Name: studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

Vi vil gjerne takke våre studentforskere gjennom årene. Spesielt Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim og Laura Jaggy, hvis data har blitt brukt i denne protokollen som representative resultater. Forskningen til vår gruppe presentert her ble finansiert av tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) til Armin Huber.

1. Generelle hensyn
<ol><li>Bruk Drosophila-lagre som uttrykker et permanent rabdomeralt plassert fluorescensprotein for morfologisk analyse (f.eks. TRP::eGFP, eGFP::NINAC) og translokasjon av proteiner for analyser om proteinhandel (f.eks.</li>
	<li>Predetermine lyseksponeringsforhold for utvalgte fluer for eksperimentell tilnærming.<ol>
<li>For mørk tilpasning, hold fluene i mørke bokser i ønsket periode ved 25 °C. For belysning opptil 16 timer i translokasjonseksperimenter (f.eks. TRP...

<ol>
	<li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration.">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).</li><li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina.">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li><li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila.">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pfl&#252;gers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li><li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration:+lessons+from+the+fly.">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li><li>B&#228;hner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current.">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li><li>Cronin, M. A., Lieu, M. -. H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors.">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li><li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade.">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, 2592-2603 (2006).</li><li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin.">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li><li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum.">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li><li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+ph&#233;nom&#233;nes+de+pseudopupille+dans+l'oeil+compose+de+Drosophila.">Les ph&#233;nom&#233;nes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li><li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia.">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li><li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system.">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li><li>Meyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+light-dependent+translocation+of+the+ion+channel+TRPL+in+the+photoreceptors+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer.+nat.">Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2005).</li><li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., D&#252;rr, T. D., Sch&#228;fer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL.">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li><li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye.">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li><li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability.">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li><li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila.">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).</li><li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila.">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li><li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice.">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li><li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila.">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).</li><li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).</li><li>Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+TRP+ion+channels+in+the+photoreceptor+cells+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer,+nat.">Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2007).</li><li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila.">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li><li>Hardie, R. C., Liu, C. -. H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors.">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li><li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4,5+bisphosphate+(PIP2)+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors.">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).</li></ol>

Anvendelsen av fluorescensproteiner og enkelhet i screening ved DPP-avbildning og retinal vanninnlevelsesmikroskopi har vist seg å være vellykket av mange grupper12. Strategier som ligner på de som presenteres her har blitt brukt i flere genetiske skjermer for å oppdage defekter i rhodopsinuttrykksnivåer, homeostase, retinal organisasjon eller cellulær integritet ved hjelp av Rh1::eGFP 17,18,19,20,21.</su...

Ved å levere og fjerne proteiner til og fra plasmamembranen kontrollerer membranproteinhandel i nevroner plasmamembranutstyret med reseptorer samt ionkanaler og regulerer derfor nevronfunksjonen. Feilregulering eller defekter i proteinhandel har vanligvis skadelige effekter på celler og resulterer i nevronal degenerasjon. Hos mennesker kan dette forårsake nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers og Parkinsons sykdom eller Retinitis pigmentosa1. Fotoreseptorer i det sammensatte øyet til Drosophila melanogaster har blitt et in vivo-modellsystem for å studere membranproteinhandel2. Dette skyldes ikke bare den genetiske allsidigheten til Drosophila som tillater effektive genetiske skjermer, men også fordi alle viktige komponenter i den lysabsorberende fotoreseptormembranen er preget i detalj og effektive mikroskopiske teknikker er tilgjengelige som kan brukes på flueøyet. Disse teknikkene er fokus i denne artikkelen.
I Drosophila fotoreseptorceller danner den apikale plasmamembranen en tettpakket stabel med mikrovilli langs den ene siden av cellen, kalt rhabdomere. Rhabdomeres av fotoreseptorceller R1-6 er ordnet i et karakteristisk trapesformet mønster mens fotoreseptorceller R7 og R8 danner en enkelt rhabdomere i midten av denne trapesformet3. Membranproteinhandel er nødvendig for en regulert omsetning av rhabdomerale membranproteiner som rhodopsin og den lysaktiverte TRP (forbigående reseptorpotensial) og TRPL (TRP-lignende) ionkanaler for å sikre riktig mengde av disse fototransduksjonsproteinene i rhabdomere. Fotoreseptormembranproteiner syntetiseres i det endoplasmatiske retikulumet og transporteres via Golgi-apparatet til rhabdomere. Etter aktivering av rhodopsin ved lys, kan et rhodopsinmolekyl enten inaktiveres ved absorpsjon av en annen foton eller kan fjernes fra rhabdomere ved klarrinmediert endokytose. Endocytosed rhodopsin blir enten degradert i lysosomet eller resirkuleres tilbake til rhabdomere 4,5. Ionkanalen TRPL er også internalisert etter aktivering av fototransduksjonskaskaden og gjennomgår en lysavhengig translokasjon mellom rhabdomere (hvor den ligger når fluer holdes i mørket) og et ER-beriket oppbevaringsrom i cellekroppen (som den transporteres innen flere timer etter belysning) 6,7,8,9,10 . I motsetning til endokytosed rhodopsin, blir bare små mengder TRPL degradert via den endolysosomale banen, og flertallet lagres intracellulært i stedet og resirkuleres tilbake til rhabdomere ved mørk tilpasning6. TRPL kan dermed brukes til å analysere lysutløst smugling av plasmamembranproteiner. Drosophila fotoreseptorceller brukes også til å studere nevronal degenerasjon. Photoreceptor celle degenerasjon bestemmes ofte ved å vurdere strukturen av rabdomerer, som oppløses som følge av degenerative prosesser5.
For å studere subcellulær lokalisering av TRPL og rhodopsin i fotoreseptorceller eller fotoreseptorcelledegenerering, er det brukt to fluorescensmikroskopimetoder som varierer med hensyn til analysehastighet og oppløsning her. En veldig rask, ikke-invasiv metode som kan brukes til genetiske skjermer, men med en begrenset romlig oppløsning er påvisning av fluorescens i det dype pseudopupilet (DPP). DPP er et optisk fenomen av leddyr sammensatte øyne hvis geometriske opprinnelse har blitt forklart i detalj av Franceschini og Kirschfeld i 197111. Kort sagt, på flere optiske plan under netthinnen overlegg-bilder av rhabdomeres fra tilstøtende ommatidia kan observeres. På et fokalplan gjennom midten av øyets krumning danner disse overliggende projeksjonene et bilde som ligner den trapesformede utformingen av rhabdomeres i et enkelt ommatidium bare størrelsesorden større. Dette fenomenet kan også observeres uavhengig av eksogent uttrykk for fluorescensproteiner (f.eks. TRPL::eGFP8), noe som likevel gjør DPP enklere å oppdage (figur 1A-A')12. En annen ikke-invasiv metode er vanninnlevelsesmikroskopi som er avhengig av avbildning av fluorescerende merkede proteiner etter optisk nøytralisering av øynenes dioptriske apparat med vann (figur 1B-C')12. Ved hjelp av vann nedsenkningsmetoden kan den relative mengden TRPL::eGFP i rhabdomeres eller cellekropp vurderes kvantitativt for individuelle fotoreseptorceller. Videre kan ikke-translokerende fluorescensmerkede proteiner brukes til å evaluere rabdomeral integritet og for å bestemme tidsforløpet for en potensiell degenerasjon på en kvantitativ måte, som beskrevet her.
Mens opptak av DPP er den desidert enkleste og raskeste av disse metodene å utføre, er den romlige oppløsningen av data de genererer begrenset. I tillegg er det mange grunner til at en DPP kan være fraværende, som ikke nødvendigvis er merkbar av DPP-bildebehandling selv. Siden DPP representerer en oppsummering av flere ommatidia, går informasjon om individuelle celler tapt. Dermed tjener lavoppløselig DPP-avbildning en viktig funksjon i screening av et stort antall fluer, men bør generelt følges av opptak med høyere oppløsning ved hjelp av vanninnlevelsesmikroskopi. Vann nedsenkningsmikrografer tillater tolkninger om individuelle celler, utviklingsfeil, øyemorfologi, proteinfeillokalisering eller retinal degenerasjon samt kvantifisering av disse effektene. Denne protokollen beskriver disse to teknikkene i detalj.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> Figur 1: Oversikt over mikroskopivariasjoner for Drosophila-øyet presentert i denne protokollen. Skjematiske representasjoner og eksemplariske mikrografer av (A-A'') fluorescerende dyp pseudopupil (DPP) avbildning, (B-B'') dødelig vanninnlevelsesmikroskopi av fluorescerende rabdomerer, og (C-C'') ikke-dødelige vanndråpemikroskopi av fluorescerende rhabdomere. Skalastang (A''): 100 μm. Skalastolper (B''-C''): 10 μm. Tallet er endret fra referanse13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 anaesthesia fly pad</td>
			<td>Flystuff</td>
			<td>59-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light lamp (KL 1500 LCD)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) 
			[1750 Lux, Ee470nm = 298 &#181;W cm-2, Ee590nm = 215 &#181;W cm-2] 
			and [760 Lux, Ee470nm = 173 &#181;W cm-2, Ee590nm = 147 &#181;W cm-2]</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300518039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pipette (20-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Object slide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0656.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Labsolute</td>
			<td>7695844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine (Blu-Tack)</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>30811745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope (SMZ445)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins

Membranproteinhandel regulerer inkorporering og fjerning av reseptorer og ionkanaler i plasmamembranen. Denne prosessen er fundamentalt viktig for cellefunksjon og celleintegritet av nevroner. Drosophila fotoreseptorceller har blitt en modell for å studere membranproteinhandel. Foruten rhodopsin, som ved belysning blir internalisert fra fotoreseptormembranen og er degradert, viser den forbigående reseptorpotensiallignende (TRPL) ionkanalen i Drosophila en lysavhengig translokasjon mellom rhabdomeral fotoreseptormembran (hvor den ligger i mørket) og fotoreseptorcellekroppen (som den transporteres til ved belysning). Denne intracellulære transporten av TRPL kan studeres på en enkel og ikke-invasiv måte ved å uttrykke eGFP-merket TRPL i fotoreseptorceller. EGFP-fluorescensen kan deretter observeres enten i den dype pseudopupilen eller ved vanninnlevelsesmikroskopi. Disse metodene tillater deteksjon av fluorescens i det intakte øyet og er derfor nyttige for høygjennomstrømningsanalyser og genetiske skjermer for Drosophila-mutanter som er defekte i TRPL-translokasjon. Her forklares forberedelsen av fluer, mikroskopiske teknikker, samt kvantifiseringsmetoder som brukes til å studere denne lysutløste translokasjonen av TRPL i detalj. Disse metodene kan også brukes til menneskehandelstudier på andre Drosophila fotoreseptorproteiner, for eksempel rhodopsin. I tillegg, ved å bruke eGFP-merkede rabdomerale proteiner, kan disse metodene brukes til å vurdere degenerasjon av fotoreseptorceller.

Transgene Drosophila-fluer som uttrykker et TRPL::eGFP-fusjonsprotein under kontroll av rhodopsin 1-promotoren, er generert. I disse fluene uttrykkes TRPL::eGFP i fotoreseptorceller R1-6 i det sammensatte øyet og viser en belysningsavhengig lokalisering. Når fluer holdes i mørket, er TRPL::eGFP innlemmet i ytre rhabdomeres. Etter belysning i flere timer translokaliserer TRPL inn i cellekroppen der den er lagret i et ER-beriket rom. 8,10 Når TRPL::eGF...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Her er ikke-invasive metoder beskrevet for lokalisering av fotoreseptormembranproteiner og vurdering av retinal degenerasjon i Drosophila sammensatt øye ved hjelp av eGFP fluorescens.

Studere membranproteinhandel i Drosophila Fotoreseptorceller ved hjelp av eGFP-taggede proteiner

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

GFP-taggede fotoreseptorproteiner, som ionkanalen TRPL GFP, lar oss studere proteintransport i nevroner ved hjelp av ikke-invasive teknikker. Denne metoden kan også brukes til å overvåke fotoreseptordegenerasjon. Dermed kan det molekylære grunnlaget for arvelige sykdommer som resulterer i blindhet hos mennesker studeres i Drosophila-øyet.Cellulær lokalisering av GFP-merkede proteiner kan vurderes ved å observere fluorescensen i den dype pseudopupilen eller ved vanninnlevelsesmikroskopi. Begge metodene tillater rask bestemmelse av lokalisering av visuelle proteiner og observere strukturelle feil av rabdomer på grunn av degenerasjon av fotoreseptorceller. For å få bilder av høy kvalitet er det viktigste aspektet retningen til flyøyet.Mens man utfører denne teknikken, bør man fokusere på ommatidia som ligger litt mot øyets periferi. Jeg vil demonstrere prosedyren for DPP-avbildning, mens de to teknikkene ved hjelp av vanninnlevelsesmikroskopi vil bli demonstrert av min kollega, Dr.Krystina Wagner og Matthias Zeger, en ph.d.-student i vår gruppe. For å begynne dyp pseudopupil, eller DPP, bildebehandling, bedøve en-til-tre-dagers-gamle fluer, og plassere en av dem i midten av mikroskopet mål på sin side slik at enten venstre eller høyre øye står overfor målet nøyaktig radially.Øk forstørrelsen slik at den passer til hele øyet, og midtstill øyets sentrale ommatidia. Hvis det er mulig, reduser dybden på mikroskopet ved å justere dobbel-irismembranen til en grunne innstilling. Slå deretter på UV-lampen på mikroskopet med maksimal intensitet.Velg deretter mikroskopets fluorescensfiltersett i henhold til fluorescensproteinet uttrykt i øynene, og sett lysbanen mot det mikroskopmonterte kameraet. Bruk funksjonen for direkte bildebehandling i programvaren til å justere lysstyrken i bildet til en innstilling som bare oppdager bestemte signaler fra øyet ved å øke eksponeringstiden og oppnå verdi. Juster mikroskopfokuset inn i øyet for å generere det overliggende bildet av DPP.Ta deretter et øyeblikksbilde av den fluorescerende DPP. For å forberede en flue i en dødelig variasjon, fest et stykke Plasticine på et objektsklie og et annet stykke inn i midten av en Petri-tallerken. Fyll Petri-fatet med iskjølt destillert vann og noen isflak.Legg deretter en isbedøvelsesfly under et stereomikroskop på toppen av plasticine-belagt objektsklie. Snu flyet på ryggen, og pierce en insektpinne gjennom midten av thoraxen. Fest pinnen horisontalt på den plasticine-belagte gjenstandsskuffen, og orienter enten venstre eller høyre øye på fluen oppover.Fest deretter objektskuffen forsiktig med den plasticinefrie siden vendt ned i Petri-parabolen, og forhindre rotasjon av flyhodet. Pass på at flyøyet er dekket med vann. Alternativt, for å forberede en flue i en ikke-dødelig variasjon, overfør det isbedøvelsesflyhodet først til en 200-mikroliter pipettespiss, og skyv forsiktig flyet mot spissen med trykkluft.Deretter, ved hjelp av en skalpell, kutt av pipettespissen rett foran hodet, og bruk pinsett forsiktig skyv flyet noen få millimeter inn i pipettespissen. Klipp av pipettespissen igjen, og skyv flyet tilbake mot spissen med trykkluften slik at bare flyets hode stikker ut fra pipettespissen. Når du har sett et stykke Plasticine på et objektsklie, trykker du pipettespissen inn i den slik at venstre eller høyre øye vender oppover.Pass på at øyet er riktig orientert under mikroskopet. Velg et mål for vanninnlevelse for bildeanskaffelse. Ved ikke-dødelig variasjon, bruk en laboratoriepipette for å feste en stor dråpe kjølt vann til undersiden av vanninnlevelsesmålet.Plasser objektskuffen forsiktig med den forberedte fluen på mikroskopstadiet. Senk deretter vanninnlevelsesmålet manuelt til det kommer i kontakt med vannoverflaten eller flyets øye berører dråpen. Deretter bytter du lysbanen mot mikroskopkameraet og genererer et levende bilde.Juster fokuset for kameraet, og evaluer øyets retning, med tanke på at øyet må møte mikroskopmålet radialt. Bruk oppslagstabellprogramvaren til å oppdage overmetning. Når det gjelder ikke-pigmenterte fluer, juster eksponeringstiden slik at de lyseste pikslene er like under metningsgrensen for hvert bilde.Ta opp et bilde, og lagre det som en rå fil for å arkivere alle tilsvarende metadata for innspillingen. Deretter eksporterer du bildet i et tif-format. Hvis du vil kvantifisere relativ eGFP-fluorescens i rhabdomeres av mikrografer for vanninnlevelse, justerer du ImageJ-innstillingene ved å klikke på Analyser, deretter Angi målinger og bare merke av i boksen for Middelgrå verdi.Importer tif-bildet ved å klikke på Fil og deretter Åpne. Velg et representativt område av bildet i fokus, og forstørr det til 200 til 300 %, ved å trykke kontroll og sammen gjentatte ganger. Deretter velger du ellipseverktøyet, og mens du trykker skifttasten, genererer du en sirkulær markering i bildet som er betydelig mindre enn én fluorescerende rhabdomere.Deretter ser du etter den nøyaktige størrelsen som vises under verktøylinjen i hovedvinduet i ImageJ. Hvis du vil måle fluorescensintensitetene i sirkelvalget, flytter du sirkelen til den første rhabdomereen med piltastene på tastaturet, og deretter klikker du Analyser og deretter Mål. Et resultatvindu som viser den målte grå verdien, dukker opp.Fortsett med målinger av rabdomer to til seks, og mål også bakgrunnssignalet. Når det gjelder ikke-pigmenterte fluer, gjør du ytterligere målinger av de tilsvarende cellekroppsområdene. Mål fluorescensen til to ommatidia, noe som resulterer i tre tekniske repliker.Merk den analyserte ommatidien ved hjelp av blyantverktøyet, og lagre dette bildet for dokumentasjon. Velg og kopier de målte grå verdiene fra resultatvinduet, og lim dem inn i regnearkprogramvaren for ytterligere beregninger. Sorter fluorescensintensitetsverdiene i henhold til opprinnelsen i kategoriene rhabdomere, cellekropp og bakgrunn, og beregn gjennomsnittsintensiteten fra hver kategori.Beregn deretter den relative mengden eGFP som er tilstede i rhabdomere ved hjelp av den første formelen for ikke-pigmenterte øyne og den andre for pigmenterte øyne. Alternativt, for å kvantifisere øyemorfologi ved eGFP fluorescens i vann-nedsenkningsmikrografer, velg tre tilstøtende ommatidia i en representativ region av bildet som er i fokus. Evaluer de 18 rabdomere av utvalget individuelt i henhold til deres eGFP-intensitet, kantskarphet og kontrast med hensyn til det omkringliggende bakgrunnssignalet.Til slutt scorer du de tydelig synlige rhabdomeres med en verdi på to, ukentlige synlige rhabdomeres med en verdi på en, og fraværende rhabdomeres med en verdi på null for å generere en degenerasjonsindeks. I transgene Drosophila-fluer som uttrykker et eGFP TRPL-fusjonsprotein, forsvinner rabdomeral fluorescens i lys på grunn av translokasjon av eGFP TRPL. Dette gjør det mulig å utføre en genetisk skjerm for å identifisere mutanter som er defekte i internaliseringen av eGFP TRPL.I kontrollfluer translokaliserer eGFP TRPL ut av rhabdomeres inn i cellekroppen etter 16 timers belysning, noe som resulterer i en betydelig reduksjon av rhabdomeral fluorescens sammenlignet med den mørktilpassede tilstanden. Den andre mørke inkubasjonen øker rhabdomeral fluorescens igjen mot startverdien. Men i TRPL-translokasjonen defekt mutant vps35MH20 endres fluorescensmønsteret ikke drastisk etter 16 timers belysning og en påfølgende mørk tilpasning i 24 timer.Denne kvantifiseringsmetoden kan oppdage en statistisk svært betydelig resirkuleringsfeil. Hviteøyne fluer tillater påvisning av fluorescenssignaler fra både rhabdomere og cellekropp. I motsetning, i rødøyde fluer, kan fluorescenssignaler bare påvises i rabdomerer, men ikke i cellekroppen.Når det gjelder kvantifisering av retinal degenerasjon, kan eGFP TRP fluorescens vurderes i løpet av flere uker. Når den holdes i en 12-timers lys, 12-timers mørk syklus i to uker, falt degenerasjonsindeksen i mutante fluer, men ikke i kontrollfluer. I denne protokollen må man skille mellom pigmenterte og ikke-pigmenterte øyne.Siden pigmentering påvirker fluorescerende signal, har kvantitativ vann-nedsenkningsmikroskopi blitt optimalisert for begge tilfeller individuelt. DPP-avbildning og mikroskopi for vanninnlevelse er metoder med høy gjennomstrømning med begrenset oppløsning. For å undersøke subcellulær lokalisering anbefaler vi immunfluorescensmikroskopi på vevsseksjoner.For en detaljert analyse av degenerative fenotyper kan elektronmikroskopi utføres.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studerer Mitotisk Checkpoint ved å illustrere Dynamic kinetochore Protein Oppførsel og Kromosom Motion i Levende<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial Embryoer

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Bruk av en robot for High-throughput Krystallisering av membran proteiner i Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Høsting og Cryo-kjøling Krystaller av membran proteiner Grown i Lipidic Mesophases for strukturbestemmelse av Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intramikros for Imaging subcellulære strukturer i levende mus Uttrykke Fluorescent Proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Tomat / GFP-FLP / FRT Metode for Live Imaging av Mosaic Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; fotoreseptorcellene

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...