Name: studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

Yıllar boyunca öğrenci araştırmacılarımıza teşekkür ederiz. Özellikle, verileri bu protokolde temsili sonuçlar olarak kullanılan Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim ve Laura Jaggy. Burada sunulan grubumuzun araştırması, Deutsche Forschungsgemeinschaft'tan (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) Armin Huber'e yapılan hibelerle finanse edildi.

1. Genel hususlar
<ol><li>Morfolojik analiz için kalıcı rabdomeral olarak yerleştirilmiş bir floresan proteinini ifade eden Drosophila stoklarını kullanın (örneğin, TRP::eGFP, eGFP::NINAC) ve protein kaçakçılığı ile ilgili analizler için proteinleri yer değiştiren (örneğin, TRPL::eGFP, Arr2::eGFP).</li>
	<li>Deneysel yaklaşım için seçilen sineklerin ışığa maruz kalma koşullarını önceden belirleyin.<ol>
<li>Karanlık adaptasyon için, sinekleri 25 ° C'de istene...

<ol>
	<li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration.">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).</li><li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina.">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li><li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila.">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pfl&#252;gers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li><li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration:+lessons+from+the+fly.">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li><li>B&#228;hner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current.">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li><li>Cronin, M. A., Lieu, M. -. H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors.">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li><li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade.">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, 2592-2603 (2006).</li><li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin.">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li><li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum.">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li><li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+ph&#233;nom&#233;nes+de+pseudopupille+dans+l'oeil+compose+de+Drosophila.">Les ph&#233;nom&#233;nes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li><li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia.">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li><li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system.">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li><li>Meyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+light-dependent+translocation+of+the+ion+channel+TRPL+in+the+photoreceptors+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer.+nat.">Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2005).</li><li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., D&#252;rr, T. D., Sch&#228;fer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL.">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li><li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye.">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li><li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability.">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li><li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila.">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).</li><li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila.">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li><li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice.">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li><li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila.">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).</li><li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).</li><li>Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+TRP+ion+channels+in+the+photoreceptor+cells+of+Drosophila+melanogaster:+Dissertation+for+obtaining+the+academic+degree+Dr.+rer,+nat.">Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat.</a> University of Karlsruhe (TH). , (2007).</li><li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila.">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li><li>Hardie, R. C., Liu, C. -. H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors.">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li><li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4,5+bisphosphate+(PIP2)+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors.">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).</li></ol>

Floresan proteinlerinin uygulanabilirliği, DPP görüntüleme ve retinal su daldırma mikroskobu ile taramanın basitliği birçok grup tarafından başarılı olduğu kanıtlanmıştır12. Burada sunulanlara benzer stratejiler, Rh1::eGFP 17,18,19,20,21 yardımıyla rodopsin ekspresyon seviyeleri, homeostaz, retinal organizasyon veya hücresel b...

Proteinleri plazma zarına ve plazma zarından uzaklaştırarak, nöronlardaki membran proteini kaçakçılığı, plazma zarı ekipmanını reseptörlerin yanı sıra iyon kanallarıyla kontrol eder ve sonuç olarak nöronal fonksiyonu düzenler. Protein kaçakçılığındaki yanlış düzenleme veya kusurlar tipik olarak hücreler üzerinde zararlı etkilere sahiptir ve nöronal dejenerasyona neden olur. İnsanlarda bu, Alzheimer ve Parkinson hastalığı veya Retinitis pigmentosa1 gibi nörodejeneratif hastalıklara neden olabilir. Drosophila melanogaster'in bileşik gözündeki fotoreseptörler, membran proteini kaçakçılığını incelemek için in vivo bir model sistemi haline gelmiştir2. Bu sadece etkili genetik taramalara izin veren Drosophila'nın genetik çok yönlülüğünden değil, aynı zamanda ışık emici fotoreseptör membranın tüm temel bileşenlerinin çok ayrıntılı bir şekilde karakterize edilmesinden ve sinek gözüne uygulanabilecek verimli mikroskobik tekniklerin mevcut olmasından kaynaklanmaktadır. Bu teknikler bu makalenin odak noktasıdır.
Drosophila fotoreseptör hücrelerinde, apikal plazma zarı, hücrenin bir tarafı boyunca rabdomere adı verilen yoğun bir şekilde paketlenmiş bir mikrovillus yığını oluşturur. Fotoreseptör hücreler R1-6'nın rabdomerleri karakteristik bir yamuk paterninde düzenlenirken, fotoreseptör hücreleri R7 ve R8 bu yamuk3'ün merkezinde tek bir rabdomere oluşturur. Membran proteini kaçakçılığı, rabdopsin ve ışıkla aktive edilen TRP (geçici reseptör potansiyeli) ve TRPL (TRP benzeri) iyon kanalları gibi rabdomeral membran proteinlerinin düzenlenmiş bir devri için, rabdomaverdeki bu fototransdüksiyon proteinlerinin uygun miktarını sağlamak için gereklidir. Fotoreseptör membran proteinleri endoplazmik retikulumda sentezlenir ve Golgi aparatı aracılığıyla rabdomere taşınır. Rodopsinin ışıkla aktivasyonunu takiben, bir rodopsin molekülü ya ikinci bir fotonun emilimi ile inaktive olabilir ya da klatrin aracılı endositoz ile rabdomere'den çıkarılabilir. Endositozlu rodopsin lizozomda bozulur veya rabdomere 4,5'e geri dönüştürülür. İyon kanalı TRPL, fototransdüksiyon kaskadının aktivasyonunu takiben de içselleştirilir ve rabdomere (sinekler karanlıkta tutulduğunda bulunduğu yer) ile hücre gövdesindeki ER ile zenginleştirilmiş bir saklama bölmesi (aydınlatmadan sonra birkaç saat içinde taşındığı) arasında ışığa bağımlı bir translokasyona uğrar6,7,8,9,10 . Endositozlu rodopsinin aksine, endolizozomal yol yoluyla sadece az miktarda TRPL parçalanır ve çoğunluğu hücre içi olarak depolanır ve karanlık adaptasyon6 üzerine rabdomere geri dönüştürülür. TRPL böylece plazma membran proteinlerinin ışıkla tetiklenen trafiğini analiz etmek için kullanılabilir. Drosophila fotoreseptör hücreleri ayrıca nöronal dejenerasyonu incelemek için de kullanılır. Fotoreseptör hücre dejenerasyonu sıklıkla dejeneratif süreçlerin bir sonucu olarak parçalanan rabdomerlerin yapısının değerlendirilmesiyle belirlenir5.
Fotoreseptör hücrelerde TRPL ve rodopsinin hücre altı lokalizasyonunu veya fotoreseptör hücre dejenerasyonunu incelemek için, analiz hızı ve çözünürlüğü açısından farklılık gösteren iki floresan mikroskopi yöntemi burada uygulanmıştır. Genetik ekranlar için kullanılabilecek, ancak sınırlı bir uzamsal çözünürlüğe sahip çok hızlı, invaziv olmayan bir yöntem, derin psödopupilla (DPP) floresan tespitidir. DPP, geometrik kökeni Franceschini ve Kirschfeld tarafından 1971'de ayrıntılı olarak açıklanan eklembacaklı bileşik gözlerin optik bir fenomenidir11. Kısacası, retina kaplamasının altındaki birkaç optik düzlemde, bitişik ommatidiadan rabdomerlerin görüntüleri gözlenebilir. Gözün eğriliğinin merkezinden geçen bir odak düzleminde, üst üste binen bu projeksiyonlar, tek bir ommatidiyumda rabdomerlerin yamuk düzenine benzeyen bir görüntü oluşturur. Bu fenomen, floresan proteinlerinin (örneğin TRPL::eGFP8) eksojen ekspresyonundan bağımsız olarak da gözlemlenebilir, bu da DPP'nin tespit edilmesini kolaylaştırır (Şekil 1A-A'')12. İkinci bir non-invaziv yöntem, gözlerin diyoptrik aparatını suyla optik olarak nötralize ettikten sonra floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin görüntülenmesine dayanan su daldırma mikroskopisidir (Şekil 1B-C '')12. Suya daldırma yöntemi kullanılarak, rabdomerlerdeki veya hücre gövdesindeki göreceli TRPL::eGFP miktarı, bireysel fotoreseptör hücreler için kantitatif olarak değerlendirilebilir. Ayrıca, yer değiştirmeyen floresan etiketli proteinler, rabdomeral bütünlüğü değerlendirmek ve burada açıklandığı gibi potansiyel bir dejenerasyonun zaman seyrini nicel bir şekilde belirlemek için kullanılabilir.
DPP'nin kayıtları, bu yöntemlerin gerçekleştirilmesi en kolay ve en hızlısı olsa da, ürettikleri verilerin uzamsal çözünürlüğü sınırlıdır. Ek olarak, bir DPP'nin bulunmamasının birçok nedeni vardır, bunlar DPP görüntülemenin kendisi tarafından mutlaka fark edilemez. DPP birkaç ommatidinin toplamını temsil ettiğinden, bireysel hücreler hakkındaki bilgiler kaybolur. Bu nedenle, düşük çözünürlüklü DPP görüntüleme, çok sayıda sineğin taranmasında önemli bir işlev görür, ancak genellikle suya daldırma mikroskobu yoluyla daha yüksek çözünürlüklü kayıtlar tarafından takip edilmelidir. Suya daldırma mikrografları, bireysel hücreler, gelişimsel kusurlar, göz morfolojisi, protein yanlış lokalizasyonu veya retina dejenerasyonu hakkında yorumlara ve bu etkilerin nicelleştirilmesine izin verir. Bu Protokol bu iki tekniği ayrıntılı olarak açıklamaktadır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> Şekil 1: Bu Protokolde sunulan Drosophila gözü için mikroskopi varyasyonlarına genel bakış. (A-A'') floresan derin psödopupil (DPP) görüntüleme, (B-B'') floresan rabdomerlerin ölümcül suya daldırma mikroskobu ve (C-C'') floresan rabdomerlerin ölümcül olmayan su damlası mikroskopisinin şematik gösterimleri ve örnek mikrografları. Ölçek çubuğu (A''): 100 μm. Ölçek çubukları (B''-C''): 10 μm. Şekil referans13'ten değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 anaesthesia fly pad</td>
			<td>Flystuff</td>
			<td>59-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light lamp (KL 1500 LCD)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) 
			[1750 Lux, Ee470nm = 298 &#181;W cm-2, Ee590nm = 215 &#181;W cm-2] 
			and [760 Lux, Ee470nm = 173 &#181;W cm-2, Ee590nm = 147 &#181;W cm-2]</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300518039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pipette (20-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Object slide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0656.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Labsolute</td>
			<td>7695844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine (Blu-Tack)</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>30811745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope (SMZ445)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying membrane protein trafficking in drosophila photoreceptor cells using egfp-tagged proteins

Membran proteini kaçakçılığı, reseptörlerin ve iyon kanallarının plazma zarına dahil edilmesini ve uzaklaştırılmasını düzenler. Bu süreç, nöronların hücre fonksiyonu ve hücre bütünlüğü için temel olarak önemlidir. Drosophila fotoreseptör hücreleri, membran protein kaçakçılığını incelemek için bir model haline gelmiştir. Aydınlatma üzerine fotoreseptör zarından içselleştirilen ve parçalanan rodopsinin yanı sıra, Drosophila'daki geçici reseptör potansiyeli benzeri (TRPL) iyon kanalı, rabdomeral fotoreseptör membranı (karanlıkta bulunduğu yer) ile fotoreseptör hücre gövdesi (aydınlatma üzerine taşındığı) arasında ışığa bağımlı bir translokasyon sergiler. TRPL'nin bu hücre içi transportu, fotoreseptör hücrelerinde eGFP etiketli TRPL'yi eksprese ederek basit ve invaziv olmayan bir şekilde incelenebilir. eGFP floresansı daha sonra derin psödopupilde veya suya daldırma mikroskobu ile gözlemlenebilir. Bu yöntemler, sağlam gözde floresan tespitine izin verir ve bu nedenle TRPL translokasyonunda kusurlu Drosophila mutantları için yüksek verimli testler ve genetik ekranlar için yararlıdır. Burada, sineklerin hazırlanması, mikroskobik teknikler ve TRPL'nin bu ışıkla tetiklenen translokasyonunu incelemek için kullanılan niceleme yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bu yöntemler, rodopsin gibi diğer Drosophila fotoreseptör proteinleri üzerindeki kaçakçılık çalışmaları için de uygulanabilir. Ek olarak, eGFP etiketli rabdomeral proteinler kullanılarak, bu yöntemler fotoreseptör hücrelerinin dejenerasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir.

Transgenik Drosophila sinekleri bir TRPL::eGFP füzyon proteinini eksprese ederek rodopsin 1 promotörünün kontrolü altında üretilmiştir. Bu sineklerde, TRPL::eGFP, bileşik gözün fotoreseptör hücreleri R1-6'da eksprese edilir ve ışığa bağımlı bir lokalizasyon gösterir. Sinekler karanlıkta tutulduğunda, TRPL::eGFP dış rabdomerlere dahil edilir. Birkaç saat aydınlatıldıktan sonra, TRPL, ER ile zenginleştirilmiş bir bölmede saklandığı hücre gövdesine taşınır. ...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins at JoVE.com

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Burada, fotoreseptör membran proteinlerinin lokalizasyonu ve eGFP floresan kullanılarak Drosophila bileşik gözünde retinal dejenerasyonun değerlendirilmesi için non-invaziv yöntemler tanımlanmıştır.

eGFP Etiketli Proteinler Kullanarak Drosophila Fotoreseptör Hücrelerinde Membran Protein Kaçakçılığının İncelenmesi

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

GFP etiketli fotoreseptör proteinleri, iyon kanalı TRPL GFP gibi, invaziv olmayan teknikler kullanarak nöronlardaki protein taşınımını incelememize izin verir. Bu yöntem fotoreseptör dejenerasyonunu izlemek için de kullanılabilir. Böylece, insanlarda körlükle sonuçlanan kalıtsal hastalıkların moleküler temeli Drosophila gözünde incelenebilir.GFP etiketli proteinlerin hücresel lokalizasyonu, derin psödopupildeki floresan gözlenerek veya suya daldırma mikroskobu ile değerlendirilebilir. Her iki yöntem de görsel proteinlerin lokalizasyonunun hızlı bir şekilde belirlenmesine ve fotoreseptör hücrelerin dejenerasyonuna bağlı olarak rabdomerlerin yapısal kusurlarının gözlemlenmesine izin verir. Yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için en önemli husus sinek gözünün oryantasyonudur.Bu tekniği uygularken, gözün çevresine doğru hafifçe yerleştirilmiş ommatidiye odaklanılmalıdır. DPP görüntüleme prosedürünü göstereceğim, su daldırma mikroskobu kullanan iki teknik meslektaşım Dr. Krystina Wagner ve grubumuzdaki doktora öğrencisi Matthias Zeger tarafından gösterilecek. Derin psödopupille veya DPP'ye başlamak için, görüntüleme, bir ila üç günlük sinekleri uyuşturun ve bunlardan birini mikroskop hedefinin ortasına yan tarafına yerleştirin, böylece sol veya sağ göz hedefe tam olarak radyal olarak bakar.Tüm göze uyacak şekilde büyütmeyi artırın ve gözün merkezi ommatidisini ortalayın. Mümkünse, çift iris diyaframını sığ bir ayara ayarlayarak mikroskopun alan derinliğini azaltın. Ardından, mikroskop UV lambasını maksimum yoğunlukta açın.Ardından, mikroskopun floresan filtre setini gözlerde ifade edilen floresan proteinine göre seçin ve mikroskopa monte edilmiş kameraya doğru ışık yolunu ayarlayın. Yazılımdaki canlı görüntüleme özelliğini kullanarak, görüntü parlaklığını, pozlama süresini artırarak ve değer kazanarak gözden yalnızca belirli sinyalleri algılayan bir ayara ayarlayın. DPP'nin üst üste binmiş görüntüsünü oluşturmak için mikroskop odağını göze yeniden ayarlayın.Ardından, floresan DPP'nin anlık görüntüsünü alın. Ölümcül bir varyasyonda bir sinek hazırlamak için, bir parça Plasticine'i bir nesne slaytına ve başka bir parçayı bir Petri kabının ortasına yapıştırın. Petri kabını buzla soğutulmuş damıtılmış su ve biraz buz gevreği ile doldurun.Ardından, Plasticine kaplı nesne slaytının üzerine stereo mikroskop altında bir buz anestezili sinek koyun. Sineği sırtına çevirin ve göğüs kafesinin ortasından bir böcek iğnesini delin. Pimi Hamuru kaplı nesne slaydına yatay olarak sabitleyin ve sineğin sol veya sağ gözünü yukarı doğru yönlendirin.Ardından, nesne kızağını Petri kabında Plasticine içermeyen tarafı aşağı bakacak şekilde dikkatlice sabitleyin ve sinek kafasının dönmesini önleyin. Sinek gözünün suyla kaplı olduğundan emin olun. Alternatif olarak, ölümcül olmayan bir varyasyonda bir sinek hazırlamak için, buz anestezisi yapılan sinek kafasını önce 200 mikrolitrelik bir pipet ucuna aktarın ve sineği basınçlı hava ile uca doğru dikkatlice itin.Daha sonra, bir neşter kullanarak, pipet ucunu başın hemen önünde kesin ve cımbız kullanarak sineği pipet ucuna birkaç milimetre dikkatlice itin. Pipet ucunu tekrar kesin ve sineği basınçlı hava ile uca doğru geri itin, böylece sineğin başı pipet ucundan sadece baş çıkıntı yapar. Bir parça Plasticine'i bir nesne slaytına yapıştırdıktan sonra, pipet ucunu sol veya sağ göz yukarı bakacak şekilde içine bastırın.Gözün mikroskop altında doğru yönlendirildiğinden emin olun. Görüntü alma için, suya daldırma hedefi seçin. Ölümcül olmayan bir varyasyon durumunda, suya daldırma hedefinin alt tarafına büyük bir damla soğutulmuş su yapıştırmak için bir laboratuvar pipeti kullanın.Nesne slaytını hazırlanan sinekle mikroskop aşamasına dikkatlice yerleştirin. Ardından, suya daldırma hedefini su yüzeyine temas edene veya sineğin gözü damlaya dokunana kadar manuel olarak indirin. Ardından, ışık yolunu mikroskop kamerasına doğru değiştirin ve canlı bir görüntü oluşturun.Kamera için odağı yeniden ayarlayın ve gözün mikroskop hedefine radyal olarak bakması gerektiğini düşünerek gözün yönünü değerlendirin. Aşırı doygunluğu algılamak için arama tablosu yazılımını kullanın. Pigmentli olmayan sinekler söz konusu olduğunda, pozlama süresini, en parlak pikseller her görüntü için doygunluk sınırının hemen altında olacak şekilde ayarlayın.Bir görüntü kaydedin ve kaydın ilgili tüm meta verilerini arşivlemek için ham dosya olarak kaydedin. Ardından, görüntüyü tif biçiminde dışa aktarın. Suya daldırma mikrograflarının rabdomerlerindeki göreceli eGFP floresansını ölçmek için, Analiz Et'e tıklayarak ImageJ ayarlarını yapın, ardından Ölçümleri Ayarla'ya tıklayın ve yalnızca Ortalama gri değer kutusunu işaretleyin.tif görüntüsünü Dosya'ya ve ardından Aç'a tıklayarak içe aktarın. Odaktaki görüntünün temsili bir bölgesini seçin ve Kontrol tuşuna art arda basıp birlikte basarak görüntüyü %200 ila %300 arasında büyütün. Ardından, Oval aracı seçin ve Shift tuşuna basarken görüntüde bir floresan rabdomerden önemli ölçüde daha küçük olan dairesel bir seçim oluşturun.Ardından, ImageJ ana penceresindeki araç çubuğunun altında görüntülenen tam boyutu arayın. Dairesel seçimdeki floresan yoğunluklarını ölçmek için, klavyedeki ok tuşlarıyla daireyi ilk rabdomere taşıyın ve Analiz Et'i, ardından Ölç'ü tıklayın. Ölçülen gri değeri listeleyen bir sonuç penceresi açılır.İki ila altı rabdomer ölçümlerine devam edin ve ayrıca arka plan sinyalini ölçün. Pigmentli olmayan sinekler durumunda, ilgili hücre vücut alanlarının ek ölçümlerini yapın. İki ommatidianın daha floresansını ölçün, bu da üç teknik kopya ile sonuçlanır.Kurşun Kalem aracını kullanarak analiz edilen ommatidiayı işaretleyin ve bu görüntüyü belgeler için kaydedin. Sonuç penceresinden ölçülen gri değerleri seçip kopyalayın ve daha fazla hesaplama için bunları elektronik tablo yazılımına yapıştırın. Floresan yoğunluk değerlerini kökenlerine göre rabdomere, hücre gövdesi ve arka plan kategorilerine göre sıralayın ve her kategoriden ortalama yoğunluğu hesaplayın.Daha sonra, pigmentli olmayan gözler için ilk formülü ve pigmentli gözler için ikincisini kullanarak rabdomerede bulunan göreceli eGFP miktarını hesaplayın. Alternatif olarak, suya daldırma mikrograflarında eGFP floresansı ile göz morfolojisini ölçmek için, odakta olan görüntünün temsili bir bölgesinde üç bitişik ommatidia seçin. Seçimin 18 rabdomerini eGFP yoğunluğuna, kenar keskinliğine ve çevresindeki arka plan sinyaline göre kontrastına göre ayrı ayrı değerlendirin.Son olarak, açıkça görülebilen rabdomerleri iki değerle, haftalık görünür rabdomerleri bir değerle ve eksik rabdomerleri sıfır değeriyle bir dejenerasyon indeksi oluşturmak için puanlayın. Bir eGFP TRPL füzyon proteinini eksprese eden transgenik Drosophila sineklerinde, rabdomeral floresan, eGFP TRPL'nin translokasyonu nedeniyle ışıkta kaybolur. Bu, eGFP TRPL'nin içselleştirilmesinde kusurlu mutantları tanımlamak için genetik bir tarama yapılmasına izin verir.Kontrol sineklerinde, eGFP TRPL, 16 saatlik aydınlatmadan sonra rabdomerlerden hücre gövdesine geçer ve bu da karanlığa adapte olmuş duruma kıyasla rabdomeral floresansta önemli bir azalmaya neden olur. İkinci karanlık inkübasyon, rabdomeral floresanı tekrar başlangıç değerine doğru yükseltir. Bununla birlikte, TRPL translokasyon kusurlu mutant vps35MH20'de, floresan paterni 16 saatlik aydınlatmadan ve ardından 24 saat boyunca karanlık bir adaptasyondan sonra büyük ölçüde değişmez.Bu niceleme yöntemi, istatistiksel olarak oldukça anlamlı bir geri dönüşüm kusurunu tespit edebilir. Beyaz gözlü sinekler, hem rabdomere hem de hücre gövdesinden gelen floresan sinyallerinin algılanmasını sağlar. Buna karşılık, kırmızı gözlü sineklerde, floresan sinyalleri sadece rabdomerlerde tespit edilebilir, ancak hücre gövdesinde tespit edilemez.Retina dejenerasyonunun miktarıyla ilgili olarak, eGFP TRP floresansı birkaç hafta boyunca değerlendirilebilir. İki hafta boyunca 12 saatlik bir ışıkta, 12 saatlik karanlık döngüde tutulduğunda, dejenerasyon indeksi mutant sineklerde azaldı, ancak kontrol sineklerinde azalmadı. Bu protokolde, pigmentli ve pigmentsiz gözler arasında ayrım yapmak gerekir.Pigmentasyon floresan sinyalini etkilediğinden, kantitatif su daldırma mikroskobu her iki durum için ayrı ayrı optimize edilmiştir. DPP görüntüleme ve suya batırma mikroskobu, sınırlı çözünürlüğe sahip yüksek verimli yöntemlerdir. Subsellüler lokalizasyonu araştırmak için, doku kesitlerinde immünofloresan mikroskopiyi öneriyoruz.Dejeneratif fenotiplerin ayrıntılı bir analizi için elektron mikroskobu yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Drosophila (meyve sineği) Saldırganlık incelenmesi

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptör Hücreler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...