Name: simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy
Uploaded: 2022-02-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة (رقم 1DP2GM126894-01) ، وبأموال من صناديق بيو الخيرية ومؤسسة عائلة سميث إلى R.S. يشكر المؤلفون الدكتور شو جيانغ على مساهمته في تطوير وتحسين البروتوكولات.

1. إعداد الكواشف
<ol><li>إعداد المخازن المؤقتة والكواشف على النحو المبين في الجدول 1 والجدول 2. أثناء التجربة ، احتفظ بجميع الحلول على الجليد ، ما لم يذكر خلاف ذلك.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>حل</td>
			<td colspan="2">مكونات</s...

<ol>
	<li>Subramanian, R., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+complexity:+insights+into+self-organized+assembly+of+microtubule-based+architectures.">Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures.</a> Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+determine+and+maintain+Drosophila+bristle+shape.">Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape.</a> Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).</li><li>Foe, V. E., von Dassow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+shape+the+myosin+activation+zone+during+cytokinetic+furrow+formation.">Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).</li><li>Pous, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specialization+of+stable+and+dynamic+microtubules+in+protein+traffic+in+WIF-B+cells.">Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells.</a> The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).</li><li>Uehara, R., Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+central+spindle+assembly+requires+de+novo+microtubule+generation+in+the+interchromosomal+region+during+anaphase.">Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+microtubule+plus-end+tracking+system+in+vitro.">Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro.</a> Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+pushing+and+braking+forces+generated+by+ensembles+of+Kinesin-5+crosslinking+two+microtubules.">Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules.</a> Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).</li><li>Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+single+microtubules+and+bundles+by+a+three-protein+module.">Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module.</a> Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).</li><li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTP+hydrolysis+in+microtubule+dynamics:+information+from+a+slowly+hydrolyzable+analogue,+GMPCPP.">Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).</li><li>Subramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+antiparallel+microtubule+crosslinking+by+PRC1,+a+conserved+nonmotor+microtubule+binding+protein.">Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein.</a> Cell. 142 (3), 433-443 (2010).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Wijeratne, S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+of+antiparallel+microtubule+bundles+regulates+relative+sliding+and+stalling+by+PRC1+and+Kif4A.">Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A.</a> eLife. 7, 32595 (2018).</li><li>Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+geometrical+features+of+microtubules+as+regulators+of+microtubule+organization.">Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization.</a> eLife. 10, 63880 (2021).</li><li>Freal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-driven+assembly+of+the+axon+initial+segment.">Feedback-driven assembly of the axon initial segment.</a> Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).</li><li>Ledbetter, M., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;microtubule&amp;#34;+in+plant+cell+fine+structure.">A &amp;#34;microtubule&amp;#34; in plant cell fine structure.</a> The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).</li><li>Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+reveals+distinct+protofilament-scale+structural+dynamics+in+depolymerizing+microtubule+arrays.">Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).</li></ol>

توسع التجربة الموصوفة هنا بشكل كبير نطاق وتعقيد اختبارات إعادة تشكيل الأنابيب الدقيقة التقليدية ، والتي يتم إجراؤها تقليديا على الأنابيب الدقيقة المفردة أو على نوع واحد من الصفيف. يوفر الفحص الحالي طريقة لتحديد ومقارنة نشاط MAP التنظيمي في وقت واحد على مجموعتين سكانيتين ، وهما الأنابيب ا?...

الأنابيب الدقيقة هي بوليمرات حيوية تشكل سقالات هيكلية ضرورية لعمليات خلوية متعددة ، تتراوح من النقل داخل الخلايا وتحديد مواقع العضيات إلى انقسام الخلايا واستطالتها. لتنفيذ هذه الوظائف المتنوعة ، يتم تنظيم الأنابيب الدقيقة الفردية في صفائف بحجم ميكرون ، مثل المغزل الانقسامي ، والمحاور الهدبية ، والحزم العصبية ، والمصفوفات بين الأطوار ، والمصفوفات القشرية النباتية. ومن الزخارف المعمارية المنتشرة في كل مكان الموجودة في هذه الهياكل مجموعة من الأنابيب الدقيقة المتشابكة على طول أطوالها1. ومن السمات المثيرة للاهتمام للعديد من الهياكل القائمة على الأنابيب الدقيقة التعايش بين الأنابيب الدقيقة المجمعة والأنابيب الدقيقة المفردة غير المتقاطعة في مكان قريب. يمكن لهذه المجموعات الفرعية من الأنابيب الدقيقة أن تعرض ديناميكيات بلمرة مختلفة بشكل صارخ عن بعضها البعض ، حسب الحاجة لوظيفتها المناسبة2،3،4،5. على سبيل المثال، داخل المغزل الانقسامي، توجد حزم متقاطعة مستقرة وأنابيب دقيقة مفردة ديناميكية داخل منطقة على نطاق ميكرون في مركز الخلية6. وبالتالي ، فإن دراسة كيفية تحديد الخصائص الديناميكية لمجموعات الأنابيب الدقيقة المتعايشة أمر أساسي لفهم تجميع ووظيفة الهياكل القائمة على الأنابيب الدقيقة.
الأنابيب الدقيقة هي بوليمرات ديناميكية تدور بين مراحل البلمرة وإزالة البلمرة ، وتنتقل بين المرحلتين في الأحداث المعروفة باسم الكارثة والإنقاذ7. يتم تنظيم ديناميكيات الأنابيب الدقيقة الخلوية من خلال عدد لا يحصى من البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة (MAPs) التي تعدل معدلات بلمرة الأنابيب الدقيقة وإزالة البلمرة وترددات أحداث الكوارث والإنقاذ. ومن الصعب التحقيق في نشاط MAPs على المصفوفات القريبة مكانيا في الخلايا، بسبب محدودية الاستبانة المكانية في الفحص المجهري الضوئي، وخاصة في المناطق ذات الكثافة العالية للأنابيب الدقيقة. علاوة على ذلك ، فإن وجود MAPs متعددة في نفس المنطقة الخلوية يعيق تفسيرات الدراسات البيولوجية الخلوية. تعمل فحوصات إعادة التشكيل في المختبر ، التي يتم إجراؤها بالاقتران مع الفحص المجهري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF) ، على التحايل على تحديات فحص الآليات التي تنظم من خلالها مجموعات فرعية محددة من MAPs ديناميكيات صفائف الأنابيب الدقيقة الخلوية القريبة. هنا ، يتم فحص ديناميكيات الأنابيب الدقيقة التي يتم تجميعها في المختبر في وجود واحد أو أكثر من MAPs المؤتلفة في ظل ظروف خاضعة للرقابة8،9،10. ومع ذلك ، يتم إجراء اختبارات إعادة التشكيل التقليدية عادة على الأنابيب الدقيقة المفردة أو على نوع واحد من الصفيفات ، مما يحول دون تصور السكان المتعايشين.
هنا ، نقدم في المختبر اختبارات إعادة التشكيل التي تمكن من التصور المتزامن لمجموعتين من الأنابيب الدقيقة تحت نفس ظروف الحل 11. نحن نصف طريقة لعرض النشاط الجماعي ل MAPs متعددة في وقت واحد على الأنابيب الدقيقة المفردة وعلى حزم الأنابيب الدقيقة المترابطة بواسطة البروتين المرتبط بالمغزل الانقسامي PRC1. يرتبط البروتين PRC1 بشكل تفضيلي عند التداخل بين الأنابيب الدقيقة المضادة للتوازي ، ويربطها معا9. باختصار ، يتكون هذا البروتوكول من الخطوات التالية: (i) إعداد محاليل المخزون والكواشف ، (ii) تنظيف ومعالجة السطح للأغطية المستخدمة لإنشاء غرفة التصوير لتجارب الفحص المجهري ، (iii) إعداد "بذور" microtubule مستقرة والتي تبدأ منها البلمرة أثناء التجربة ، (iv) مواصفات إعدادات المجهر TIRF لتصور ديناميكيات microtubule ، (v) تجميد بذور microtubule وتوليد حزم microtubule المتشابكة في غرفة التصوير ، و (vi) تصور ديناميكيات الأنابيب الدقيقة في غرفة التصوير من خلال المجهر TIRF ، عند إضافة توبولين قابل للذوبان ، MAPs ، والنيوكليوتيدات. تمكن هذه الفحوصات من التقييم النوعي والفحص الكمي لتوطين MAP وتأثيرها على ديناميكيات مجموعتين من الأنابيب الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تسهل تقييم الآثار التآزرية ل MAPs المتعددة على مجموعات الأنابيب الدقيقة هذه ، عبر مجموعة واسعة من الظروف التجريبية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >238813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18x18 mm #1.5 coverslips&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24x60 mm #1.5 coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >405/488/560/647 nm Laser Quad Band&#160;</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>TRF89901-NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7699-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avidin, NeutrAvidin&#174; Biotin-binding Protein (Molecular Probes&#174;)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Delicate Task Wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET610/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200-proof)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GMPCPP</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>NU-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hellmanex III detergent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion oil, Type A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>77010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kappa-casein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lanolin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microfuge 16 Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90&#176; Ground Edges, WHITE Frosted</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380-50W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000&#160;</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#NH2-PEG-VA-5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optima&#8482; Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraffin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5377-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petrolatum, White</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plasma Cleaner, 115V</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2520-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#8482; Pierce&#8482; Bond-Breaker&#8482; TCEP Solution, Neutral pH; 500mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>PI-77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apochromat TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.1 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>362224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.2 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL620M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTABOND&#174; Reagent, Tissue Section Adhesion</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>SP-1800-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VWR&#174; Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97025-630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy

الأنابيب الدقيقة هي بوليمرات من αβ-tubulin heterodimers التي تنظم في هياكل متميزة في الخلايا. غالبا ما تحتوي المعماريات والشبكات القائمة على الأنابيب الدقيقة على مجموعات فرعية من صفائف الأنابيب الدقيقة التي تختلف في خصائصها الديناميكية. على سبيل المثال ، في تقسيم الخلايا ، تتعايش حزم مستقرة من الأنابيب الدقيقة المتقاطعة على مقربة من الأنابيب الدقيقة الديناميكية غير المترابطة. تمكن دراسات إعادة التشكيل في المختبر القائمة على TIRF المجهري من التصور المتزامن لديناميكيات هذه المصفوفات المختلفة من الأنابيب الدقيقة. في هذا الفحص ، يتم تجميع غرفة التصوير باستخدام الأنابيب الدقيقة المجمدة على السطح ، والتي إما موجودة كخيوط مفردة أو منظمة في حزم متقاطعة. يسمح إدخال التوبولين والنيوكليوتيدات ومنظمات البروتين بالتصور المباشر للبروتينات المرتبطة والخصائص الديناميكية للأنابيب الدقيقة المفردة والمتشابكة. علاوة على ذلك ، يمكن مراقبة التغييرات التي تحدث عندما يتم تنظيم الأنابيب الدقيقة المفردة الديناميكية في حزم في الوقت الفعلي. تسمح الطريقة الموصوفة هنا بإجراء تقييم منهجي لنشاط البروتينات الفردية وتوطينها ، بالإضافة إلى التأثيرات التآزرية لمنظمات البروتين على مجموعتين فرعيتين مختلفتين من الأنابيب الدقيقة في ظل ظروف تجريبية متطابقة ، وبالتالي توفير رؤى ميكانيكية لا يمكن الوصول إليها بطرق أخرى.

تم إجراء التجربة الموصوفة أعلاه باستخدام أنابيب دقيقة بيوتينيل تحمل علامة الفلوروفور 647 نانومتر ، وأنابيب دقيقة غير بيوتينيل تحمل علامة الفلوروفور 560 نانومتر ، ومزيج توبولين قابل للذوبان يحمل علامة الفلوروفور 560 نانومتر. تم ربط الأنابيب الدقيقة بواسطة بروتين الربط المتقاطع PRC1 (المسمى GFP)....

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

هنا ، يتم تقديم فحص إعادة تشكيل مجهري TIRF قائم على المختبر لتحديد ومقارنة ديناميكيات مجموعتين من الأنابيب الدقيقة في وقت واحد. يتم وصف طريقة لعرض النشاط الجماعي للبروتينات المتعددة المرتبطة بالأنابيب الدقيقة في وقت واحد على حزم الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والأنابيب الدقيقة المفردة.

التصور المتزامن لديناميكيات الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والمفردة في المختبر بواسطة مجهر TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

تحتوي صفائف الأنابيب الدقيقة الخلوية على مجموعات فرعية من الأنابيب الدقيقة ذات الخصائص الديناميكية المميزة كما هو مطلوب للوظيفة. يتناول هذا البروتوكول كيف يمنح النشاط الجماعي للمنظمين مجموعات فرعية من الأنابيب الدقيقة القريبة ذات خصائص متميزة. تمكننا عملية الاسترداد هذه من أسفل إلى أعلى من تصور تنظيم وديناميات مجموعات الأنابيب الدقيقة القريبة مثل الأنابيب الدقيقة المفردة والحزم في وقت واحد ، وفك رموز الآليات الكامنة وراء تنظيمها الذاتي.تتطلب إعادة التشكيل متعددة المكونات تحسين المعلمات التجريبية مثل الرقم الهيدروجيني والقوة الأيونية وتركيز البروتين مع الحفاظ على نشاط كل منها. التحليل المنهجي للمكونات الفردية قبل فحوصات البروتين المتعدد مفيد للغاية. للبدء ، ماصة خليط من 4.5 ميكرولتر من BRB ADDTT في ميكرولتر واحد من محلول microtubule على شريحة المجهر.قم بتغطيتها بغطاء 18 × 18 ملم وأغلق الحواف إما بطلاء أظافر شفاف أو مانع تسرب VALAP. ضع هدف TIRF أسفل الغطاء الزجاجي. تصور الأنابيب الدقيقة المبلمرة حديثا بطول موجي مناسب للتوبولين المسمى بالفلورسنت في المزيج الساطع لتحديد تخفيف الأنابيب الدقيقة لاستخدامها في التجارب القادمة.حدد كثافة الليزر للتجربة تجريبيا بحيث تكون جميع البروتينات الفلورية مضاءة ، ولكنها لا تخضع لتبييض ضوئي كبير على مدار فترة التجربة. اضبط درجة حرارة المجهر على 28 درجة مئوية لعرض الأنابيب الدقيقة الديناميكية. استخدم ورق العدسة لتنظيف هدف 100X باستخدام 70٪ من الإيثانول.استخدم أفضل مزيج من مكعبات المرشح ومرشحات الانبعاثات اعتمادا على قنوات الفلورسنت المراد تصويرها. قم بإعداد تسلسل التصوير. لإجراء تجربة مع 647 نانومتر من الأنابيب الدقيقة البيوتينيل الموسومة بالفلوروفور ، و 560 نانومتر من الأنابيب الدقيقة غير البيوتينيل في توبولين القابل للذوبان ، والبروتين المسمى GFP المثير للاهتمام ، قم بتصوير قنوات 488 نانومتر و 560 نانومتر و 647 نانومتر كل 10 ثوان لمدة 20 أي دقيقة.لالتقاط صورة مرجعية للحزم قبل إضافة التوبولين القابل للذوبان والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة ، قم بإعداد تسلسل مع صورة واحدة لكل منها في قنوات الطول الموجي 560 نانومتر و 647 نانومتر. تحقق من موضع شعاع الليزر على السقف فوق المجهر وقم بإجراء تغييرات على الشعاع باستخدام البرنامج. تأكد من محاذاة مصباح الليزر.قبل التصوير ، أضف قطرة من زيت غمر المجهر إلى الهدف. تحضير خليط توبولين القابل للذوبان مع الاحتفاظ به على الجليد وتدوير الخليط. لشل حركة الأنابيب الدقيقة عبر وصلة البيوتين-نيوترافيدين-البيوتين، تدفق أولا في حوالي 7.5 ميكرولتر من محلول نيوترافيدين حتى تمتلئ الغرفة وتحضن لمدة خمس دقائق.يغسل مع 10 ميكرولتر من MB الباردة. تدفق في 7.5 ميكرولتر من البروتين المانع KC وحضانت لمدة دقيقتين. يغسل مع 10 ميكرولتر من MB دافئة لإعداد الغرفة لإدخال microtubules.قم بتخفيف مخزون الأنابيب الدقيقة البيوتينيل في BRB ADDTT وأضف ميكرولتر واحد من هذا التخفيف إلى تسعة ميكرولترات من MB الدافئة. تدفق الخليط إلى الغرفة واحتضان لمدة 10 دقائق. اغسل الأنابيب الدقيقة غير المجمدة مع 10 ميكرولترات من MB الدافئة.تدفق 7.5 ميكرولتر من KC الدافئ إلى الغرفة واحتضان لمدة دقيقتين. أثناء الحضانة ، قم بإعداد محلول نانومولي من الوصلة المتقاطعة أو البروتين PRC1 في KC وقم بتدوير المحلول. تدفق 10 ميكرولترات من هذا المحلول إلى غرفة التصوير واحتضان لمدة خمس دقائق.لصنع حزم ، قم بتدفق 10 ميكرولترات من الأنابيب الدقيقة غير البيوتينيل إلى الغرفة واحتضنها لمدة 10 دقائق. اغسل الغرفة مرتين مع 10 ميكرولتر من MB دافئة. خلال فترة الحضانة التي تبلغ 10 دقائق ، قم بإعداد 10 ميكرولترات من خليط الفحص الذي يحتوي على بروتينات ذات أهمية ، توبولين قابل للذوبان ، نيوكليوتيدات ، زبالة الأكسجين ، ومضادات الأكسدة وقم بتدويرها.حافظ على الخليط على الجليد. قم بتحميل غرفة التصوير المعدة المسجلة على حامل الانزلاق على هدف 100X TIRF. استخدم قنوات 560 نانومتر و 647 نانومتر للعثور على مجال رؤية يحتوي على العدد الأمثل والكثافة من الأنابيب الدقيقة والحزم المفردة.بمجرد تحديد مجال الرؤية، التقط صورة مرجعية. تدفق بعناية في خليط الفحص دون إزعاج غرفة التصوير. أغلق الأطراف المفتوحة للغرفة باستخدام مانع التسرب VALAP.راقب الأنابيب الدقيقة وابدأ تسلسل التصوير. بعد شل حركة بذور الأنابيب الدقيقة وتوليد الحزم ، تم الحصول على صور التألق. تم تحديد الأنابيب الدقيقة المفردة بواسطة إشارة الفلورسنت في قناة 647 نانومتر ، في حين تم تحديد الأنابيب الدقيقة كحزم سابقة التشكيل عندما عرضت إشارات الفلورسنت في كلتا القناتين.تمت دراسة ديناميكيات الأنابيب الدقيقة المفردة وحزم PRC1 المتقاطعة في وجود البروتينات KIF4A و CLASP1 ، والتي كشفت أن الأنابيب الدقيقة المفردة تستطيل على مدار الفحص ، في حين أن نمو الأنابيب الدقيقة المتقاطعة متوقف. احرص على الحفاظ على الأنابيب الدقيقة المبلمرة في درجة حرارة الغرفة أو فوقها. احتفظ بالتوبولين القابل للذوبان على الجليد وقم بحماية غرفة التصوير والأنابيب الدقيقة والبروتينات ذات العلامات الفلورية من الضوء.قدمت هذه الفحوصات نظرة ميكانيكية حول كيفية قيام وحدة البروتين الموجودة في المغزل الانقسامي بتنظيم ديناميكيات مجموعتين مختلفتين من الأنابيب الدقيقة التي تتعايش في المغزل.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

تصوير الحويصلات خارج الخلية عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

تصور سطح T-خلية مستقبلات ديناميات رباعية الأبعاد باستخدام شعرية الضوء ورقة المجهر

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

تصور ديناميات الانتشار من نانورود الذهب على غشاء الخلية باستخدام جسيمات نانوية واحدة Darkfield المجهرية

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

انعكاس التداخل المتزامن والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي لتصوير الأنابيب الدقيقة الديناميكية والبروتينات المرتبطة بها

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

استخدام الموائع الدقيقة والمجهر الفلوري لدراسة ديناميكيات تجميع خيوط وحزم الأكتين المفردة

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

تصور ديناميكيات اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة في المختبر بواسطة المجهر الكلي للتألق الداخلي (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...