li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye.">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li><li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability.">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li><li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila.">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).</li><li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila.">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li><li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice.">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li><li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila.">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).</li><li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).</li><li>Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+TRP+ion+channels+in+the+photoreceptor+cells+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer,+nat.">Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2007).</li><li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila.">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li><li>Hardie, R. C., Liu, C. -. H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors.">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li><li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4,5+bisphosphate+(PIP2)+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors.">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).</li></ol>

प्रतिदीप्ति प्रोटीन की प्रयोज्यता और डीपीपी इमेजिंग और रेटिना जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी द्वारा स्क्रीनिंग की सादगी को कई समूहों द्वारा सफल साबित किया गया है। यहां प्रस्तुत लोगों के समान रण?...

प्लाज्मा झिल्ली से प्रोटीन को वितरित करने और हटाने से, न्यूरॉन्स में झिल्ली प्रोटीन तस्करी रिसेप्टर्स के साथ-साथ आयन चैनलों के साथ प्लाज्मा झिल्ली उपकरण को नियंत्रित करती है और परिणामस्वरूप, न्यूरोनल फ़ंक्शन को नियंत्रित करती है। प्रोटीन तस्करी में गलत विनियमन या दोष आमतौर पर कोशिकाओं पर हानिकारक प्रभाव डालते हैं और इसके परिणामस्वरूप न्यूरोनल अपघटन होता है। मनुष्यों में, यह अल्जाइमर और पार्किंसंस रोग या रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा1 जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों का कारण बन सकता है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की यौगिक आंख में फोटोरिसेप्टर झिल्ली प्रोटीन तस्करी 2 का अध्ययन करने के लिए एक इन विवो मॉडल सिस्टम बन गएहैं। यह न केवल ड्रोसोफिला की आनुवंशिक बहुमुखी प्रतिभा के कारण है जो प्रभावी आनुवंशिक स्क्रीन की अनुमति देता है, बल्कि इसलिए भी है क्योंकि प्रकाश-अवशोषित फोटोरिसेप्टर झिल्ली के सभी आवश्यक घटकों को बहुत विस्तार से विशेषता है और कुशल माइक्रोस्कोपिक तकनीकें उपलब्ध हैं जिन्हें मक्खी आंख पर लागू किया जा सकता है। ये तकनीकें इस लेख का फोकस हैं।
ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में, एपिकल प्लाज्मा झिल्ली कोशिका के एक तरफ माइक्रोविली का एक घनी पैक स्टैक बनाती है, जिसे रैबडोमेर कहा जाता है। फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं R1-6 के rhabdomeres को एक विशेषता ट्रेपोज़ॉइडल पैटर्न में व्यवस्थित किया जाता है जबकि फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं R7 और R8 इस ट्रेपोज़ॉइड3 के केंद्र में एक एकल rhabdomere बनाती हैं। झिल्ली प्रोटीन तस्करी की आवश्यकता रोडोप्सिन और प्रकाश-सक्रिय टीआरपी (क्षणिक रिसेप्टर क्षमता) और टीआरपीएल (टीआरपी-जैसे) आयन चैनलों जैसे रैबडोमेरल झिल्ली प्रोटीन के विनियमित कारोबार के लिए होती है ताकि रैबडोमेर में इन फोटोट्रांसडक्शन प्रोटीन की उचित मात्रा को सुनिश्चित किया जा सके। फोटोरिसेप्टर झिल्ली प्रोटीन को एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में संश्लेषित किया जाता है और गोल्गी तंत्र के माध्यम से रैबडोमेरे तक ले जाया जाता है। प्रकाश द्वारा रोडोप्सिन के सक्रियण के बाद, एक रोडोप्सिन अणु या तो दूसरे फोटॉन के अवशोषण से निष्क्रिय हो सकता है या क्लैथ्रिन-मध्यस्थता एंडोसाइटोसिस द्वारा रैबडोमेर से हटाया जा सकता है। एंडोसाइटोसेड रोडोप्सिन या तो लाइसोसोम में अवक्रमित हो जाता है या इसे 4,5 के रैबडोमेरे में वापस पुनर्नवीनीकरण किया जाता है। आयन चैनल TRPL भी phototransduction कैस्केड के सक्रियण के बाद internalized है और rhabdomere (जहां यह स्थित है जब मक्खियों को अंधेरे में रखा जाता है) और सेल शरीर में एक ईआर-समृद्ध भंडारण डिब्बे (जिसमें यह रोशनी पर कई घंटों के भीतर ले जाया जाता है) के बीच एक प्रकाश-निर्भर स्थानांतरण से गुजरता है)6,7,8,9,10 . एंडोसाइटोसेड रोडोप्सिन के विपरीत, टीआरपीएल की केवल थोड़ी मात्रा को एंडोलाइसोसोमल मार्ग के माध्यम से अवक्रमित किया जाता है, और अधिकांश को इसके बजाय इंट्रासेल्युलर रूप से संग्रहीत किया जाता है और अंधेरे अनुकूलन6 पर रैबडोमेरे में वापस पुनर्नवीनीकरण किया जाता है। इस प्रकार टीआरपीएल का उपयोग प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के प्रकाश-ट्रिगर तस्करी का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं को न्यूरोनल अपघटन के अध्ययन के लिए भी नियोजित किया जाता है। फोटोरिसेप्टर सेल अध: पतन अक्सर rhabdomeres की संरचना का आकलन करके निर्धारित किया जाता है, जो अपक्षयी प्रक्रियाओं के परिणामस्वरूप विघटित होजाता है 5।
फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं या फोटोरिसेप्टर सेल अध: पतन में टीआरपीएल और रोडोप्सिन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए, दो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विधियां जो विश्लेषण की गति और संकल्प के संबंध में भिन्न होती हैं, उन्हें यहां लागू किया गया है। एक बहुत तेज, गैर-इनवेसिव विधि जिसका उपयोग आनुवंशिक स्क्रीन के लिए किया जा सकता है लेकिन एक सीमित स्थानिक संकल्प के साथ गहरे स्यूडोपपिल (डीपीपी) में प्रतिदीप्ति का पता लगाना है। डीपीपी आर्थ्रोपोड यौगिक आंखों की एक ऑप्टिकल घटना है जिसकी ज्यामितीय उत्पत्ति को 1971 11 में फ्रांसेशिनी और किर्शफेल्ड द्वारा विस्तार से समझाया गयाहै। संक्षेप में, रेटिना ओवरले के नीचे कई ऑप्टिकल विमानों पर आसन्न ओमटिडिया से rhabdomeres की छवियों को देखा जा सकता है। आंख की वक्रता के केंद्र के माध्यम से एक फोकल प्लेन पर, ये सुपरइम्पोज़्ड अनुमान एक छवि बनाते हैं जो एक एकल ओमटिडियम में रैबडोमेरेस के समलम्बीय लेआउट जैसा दिखता है, केवल परिमाण के आदेश बड़े होते हैं। इस घटना को प्रतिदीप्ति प्रोटीन की बहिर्जात अभिव्यक्ति (जैसे TRPL::eGFP8) से स्वतंत्र रूप से भी देखा जा सकता है, जो फिर भी DPP को पता लगाना आसान बनाता है (चित्रा 1A-A')12। एक दूसरी गैर-इनवेसिव विधि जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी है जो पानी के साथ आंखों के डायोप्ट्रिक तंत्र को ऑप्टिकल रूप से बेअसर करने के बाद फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन को इमेजिंग पर निर्भर करती है (चित्रा 1 बी-सी')12। जल विसर्जन विधि का उपयोग करते हुए, TRPL की सापेक्ष मात्रा: rhabdomeres या सेल बॉडी में eGFP को व्यक्तिगत फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के लिए मात्रात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है। इसके अलावा, गैर-ट्रांसलोकेटिंग प्रतिदीप्ति-टैग किए गए प्रोटीन का उपयोग रैबडोमेरल अखंडता का मूल्यांकन करने और मात्रात्मक तरीके से संभावित अध: पतन के समय पाठ्यक्रम को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि यहां वर्णित है।
जबकि डीपीपी की रिकॉर्डिंग अब तक के सबसे आसान और सबसे तेज़ इन तरीकों में से सबसे तेज़ हैं, उनके द्वारा उत्पन्न डेटा का स्थानिक रिज़ॉल्यूशन सीमित है। इसके अलावा, ऐसे कई कारण हैं कि एक डीपीपी अनुपस्थित क्यों हो सकता है, जो आवश्यक रूप से डीपीपी इमेजिंग द्वारा ही स्पष्ट नहीं हैं। चूंकि डीपीपी कई ओमटिडिया के योग का प्रतिनिधित्व करता है, इसलिए व्यक्तिगत कोशिकाओं के बारे में जानकारी खो जाती है। इस प्रकार, कम रिज़ॉल्यूशन डीपीपी इमेजिंग बड़ी संख्या में मक्खियों की स्क्रीनिंग में एक महत्वपूर्ण कार्य करता है, लेकिन आमतौर पर पानी विसर्जन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से उच्च रिज़ॉल्यूशन रिकॉर्डिंग के बाद किया जाना चाहिए। जल विसर्जन माइक्रोग्राफ व्यक्तिगत कोशिकाओं, विकासात्मक दोषों, आंखों के आकारिकी, प्रोटीन मिसलोकलाइजेशन या रेटिना अपघटन के साथ-साथ इन प्रभावों के परिमाणीकरण के बारे में व्याख्याओं की अनुमति देते हैं। यह प्रोटोकॉल इन दो तकनीकों का विस्तार से वर्णन करता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> चित्रा 1: इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत ड्रोसोफिला आंख के लिए माइक्रोस्कोपी विविधताओं का अवलोकन। योजनाबद्ध अभ्यावेदन और अनुकरणीय माइक्रोग्राफ (ए-ए') फ्लोरोसेंट डीप स्यूडोपपिल (डीपीपी) इमेजिंग, (बी-बी') फ्लोरोसेंट रैबडोमेरेस की घातक जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी, और (सी-सी') फ्लोरोसेंट रैबडोमेरेस की गैर-घातक पानी की बूंद माइक्रोस्कोपी। स्केल बार (A'): 100 μm. स्केल सलाखों (B'-C'): 10 μm. इस आंकड़े को संदर्भ13 से संशोधित किया गया है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 anaesthesia fly pad</td>
			<td>Flystuff</td>
			<td>59-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light lamp (KL 1500 LCD)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) 
			[1750 Lux, Ee470nm = 298 &#181;W cm-2, Ee590nm = 215 &#181;W cm-2] 
			and [760 Lux, Ee470nm = 173 &#181;W cm-2, Ee590nm = 147 &#181;W cm-2]</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300518039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pipette (20-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Object slide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0656.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Labsolute</td>
			<td>7695844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine (Blu-Tack)</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>30811745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope (SMZ445)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins

झिल्ली प्रोटीन तस्करी प्लाज्मा झिल्ली में रिसेप्टर्स और आयन चैनलों के निगमन और हटाने को नियंत्रित करती है। यह प्रक्रिया कोशिका समारोह और न्यूरॉन्स की कोशिका अखंडता के लिए मौलिक रूप से महत्वपूर्ण है। ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं झिल्ली प्रोटीन तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल बन गई हैं। रोडोप्सिन के अलावा, जो रोशनी पर फोटोरिसेप्टर झिल्ली से आंतरिक हो जाता है और अवक्रमित हो जाता है, ड्रोसोफिला में क्षणिक रिसेप्टर संभावित (टीआरपीएल) आयन चैनल रैबडोमेरल फोटोरिसेप्टर झिल्ली (जहां यह अंधेरे में स्थित है) और फोटोरिसेप्टर सेल बॉडी (जिसमें इसे रोशनी पर ले जाया जाता है) के बीच एक प्रकाश-निर्भर स्थानांतरण प्रदर्शित करता है। TRPL के इस इंट्रासेल्युलर परिवहन का अध्ययन फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में eGFP-टैग किए गए TRPL को व्यक्त करके एक सरल और गैर-आक्रामक तरीके से किया जा सकता है। ईजीएफपी प्रतिदीप्ति को तब या तो गहरे स्यूडोपिपल में या पानी के विसर्जन माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जा सकता है। ये तरीके बरकरार आंखों में प्रतिदीप्ति का पता लगाने की अनुमति देते हैं और इसलिए टीआरपीएल ट्रांसलोकेशन में दोषपूर्ण ड्रोसोफिला म्यूटेंट के लिए उच्च-थ्रूपुट एसेस और आनुवंशिक स्क्रीन के लिए उपयोगी हैं। यहां, मक्खियों की तैयारी, माइक्रोस्कोपिक तकनीकों, साथ ही साथ टीआरपीएल के इस प्रकाश-ट्रिगर ट्रांसलोकेशन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले परिमाणीकरण विधियों को विस्तार से समझाया गया है। इन तरीकों को अन्य ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर प्रोटीन पर तस्करी के अध्ययन के लिए भी लागू किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, रोडोप्सिन। इसके अलावा, ईजीएफपी-टैग किए गए रैबडोमेरल प्रोटीन का उपयोग करके, इन तरीकों का उपयोग फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के अध: पतन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला मक्खियों एक TRPL व्यक्त: : रोडोप्सिन 1 प्रमोटर के नियंत्रण में eGFP संलयन प्रोटीन उत्पन्न किया गया है। इन मक्खियों में, TRPL::eGFP को यौगिक आंख के फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं R1-6 में व्यक्त किय?...

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Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

यहां, फोटोरिसेप्टर झिल्ली प्रोटीन के स्थानीयकरण और ईजीएफपी प्रतिदीप्ति का उपयोग करके ड्रोसोफिला यौगिक आंख में रेटिना अध: पतन के मूल्यांकन के लिए गैर-आक्रामक तरीकों का वर्णन किया गया है।

EGFP-टैग किए गए प्रोटीन का उपयोग कर ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में झिल्ली प्रोटीन तस्करी का अध्ययन

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

ड्रोसोफिला में आक्रामकता का अध्ययन (फल मक्खियों)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

कार्बनिक सॉल्वेंट और एसिटिक एसिड के बिना जी 250 Coomassie के साथ जैल में प्रोटीन की धुंधला

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

संरचना lipídic Mesophases का उपयोग कर निर्धारण के लिए झिल्ली प्रोटीन crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

झिल्ली प्रोटीन के lipídic Mesophases में Crystallization

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

प्रोटीन झिल्ली उपरिशायी परख: एक घुलनशील और अघुलनशील प्रोटीन के बीच बातचीत टेस्ट प्रोटोकॉल इन विट्रो में</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Illustrating के गतिशील kinetochore प्रोटीन और रहने में क्रोमोजोम प्रस्ताव व्यवहार के द्वारा mitotic चेकप्वाइंट अध्ययन<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Syncytial भ्रूण

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases में उच्च throughput झिल्ली प्रोटीन का Crystallization के लिए एक रोबोट का प्रयोग

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

झिल्ली macromolecular क्रिस्टलोग्राफी द्वारा संरचना निर्धारण के लिए lipidic Mesophases में बढ़ी प्रोटीन की कटाई और क्रायो ठंडा कण

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते रहते चूहों में इमेजिंग subcellular संरचनाओं के लिए intravital माइक्रोस्कोपी

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

मोजाइक सेक्स का लाइव इमेजिंग के लिए टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...