Name: studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

Vi vill tacka våra studentforskare genom åren. I synnerhet Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim och Laura Jaggy, vars data har använts i detta protokoll som representativa resultat. Forskningen i vår grupp som presenteras här finansierades av bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) till Armin Huber.

1. Allmänna överväganden
<ol><li>Använd Drosophila-bestånd som uttrycker ett permanent rabdomeralt placerat fluorescensprotein för morfologisk analys (t.ex. TRP::eGFP, eGFP::NINAC) och translokerande proteiner för analyser avseende proteinhandel (t.ex. TRPL::eGFP, Arr2::eGFP).</li>
	<li>Förutbestämma ljusexponeringsförhållandena för utvalda flugor för den experimentella metoden.<ol>
<li>För mörk anpassning, håll flugorna i mörka lådor under önskad period vid 25 ° C. För b...

<ol>
	<li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration.">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).</li><li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina.">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li><li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila.">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pfl&#252;gers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li><li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration:+lessons+from+the+fly.">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li><li>B&#228;hner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current.">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li><li>Cronin, M. A., Lieu, M. -. H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors.">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li><li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade.">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, 2592-2603 (2006).</li><li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin.">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li><li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum.">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li><li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+ph&#233;nom&#233;nes+de+pseudopupille+dans+l'oeil+compose+de+Drosophila.">Les ph&#233;nom&#233;nes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li><li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia.">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li><li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system.">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li><li>Meyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+light-dependent+translocation+of+the+ion+channel+TRPL+in+the+photoreceptors+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer.+nat.">Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2005).</li><li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., D&#252;rr, T. D., Sch&#228;fer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL.">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li><li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye.">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li><li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability.">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li><li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila.">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).</li><li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila.">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li><li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice.">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li><li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila.">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).</li><li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).</li><li>Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+TRP+ion+channels+in+the+photoreceptor+cells+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer,+nat.">Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2007).</li><li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila.">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li><li>Hardie, R. C., Liu, C. -. H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors.">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li><li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4,5+bisphosphate+(PIP2)+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors.">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).</li></ol>

Tillämpligheten av fluorescensproteiner och enkelheten i screening genom DPP-avbildning och retinal vattennedsänkningsmikroskopi har visat sig vara framgångsrik av många grupper12. Strategier som liknar de som presenteras här har använts i flera genetiska skärmar för att upptäcka defekter i rodopsinuttrycksnivåer, homeostas, retinal organisation eller cellulär integritet med hjälp av Rh1: eGFP 17,18,19,20,21.<sup cla...

Genom att leverera och avlägsna proteiner till och från plasmamembranet kontrollerar membranproteinhandel i neuroner plasmamembranutrustningen med receptorer såväl som jonkanaler och reglerar som ett resultat neuronal funktion. Felreglering eller defekter i proteinhandel har vanligtvis skadliga effekter på celler och resulterar i neuronal degeneration. Hos människor kan detta orsaka neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers och Parkinsons sjukdom eller Retinitis pigmentosa1. Fotoreceptorer i det sammansatta ögat av Drosophila melanogaster har blivit ett in vivo-modellsystem för att studera membranproteinhandel2. Detta beror inte bara på den genetiska mångsidigheten hos Drosophila som möjliggör effektiva genetiska skärmar, utan också för att alla väsentliga komponenter i det ljusabsorberande fotoreceptormembranet karakteriseras i detalj och effektiva mikroskopiska tekniker finns tillgängliga som kan appliceras på fluganga. Dessa tekniker är i fokus för den här artikeln.
I Drosophila fotoreceptorceller bildar det apikala plasmamembranet en tätt packad stapel av mikrovilli längs ena sidan av cellen, benämnt rhabdomere. Rhabdomererna av fotoreceptorceller R1-6 är anordnade i ett karakteristiskt trapetsformat mönster medan fotoreceptorcellerna R7 och R8 bildar en enda rhabdomere i mitten av denna trapezoid3. Membranproteinhandel behövs för en reglerad omsättning av rabdomerala membranproteiner såsom rodopsin och de ljusaktiverade TRP (övergående receptorpotentialen) och TRPL (TRP-liknande) jonkanalerna för att säkerställa rätt mängd av dessa fototransduktionsproteiner i rabdomeren. Fotoreceptormembranproteiner syntetiseras i endoplasmatisk retikulum och transporteras via Golgi-apparaten till rhabdomere. Efter aktivering av rodopsin med ljus kan en rodopsinmolekyl antingen inaktiveras genom absorption av en andra foton eller kan avlägsnas från rabdomeren genom klatrinmedierad endocytos. Endocytosed rhodopsin blir antingen nedbruten i lysosomen eller återvinns tillbaka till rhabdomere 4,5. Jonkanalen TRPL internaliseras också efter aktivering av fototransduktionskaskaden och genomgår en ljusberoende translokation mellan rhabdomere (där den är belägen när flugor hålls i mörkret) och ett ER-berikat förvaringsfack i cellkroppen (till vilket den transporteras inom flera timmar efter belysning)6,7,8,9,10 . Till skillnad från endocytosed rhodopsin bryts endast små mängder TRPL ned via den endolysosomala vägen, och majoriteten lagras intracellulärt istället och återvinns tillbaka till rhabdomere vid mörk anpassning6. TRPL kan således användas för att analysera ljusutlöst handel med plasmamembranproteiner. Drosophila fotoreceptorceller används också för att studera neuronal degeneration. Fotoreceptorcelldegenerering bestäms ofta genom att bedöma strukturen hos rabdomerer, som sönderfaller som ett resultat av degenerativa processer5.
För att studera den subcellulära lokaliseringen av TRPL och rodopsin i fotoreceptorceller eller fotoreceptorcelldegenerering har två fluorescensmikroskopimetoder som skiljer sig åt med avseende på analyshastighet och upplösning tillämpats här. En mycket snabb, icke-invasiv metod som kan användas för genetiska skärmar men med en begränsad rumslig upplösning är detekteringen av fluorescens i den djupa pseudopupilen (DPP). DPP är ett optiskt fenomen av leddjurssammansatte ögon vars geometriska ursprung har förklarats i detalj av Franceschini och Kirschfeld 197111. Kort sagt, på flera optiska plan under näthinnan kan överläggsbilder av rhabdomeres från intilliggande ommatidia observeras. På ett fokalplan genom mitten av ögats krökning bildar dessa överlagrade projektioner en bild som liknar den trapetsformade layouten av rabdomeres i ett enda ommatidium endast storleksordningar större. Detta fenomen kan också observeras oberoende av exogent uttryck av fluorescensproteiner (t.ex. TRPL::eGFP8), vilket ändå gör DPP lättare att detektera (figur 1A-A'')12. En andra icke-invasiv metod är vattennedsänkningsmikroskopi som bygger på avbildning av fluorescerande märkta proteiner efter optisk neutralisering av ögonens dioptriska apparater med vatten (figur 1B-C'')12. Med hjälp av vattennedsänkningsmetoden kan den relativa mängden TRPL::eGFP i rabdomererna eller cellkroppen bedömas kvantitativt för enskilda fotoreceptorceller. Vidare kan icke-translokerande fluorescensmärkta proteiner användas för att utvärdera rabdomeral integritet och för att bestämma tidsförloppet för en potentiell degeneration på ett kvantitativt sätt, som beskrivs här.
Medan inspelningar av DPP är överlägset de enklaste och snabbaste av dessa metoder att utföra, är den rumsliga upplösningen av data de genererar begränsad. Dessutom finns det många skäl till varför en DPP kan vara frånvarande, som inte nödvändigtvis kan urskiljas genom DPP-avbildning i sig. Eftersom DPP representerar en summering av flera ommatidier förloras information om enskilda celler. Således tjänar lågupplöst DPP-avbildning en viktig funktion vid screening av ett stort antal flugor men bör i allmänhet följas av inspelningar med högre upplösning genom mikroskopi med vattennedsänkning. Vattennedsänkningsmikrografer möjliggör tolkningar om enskilda celler, utvecklingsdefekter, ögonmorfologi, proteinfellokalisering eller retinal degeneration samt kvantifiering av dessa effekter. Detta protokoll beskriver dessa två tekniker i detalj.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> Figur 1: Översikt över mikroskopivariationer för Drosophila-ögat som presenteras i detta protokoll. Schematiska representationer och exemplifierande mikrografer av (A-A'') fluorescerande djup pseudopupil (DPP) avbildning, (B-B'') dödlig vattennedsänkningsmikroskopi av fluorescerande rabdomeres och (C-C'') icke-dödlig vattendroppsmikroskopi av fluorescerande rabdomerer. Skalstång (A''): 100 μm. Skalstänger (B''-C''): 10 μm. Siffran har ändrats från referens13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 anaesthesia fly pad</td>
			<td>Flystuff</td>
			<td>59-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light lamp (KL 1500 LCD)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) 
			[1750 Lux, Ee470nm = 298 &#181;W cm-2, Ee590nm = 215 &#181;W cm-2] 
			and [760 Lux, Ee470nm = 173 &#181;W cm-2, Ee590nm = 147 &#181;W cm-2]</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300518039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pipette (20-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Object slide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0656.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Labsolute</td>
			<td>7695844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine (Blu-Tack)</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>30811745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope (SMZ445)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins

Membranproteinhandel reglerar införlivandet och avlägsnandet av receptorer och jonkanaler i plasmamembranet. Denna process är fundamentalt viktig för cellfunktion och cellintegritet hos neuroner. Drosophila fotoreceptorceller har blivit en modell för att studera membranproteinhandel. Förutom rodopsin, som vid belysning internaliseras från fotoreceptormembranet och bryts ned, uppvisar den övergående receptorpotentialliknande (TRPL) jonkanalen i Drosophila en ljusberoende translokation mellan det rabdomerala fotoreceptormembranet (där det ligger i mörkret) och fotoreceptorcellkroppen (till vilken den transporteras vid belysning). Denna intracellulära transport av TRPL kan studeras på ett enkelt och icke-invasivt sätt genom att uttrycka eGFP-märkt TRPL i fotoreceptorceller. eGFP-fluorescensen kan sedan observeras antingen i den djupa pseudopupilen eller genom vattennedsänkningsmikroskopi. Dessa metoder möjliggör detektion av fluorescens i det intakta ögat och är därför användbara för analyser med hög genomströmning och genetiska skärmar för Drosophila-mutanter som är defekta vid TRPL-translokation. Här förklaras beredningen av flugor, de mikroskopiska teknikerna samt kvantifieringsmetoder som används för att studera denna ljusutlösta translokation av TRPL i detalj. Dessa metoder kan tillämpas även för traffickingstudier på andra Drosophila fotoreceptorproteiner, till exempel rodopsin. Dessutom, genom att använda eGFP-märkta rabdomerala proteiner, kan dessa metoder användas för att bedöma degenereringen av fotoreceptorceller.

Transgena Drosophila-flugor som uttrycker ett TRPL::eGFP-fusionsprotein under kontroll av rodopsin 1-promotorn har genererats. I dessa flugor uttrycks TRPL::eGFP i fotoreceptorceller R1-6 i det sammansatta ögat och visar en belysningsberoende lokalisering. När flugor hålls i mörkret införlivas TRPL::eGFP i de yttre rabdomererna. Efter belysning i flera timmar translokerar TRPL in i cellkroppen där den förvaras i ett ER-berikat fack. 8,10 När TRPL...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Här beskrivs icke-invasiva metoder för lokalisering av fotoreceptormembranproteiner och bedömning av retinal degeneration i Drosophila-föreningsögat med eGFP-fluorescens.

Studera membranproteinhandel i Drosophila fotoreceptorceller med eGFP-märkta proteiner

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

GFP-märkta fotoreceptorproteiner, som jonkanalen TRPL GFP, tillåter oss att studera proteintransport i neuroner med hjälp av icke-invasiva tekniker. Denna metod kan också användas för att övervaka fotoreceptordegenerering. Således kan den molekylära grunden för ärftliga sjukdomar som resulterar i blindhet hos människor studeras i Drosophila-ögat.Cellulär lokalisering av GFP-märkta proteiner kan bedömas genom att observera fluorescensen i den djupa pseudopupilen eller genom vattennedsänkningsmikroskopi. Båda metoderna möjliggör snabb bestämning av lokaliseringen av visuella proteiner och observation av strukturella defekter hos rabdomerer på grund av degenerering av fotoreceptorceller. För att få högkvalitativa bilder är den viktigaste aspekten flugögats orientering.När man utför denna teknik bör man fokusera på ommatidia som ligger något mot ögats periferi. Jag kommer att demonstrera proceduren för DPP-avbildning, medan de två teknikerna med vattennedsänkningsmikroskopi kommer att demonstreras av min kollega, Dr.Krystina Wagner, och Matthias Zeger, doktorand i vår grupp. För att börja djup pseudopupil, eller DPP, avbildning, bedöva en till tre dagar gamla flugor och placera en av dem i mitten av mikroskopmålet på dess sida så att antingen vänster eller höger öga vetter mot målet exakt radiellt.Öka förstoringen så att den passar hela ögat och centrera ögats centrala ommatidier. Om möjligt, minska mikroskopets skärpedjup genom att justera dubbelirismembranet till en grund inställning. Slå sedan på mikroskopet UV-lampan med maximal intensitet.Välj sedan mikroskopets fluorescensfilteruppsättning enligt fluorescensproteinet uttryckt i ögonen och ställ in ljusvägen mot den mikroskopmonterade kameran. Med hjälp av live-bildfunktionen i programvaran justerar du bildens ljusstyrka till en inställning som endast upptäcker specifika signaler från ögat genom att höja exponeringstiden och öka värdet. Justera mikroskopfokuset i ögat för att generera den överlagrade bilden av DPP.Ta sedan en ögonblicksbild av den fluorescerande DPP. För att förbereda en fluga i en dödlig variation, fäst en bit Plasticine på en föremålsglid och en annan bit i mitten av en petriskål. Fyll petriskålen med iskylt destillerat vatten och lite isflingor.Lägg sedan en isbedövad fluga under ett stereomikroskop ovanpå den plasticinbelagda objektrutschbanan. Vrid flugan på ryggen och genomborra en insektsstift genom mitten av bröstkorgen. Fäst stiftet horisontellt på den plasticinbelagda föremålsbilden och orientera antingen vänster eller höger öga på flugan uppåt.Fixera sedan försiktigt föremålsrutschkanan med sin Plasticine-fria sida vänd nedåt i petriskålen, vilket förhindrar rotation av flughuvudet. Se till att flugan är täckt med vatten. Alternativt, för att förbereda en fluga i en icke-dödlig variation, överför det isbedövade flughuvudet först till en 200 mikroliter pipettspets och tryck försiktigt flugan mot spetsen med tryckluft.Skär sedan av pipettspetsen precis framför huvudet med en skalpell och tryck försiktigt in flugan några millimeter i pipettspetsen med en pincett. Klipp av pipettspetsen igen och tryck tillbaka flugan mot spetsen med tryckluften så att endast flugans huvud sticker ut från pipettspetsen. Efter att ha fäst en bit Plasticine på en föremålsglidning, tryck pipettspetsen in i den så att vänster eller höger öga vetter uppåt.Se till att ögat är riktat korrekt under mikroskopet. För bildförvärv väljer du ett mål för vattennedsänkning. Vid en icke-dödlig variation, använd en laboratoriepipett för att fästa en stor droppe kylt vatten på undersidan av vattennedsänkningsmålet.Placera försiktigt objektbilden med den förberedda flugan på mikroskopsteget. Sänk sedan vattennedsänkningsmålet manuellt tills det kommer i kontakt med vattenytan eller flugans öga berör droppen. Växla sedan ljusvägen mot mikroskopkameran och generera en levande bild.Justera fokus för kameran och utvärdera ögats orientering, med tanke på att ögat måste möta mikroskopmålet radiellt. Använd programvaran för uppslagstabellen för att upptäcka övermättnad. När det gäller icke-pigmenterade flugor, justera exponeringstiden så att de ljusaste pixlarna ligger strax under mättnadsgränsen för varje bild.Spela in en bild och spara den som en råfil för att arkivera alla motsvarande metadata för inspelningen. Exportera sedan bilden i ett tif-format. För att kvantifiera relativ eGFP-fluorescens i rhabdomeres av vattennedsänkningsmikrografer, justera ImageJ-inställningarna genom att klicka på Analysera, sedan Ange mätningar och markera endast rutan för Genomsnittligt grått värde.Importera tif-bilden genom att klicka på Arkiv och sedan på Öppna. Välj en representativ region i bilden i fokus och förstora den till 200 till 300 % genom att upprepade gånger trycka på Control och tillsammans. Välj sedan det ovala verktyget, och medan du trycker på Shift-tangenten genererar du ett cirkulärt urval i bilden som är betydligt mindre än en fluorescerande rhabdomere.Leta sedan efter den exakta storleken som visas under verktygsfältet i ImageJ-huvudfönstret. Om du vill mäta fluorescensintensiteterna inom det cirkulära valet flyttar du cirkeln till den första rhabdomeren med piltangenterna på tangentbordet och klickar på Analysera och sedan på Mät. Ett resultatfönster med det uppmätta grå värdet dyker upp.Fortsätt med mätningar av rhabdomeres två till sex, och mät även bakgrundssignalen. När det gäller icke-pigmenterade flugor, gör ytterligare mätningar av motsvarande cellkroppsområden. Mät fluorescensen hos ytterligare två ommatidier, vilket resulterar i tre tekniska replikat.Markera den analyserade ommatidien med hjälp av pennverktyget och spara den här bilden för dokumentation. Välj och kopiera de uppmätta grå värdena från resultatfönstret och klistra in dem i kalkylarksprogram för ytterligare beräkningar. Sortera fluorescensintensitetsvärdena enligt deras ursprung i kategorierna rhabdomere, cellkropp och bakgrund och beräkna medelintensiteten från varje kategori.Beräkna sedan den relativa mängden eGFP som finns i rhabdomere med hjälp av den första formeln för icke-pigmenterade ögon och den andra för pigmenterade ögon. Alternativt, för att kvantifiera ögonmorfologi med eGFP-fluorescens i vattennedsänkningsmikrografer, välj tre intilliggande ommatidier i en representativ region av bilden som är i fokus. Utvärdera de 18 rabdomererna i urvalet individuellt enligt deras eGFP-intensitet, kantskärpa och kontrast med avseende på den omgivande bakgrundssignalen.Slutligen, poängsätt de tydligt synliga rhabdomeres med ett värde av två, veckovisa synliga rhabdomeres med ett värde av en och frånvarande rhabdomeres med ett värde av noll för att generera ett degenerationsindex. I transgena Drosophila-flugor som uttrycker ett eGFP TRPL-fusionsprotein försvinner rabdomeral fluorescens i ljus på grund av translokation av eGFP TRPL. Detta gör det möjligt att utföra en genetisk skärm för att identifiera mutanter som är defekta i internaliseringen av eGFP TRPL.I kontrollflugor translokerar eGFP TRPL ut ur rhabdomererna till cellkroppen efter 16 timmars belysning, vilket resulterar i en signifikant minskning av rabdomeral fluorescens jämfört med det mörkanpassade tillståndet. Den andra mörka inkubationen höjer rabdomeral fluorescens igen mot det ursprungliga värdet. I TRPL-translokationen defekt mutant vps35MH20 förändras emellertid fluorescensmönstret inte drastiskt efter 16 timmars belysning och en efterföljande mörk anpassning i 24 timmar.Denna kvantifieringsmetod kan upptäcka en statistiskt mycket signifikant återvinningsdefekt. Vitögda flugor möjliggör detektering av fluorescenssignaler från både rhabdomere och cellkropp. Däremot är fluorescenssignaler hos rödögda flugor endast detekterbara i rabdomeres men inte i cellkroppen.När det gäller kvantifiering av retinal degeneration kan eGFP TRP-fluorescens bedömas under flera veckor. När det hölls i en 12-timmars ljus, 12-timmars mörk cykel i två veckor, minskade degenerationsindexet i mutanta flugor men inte i kontrollflugor. I detta protokoll måste man skilja mellan pigmenterade och icke-pigmenterade ögon.Eftersom pigmentering påverkar den fluorescerande signalen har kvantitativ vattennedsänkningsmikroskopi optimerats för båda fallen individuellt. DPP-avbildning och vattennedsänkningsmikroskopi är metoder med hög genomströmning med begränsad upplösning. För att undersöka subcellulär lokalisering rekommenderar vi immunofluorescensmikroskopi på vävnadssektioner.För en detaljerad analys av degenerativa fenotyper kan elektronmikroskopi utföras.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Studera Aggression i Drosophila (fruktflugor)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliserande Membrane proteiner för strukturbestämning med Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Kristallisering av membranproteiner i Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay-analys: Ett protokoll till Test Interaktion mellan lösliga och olösliga proteiner In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studera Mitotisk Checkpoint genom att illustrera Dynamic kinetochore Protein beteende och kromosomer Motion i levande<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytiala Embryon

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Användning av en robot för hög kapacitet Kristallisering av membranproteiner i lipidisk mesofaser

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Avverkning och Cryo-kylning Kristaller av membranproteiner som odlas i lipida mesofaser för strukturbestämning genom Makromolekylär kristallografi

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital Mikroskopi för Imaging subcellulära strukturer i levande möss som uttrycker fluorescerande proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Den Tomat / GFP-FLP / FRT Metod för Live avbildning av Mosaic vuxen<em&gt; Drosophila</em&gt; ljusmätare celler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...