Name: studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить наших студентов-исследователей на протяжении многих лет. В частности, Нина Мейер, Сибилла Майер, Джулиана Каим и Лаура Джагги, чьи данные были использованы в этом протоколе в качестве репрезентативных результатов. Исследования нашей группы, представленные здесь, финансировались за счет грантов Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) Армину Хуберу.

1. Общие соображения
<ol><li>Используйте запасы дрозофилы , экспрессирующие постоянно рабдомерно расположенный флуоресцентный белок для морфологического анализа (например, TRP::eGFP, eGFP::NINAC) и транслокационные белки для анализа относительно незаконного оборота белка (например...

<ol>
	<li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration.">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).</li><li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina.">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li><li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila.">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pfl&#252;gers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li><li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration:+lessons+from+the+fly.">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li><li>B&#228;hner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current.">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li><li>Cronin, M. A., Lieu, M. -. H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors.">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li><li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade.">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, 2592-2603 (2006).</li><li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin.">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li><li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum.">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li><li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+ph&#233;nom&#233;nes+de+pseudopupille+dans+l'oeil+compose+de+Drosophila.">Les ph&#233;nom&#233;nes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li><li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia.">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li><li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system.">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li><li>Meyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+light-dependent+translocation+of+the+ion+channel+TRPL+in+the+photoreceptors+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer.+nat.">Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2005).</li><li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., D&#252;rr, T. D., Sch&#228;fer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL.">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li><li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye.">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li><li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability.">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li><li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila.">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).</li><li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila.">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li><li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice.">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li><li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila.">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).</li><li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).</li><li>Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+TRP+ion+channels+in+the+photoreceptor+cells+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer,+nat.">Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2007).</li><li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila.">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li><li>Hardie, R. C., Liu, C. -. H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors.">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li><li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4,5+bisphosphate+(PIP2)+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors.">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).</li></ol>

Применимость флуоресцентных белков и простота скрининга с помощью DPP-визуализации и микроскопии погружения в воду сетчатки доказали свою успешность многими группами12. Стратегии, аналогичные представленным здесь, использовались в нескольких генетических скринингах для ?...

Доставляя и удаляя белки в плазматическую мембрану и из нее, мембранный белковый трафик в нейронах контролирует оборудование плазматической мембраны с рецепторами, а также ионными каналами и, как следствие, регулирует функцию нейронов. Неправильная регуляция или дефекты в торговле белком обычно оказывают пагубное воздействие на клетки и приводят к дегенерации нейронов. У людей это может вызвать нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера и Паркинсона или пигментный ретинит1. Фоторецепторы в составном глазу Drosophila melanogaster стали модельной системой in vivo для изучения мембранного трафика белка2. Это связано не только с генетической универсальностью дрозофилы , которая позволяет проводить эффективные генетические скрининги, но и с тем, что все основные компоненты светопоглощающей фоторецепторной мембраны характеризуются очень подробно, и доступны эффективные микроскопические методы, которые могут быть применены к глазу мухи. Эти методы находятся в центре внимания этой статьи.
В фоторецепторных клетках Drosophila апикальная плазматическая мембрана образует плотно упакованный стек микроворсинок вдоль одной стороны клетки, называемый рабдомером. Рабдомеры фоторецепторных клеток R1-6 расположены в характерном трапециевидном рисунке, в то время как фоторецепторные клетки R7 и R8 образуют единый рабдомер в центре этой трапеции3. Мембранный промысел белка необходим для регулируемого оборота рабдомеральных мембранных белков, таких как родопсин и светоактивированные каналы TRP (переходный рецепторный потенциал) и TRPL (TRP-подобные), чтобы обеспечить надлежащее количество этих белков фототрансдукции в рабдомере. Белки фоторецепторной мембраны синтезируются в эндоплазматическом ретикулуме и транспортируются через аппарат Гольджи в рабдомер. После активации родопсина светом молекула родопсина может либо инактивироваться путем поглощения второго фотона, либо может быть удалена из рабдомера с помощью клатрин-опосредованного эндоцитоза. Эндоцитозированный родопсин либо деградирует в лизосоме, либо перерабатывается обратно в рабдомер 4,5. Ионный канал TRPL также интернализуется после активации каскада фототрансдукции и подвергается светозависимой транслокации между рабдомером (где он находится, когда мухи содержатся в темноте) и обогащенным ER-обогащенным отсеком хранения в теле клетки (в который он транспортируется в течение нескольких часов при освещении)6,7,8,9,10 . В отличие от эндоцитозированного родопсина, только небольшие количества TRPL разлагаются через эндолизосомальный путь, и большинство хранится внутриклеточным образом и рециркулируется обратно в рабдомер после темновой адаптации6. Таким образом, TRPL может быть использован для анализа светового трафика белков плазматической мембраны. Фоторецепторные клетки Drosophila также используются для изучения дегенерации нейронов. Дегенерация фоторецепторных клеток часто определяется путем оценки структуры рабдомеров, которые распадаются в результате дегенеративных процессов5.
Для изучения субклеточной локализации TRPL и родопсина в фоторецепторных клетках или дегенерации фоторецепторных клеток здесь применены два метода флуоресцентной микроскопии, отличающиеся по скорости и разрешению анализа. Очень быстрым, неинвазивным методом, который может быть использован для генетических скринингов, но с ограниченным пространственным разрешением, является обнаружение флуоресценции в глубоком псевдопупиле (DPP). DPP — это оптическое явление составных глаз членистоногих, геометрическое происхождение которого было подробно объяснено Франческини и Киршфельдом в 1971году 11. Короче говоря, на нескольких оптических плоскостях ниже наложения сетчатки можно наблюдать изображения рабдомеров из соседних омматидий. На фокальной плоскости через центр искривления глаза эти наложенные проекции образуют изображение, напоминающее трапециевидное расположение рабдомеров в одном омматидии только на порядки больше. Это явление также можно наблюдать независимо от экзогенной экспрессии флуоресцентных белков (например, TRPL::eGFP8), которые, тем не менее, облегчают обнаружение DPP (рисунок 1A-A'')12. Вторым неинвазивным методом является микроскопия погружения в воду, которая опирается на визуализацию флуоресцентно меченых белков после оптической нейтрализации диоптрического аппарата глаз водой (рисунок 1B-C'')12. Используя метод погружения в воду, относительное количество TRPL::eGFP в рабдомерах или теле клетки может быть количественно оценено для отдельных фоторецепторных клеток. Кроме того, нетранслокационные флуоресцентные белки могут быть использованы для оценки рабдомерной целостности и определения временного хода потенциальной дегенерации количественным образом, как описано здесь.
Хотя записи DPP на сегодняшний день являются самым простым и быстрым из этих методов, пространственное разрешение данных, которые они генерируют, ограничено. Кроме того, существует множество причин, по которым DPP может отсутствовать, которые не обязательно различимы по самой визуализации DPP. Поскольку ДПП представляет собой суммирование нескольких омматидий, информация об отдельных клетках теряется. Таким образом, визуализация DPP с низким разрешением выполняет важную функцию при скрининге большого количества мух, но, как правило, должна сопровождаться записями с более высоким разрешением с помощью микроскопии погружения в воду. Микроснимки погружения в воду позволяют интерпретировать отдельные клетки, дефекты развития, морфологию глаз, неправильную локализацию белка или дегенерацию сетчатки, а также количественно оценивать эти эффекты. В настоящем Протоколе подробно описываются эти два метода.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> Рисунок 1: Обзор вариаций микроскопии для глаза дрозофилы, представленных в настоящем Протоколе. Схематические изображения и примерные микроснимки (A-A'') флуоресцентной глубокой псевдопупильной (DPP) визуализации (B-B'') летального погружения в воду флуоресцентных рабдомеров и (C-C'') нелетальной капельной микроскопии флуоресцентных рабдомеров. Шкала (A''): 100 мкм. Шкала стержней (B''-C''): 10 мкм. Этот показатель был изменен по сравнению со ссылкой13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 anaesthesia fly pad</td>
			<td>Flystuff</td>
			<td>59-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light lamp (KL 1500 LCD)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) 
			[1750 Lux, Ee470nm = 298 &#181;W cm-2, Ee590nm = 215 &#181;W cm-2] 
			and [760 Lux, Ee470nm = 173 &#181;W cm-2, Ee590nm = 147 &#181;W cm-2]</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300518039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pipette (20-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Object slide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0656.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Labsolute</td>
			<td>7695844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine (Blu-Tack)</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>30811745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope (SMZ445)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins

Мембранный промысел белка регулирует включение и удаление рецепторов и ионных каналов в плазматическую мембрану. Этот процесс принципиально важен для клеточной функции и клеточной целостности нейронов. Фоторецепторные клетки Drosophila стали моделью для изучения трафика мембранного белка. Помимо родопсина, который при освещении интернализуется из фоторецепторной мембраны и деградирует, ионный канал транзиторного рецепторного потенциала (TRPL) у дрозофилы демонстрирует светозависимую транслокацию между рабдомеральной фоторецепторной мембраной (где она расположена в темноте) и телом фоторецепторной клетки (в которую он транспортируется при освещении). Этот внутриклеточный транспорт TRPL может быть изучен простым и неинвазивным способом путем экспрессии TRPL с тегами eGFP в фоторецепторных клетках. Затем флуоресценцию eGFP можно наблюдать либо в глубоком псевдопупиле, либо с помощью микроскопии погружения в воду. Эти методы позволяют обнаруживать флуоресценцию в интактном глазу и поэтому полезны для высокопроизводительных анализов и генетических скринингов мутантов Drosophila , дефектных транслокации TRPL. Здесь подробно объясняются подготовка мух, микроскопические методы, а также методы количественной оценки, используемые для изучения этой световой транслокации TRPL. Эти методы могут быть применены также для исследований незаконного оборота других фоторецепторных белков Drosophila , например, родопсина. Кроме того, используя рэбдомеральные белки, помеченные eGFP, эти методы могут быть использованы для оценки дегенерации фоторецепторных клеток.

Были сгенерированы трансгенные мухи Drosophila, экспрессирующие слитый белок TRPL::eGFP под контролем промотора родопсина 1. У этих мух TRPL::eGFP экспрессируется в фоторецепторных клетках R1-6 сложного глаза и отображает зависимую от освещения локализацию. Когда мухи содержатся в темноте, TRPL::eGFP...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Здесь описаны неинвазивные методы локализации белков фоторецепторной мембраны и оценки дегенерации сетчатки в глазу с помощью флуоресценции eGFP.

Изучение незаконного оборота мембранных белков в фоторецепторных клетках дрозофилы с использованием белков, помеченных eGFP

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

Помеченные GFP фоторецепторные белки, такие как ионный канал TRPL GFP, позволяют нам изучать транспорт белка в нейронах с использованием неинвазивных методов. Этот метод также может быть использован для мониторинга дегенерации фоторецепторов. Таким образом, молекулярная основа наследственных заболеваний, приводящих к слепоте у человека, может быть изучена в глазу дрозофилы.Клеточную локализацию белков, помеченных GFP, можно оценить, наблюдая флуоресценцию в глубоком псевдопупиле или с помощью водно-иммерсионной микроскопии. Оба метода позволяют быстро определять локализацию зрительных белков и наблюдать структурные дефекты рабдомеров вследствие дегенерации фоторецепторных клеток. Для получения высококачественных изображений наиболее важным аспектом является ориентация глаза мухи.Выполняя эту технику, следует сосредоточиться на омматидиях, расположенных немного по направлению к периферии глаза. Я буду демонстрировать процедуру визуализации DPP, в то время как два метода с использованием водно-иммерсионной микроскопии будут продемонстрированы моей коллегой, доктором Кристиной Вагнер, и Маттиасом Зегером, аспирантом в нашей группе. Чтобы начать глубокое псевдопупил, или DPP, визуализацию, обезболивайте одно-трехдневных мух и расположите одну из них в центре объектива микроскопа на боку так, чтобы левый или правый глаз был обращен к цели точно радиально.Увеличьте увеличение, чтобы оно соответствовало всему глазу, и центрируйте центральную омматидию глаза. Если возможно, уменьшите глубину резкости микроскопа, отрегулировав диафрагму с двойной радужкой до неглубокой установки. Далее включите УФ-лампу микроскопа с максимальной интенсивностью.Затем выберите набор флуоресцентных фильтров микроскопа в соответствии с белком флуоресценции, экспрессируемым в глазах, и установите световой путь к камере, установленной на микроскопе. Используя функцию live imaging в программном обеспечении, отрегулируйте яркость изображения до настройки, которая обнаруживает только определенные сигналы от глаза, увеличивая время экспозиции и увеличивая значение. Перенастройте фокус микроскопа в глаз, чтобы создать наложенное изображение DPP.Затем сделайте снимок флуоресцентного DPP. Чтобы приготовить муху в смертельной вариации, приклейте кусок пластилина на предметную горку и еще один кусок в центр чашки Петри. Наполните чашку Петри охлажденной льдом дистиллированной водой и ледяными хлопьями.Затем поместите одну обезболенную льдом муху под стереомикроскоп поверх предметного слайда, покрытого пластилином. Поверните муху на спину, и проткните булавку насекомого через центр грудной клетки. Закрепите булавку горизонтально на предметном слайде, покрытом пластилином, и наведите левый или правый глаз мухи вверх.Затем аккуратно зафиксируйте предмет скольжение его пластилиновой стороной вниз в чашке Петри, предотвращая вращение головки мухи. Убедитесь, что глаз мухи покрыт водой. В качестве альтернативы, чтобы подготовить муху в нелетальном варианте, переместите обезболенную льдом голову мухи сначала в 200-микролитрный наконечник пипетки и осторожно толкайте муху к кончику сжатым воздухом.Затем, используя скальпель, отрежьте кончик пипетки прямо перед головой, а с помощью пинцета осторожно протолкните муху на несколько миллиметров в кончик пипетки. Снова отрежьте наконечник пипетки и сожмите сжатым воздухом муху обратно к кончику так, чтобы из кончика пипетки выступала только головка мухи. Приклеив кусок пластилина к предметному слайду, прижмите к нему кончик пипетки так, чтобы левый или правый глаз был направлен вверх.Убедитесь, что глаз правильно ориентирован под микроскопом. Для получения изображения выберите цель погружения в воду. В случае нелетального варианта используйте лабораторную пипетку, чтобы приклеить большую каплю охлажденной воды к нижней стороне объекта погружения в воду.Осторожно поместите предметный слайд с подготовленной мухой на ступень микроскопа. Затем опустите цель погружения в воду вручную, пока она не соприкоснется с поверхностью воды или глаз мухи не коснется капли. Затем переключите световой путь к камере микроскопа и создайте живое изображение.Перенастройте фокус для камеры и оцените ориентацию глаза, учитывая, что глаз должен смотреть на объектив микроскопа радиально. Используйте программное обеспечение таблицы подстановки для обнаружения перенасыщения. В случае непигментированных мух отрегулируйте время экспозиции таким образом, чтобы самые яркие пиксели были чуть ниже предела насыщенности для каждого изображения.Запишите изображение и сохраните его в виде необработанного файла для архивации всех соответствующих метаданных записи. Затем экспортируйте изображение в формате tif. Чтобы количественно оценить относительную флуоресценцию eGFP в рабдомерах микрофотоснимков погружения в воду, отрегулируйте параметры ImageJ, щелкнув «Анализировать», затем «Установить измерения» и установите флажок «Среднее значение серого».Импортируйте изображение tif, щелкнув Файл, затем Открыть. Выберите репрезентативную область изображения в фокусе и увеличьте ее до 200–300%, многократно нажав клавишу «Control» и вместе. Затем выберите инструмент «Овал» и при нажатии клавиши «Shift» создайте на изображении круговую выделенную область, которая значительно меньше одного флуоресцентного рабдомера.Затем найдите точный размер, отображаемый под панелью инструментов в главном окне ImageJ. Чтобы измерить интенсивность флуоресценции в круговом выделении, переместите круг к первому рабдомеру с помощью клавиш со стрелками на клавиатуре и нажмите «Анализировать», затем «Измерить». Появится окно результатов со списком измеренного серого значения.Продолжайте измерения рабдомеров от двух до шести, а также измеряйте фоновый сигнал. В случае непигментированных мух сделайте дополнительные измерения соответствующих участков тела клеток. Измерьте флуоресценцию еще двух омматидий, в результате чего получится три технические реплики.Отметьте анализируемую омматидию с помощью инструмента «Карандаш» и сохраните это изображение для документации. Выберите и скопируйте измеренные серые значения из окна результатов и вставьте их в программное обеспечение для работы с электронными таблицами для дальнейших вычислений. Отсортируйте значения интенсивности флуоресценции в соответствии с их происхождением по категориям рабдомер, тело клетки и фон и рассчитайте среднюю интенсивность из каждой категории.Затем рассчитайте относительное количество eGFP, присутствующего в рабдомере, используя первую формулу для непигментированных глаз и вторую для пигментированных глаз. В качестве альтернативы, чтобы количественно оценить морфологию глаза с помощью флуоресценции eGFP на микроснимках погружения в воду, выберите три смежные омматидии в репрезентативной области изображения, которая находится в фокусе. Оцените 18 рабдомеров выделения по отдельности в соответствии с их интенсивностью eGFP, резкостью краев и контрастностью по отношению к окружающему фоновому сигналу.Наконец, оцените четко видимые рабдомеры со значением два, еженедельные видимые рабдомеры со значением единицы и отсутствующие рабдомеры со значением ноль, чтобы сгенерировать индекс вырождения. У трансгенных мух Drosophila, экспрессирующих синтез белка eGFP TRPL, рабдомеральная флуоресценция исчезает при свете из-за транслокации eGFP TRPL. Это позволяет выполнить генетический скрининг для выявления мутантов, дефективных в интернализации eGFP TRPL.У контрольных мух eGFP TRPL перемещается из рабдомеров в тело клетки после 16 часов освещения, что приводит к значительному снижению рабдомеральной флуоресценции по сравнению с темным адаптированным состоянием. Вторая темная инкубация снова повышает рабдомеральную флуоресценцию к исходному значению. Однако в транслокационном дефектном мутанте TRPL vps35MH20 картина флуоресценции не изменяется резко после 16 часов освещения и последующей темной адаптации в течение 24 часов.Этот метод количественной оценки может обнаружить статистически высокозначимый дефект рециркуляции. Белоглазые мухи позволяют обнаруживать флуоресцентные сигналы как от рабдомера, так и от тела клетки. Напротив, у красноглазых мух флуоресцентные сигналы обнаруживаются только в рабдомерах, но не в теле клетки.Что касается количественной оценки дегенерации сетчатки, флуоресценция eGFP TRP может быть оценена в течение нескольких недель. При содержании в 12-часовом световом, 12-часовом темном цикле в течение двух недель индекс дегенерации снижался у мутантных мух, но не у контрольных мух. В этом протоколе нужно различать пигментированные и непигментированные глаза.Поскольку пигментация влияет на флуоресцентный сигнал, количественная водно-иммерсионная микроскопия была оптимизирована для обоих случаев индивидуально. Визуализация DPP и водоиммерсионная микроскопия являются высокопроизводительными методами с ограниченным разрешением. Для исследования субклеточной локализации мы рекомендуем иммунофлуоресцентную микроскопию на участках тканей.Для детального анализа дегенеративных фенотипов может быть выполнена электронная микроскопия.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Изучение агрессии у дрозофилы (дрозофил)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Кристаллизующихся мембранных белков для определения структуры использования липидный Мезофазы

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Кристаллизация Мембранные белки в липидных Мезофазы

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Белки мембранные наложения Пробирной: протокол для тестирования Взаимодействие растворимых и нерастворимых белков В пробирке</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Изучение митоза Checkpoint, иллюстрируя динамического поведения белков кинетохора и хромосомы движения в живых<em&gt; Drosophila</em&gt; Синцитиальный эмбрионов

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Использование робота для высокой пропускной кристаллизации мембранных белков в липидный Мезофазы

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Сбор и охлаждения Cryo-кристаллы мембранных белков Выращивается в липидный Мезофазы для определения структуры по кристаллографии макромолекул

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Прижизненные микроскопия для визуализации субклеточных структур в живых мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Томатный / GFP-ФЛП / FRT Метод живых изображений мозаики взрослых<em&gt; Дрозофилы</em&gt; клетки фоторецепторов

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...