Name: simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy
Uploaded: 2022-02-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra NIH (nr. 1DP2GM126894-01) og af midler fra Pew Charitable Trusts og Smith Family Foundation til R.S. Forfatterne takker Dr. Shuo Jiang for hans bidrag til udvikling og optimering af protokollerne.

1. Forbered reagenser
<ol><li>Der fremstilles buffere og reagenser som beskrevet i tabel 1 og tabel 2. Under forsøget skal du holde alle opløsninger på is, medmindre andet er angivet.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Opløsning</td>
			<td colspan="2">Komponenter</td>
			<td>Anbefalet opbevaringsvarighed</td>
			<td colspan="2"><stro...

<ol>
	<li>Subramanian, R., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+complexity:+insights+into+self-organized+assembly+of+microtubule-based+architectures.">Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures.</a> Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+determine+and+maintain+Drosophila+bristle+shape.">Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape.</a> Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).</li><li>Foe, V. E., von Dassow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+shape+the+myosin+activation+zone+during+cytokinetic+furrow+formation.">Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).</li><li>Pous, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specialization+of+stable+and+dynamic+microtubules+in+protein+traffic+in+WIF-B+cells.">Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells.</a> The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).</li><li>Uehara, R., Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+central+spindle+assembly+requires+de+novo+microtubule+generation+in+the+interchromosomal+region+during+anaphase.">Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+microtubule+plus-end+tracking+system+in+vitro.">Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro.</a> Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+pushing+and+braking+forces+generated+by+ensembles+of+Kinesin-5+crosslinking+two+microtubules.">Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules.</a> Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).</li><li>Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+single+microtubules+and+bundles+by+a+three-protein+module.">Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module.</a> Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).</li><li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTP+hydrolysis+in+microtubule+dynamics:+information+from+a+slowly+hydrolyzable+analogue,+GMPCPP.">Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).</li><li>Subramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+antiparallel+microtubule+crosslinking+by+PRC1,+a+conserved+nonmotor+microtubule+binding+protein.">Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein.</a> Cell. 142 (3), 433-443 (2010).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Wijeratne, S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+of+antiparallel+microtubule+bundles+regulates+relative+sliding+and+stalling+by+PRC1+and+Kif4A.">Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A.</a> eLife. 7, 32595 (2018).</li><li>Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+geometrical+features+of+microtubules+as+regulators+of+microtubule+organization.">Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization.</a> eLife. 10, 63880 (2021).</li><li>Freal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-driven+assembly+of+the+axon+initial+segment.">Feedback-driven assembly of the axon initial segment.</a> Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).</li><li>Ledbetter, M., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;microtubule&amp;#34;+in+plant+cell+fine+structure.">A &amp;#34;microtubule&amp;#34; in plant cell fine structure.</a> The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).</li><li>Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+reveals+distinct+protofilament-scale+structural+dynamics+in+depolymerizing+microtubule+arrays.">Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).</li></ol>

Eksperimentet beskrevet her udvider signifikant omfanget og kompleksiteten af konventionelle mikrotubuli rekonstitutionsassays, som traditionelt udføres på enkelte mikrotubuli eller på en type array. Det nuværende assay giver en metode til samtidig at kvantificere og sammenligne den lovgivningsmæssige MAP-aktivitet på to populationer, nemlig enkelte mikrotubuli og tværbundne bundter. Endvidere giver dette assay mulighed for undersøgelse af to typer bundter: dem, der er præ-dannet af stabile frø før indledninge...

Mikrotubuli er biopolymerer, der danner strukturelle stilladser, der er afgørende for flere cellulære processer, lige fra intracellulær transport og organelpositionering til celledeling og forlængelse. For at udføre disse forskellige funktioner er individuelle mikrotubuli organiseret i mikron-størrelse arrays, såsom mitotiske spindler, ciliære axonæer, neuronale bundter, interfase arrays og plante kortikale arrays. Et allestedsnærværende arkitektonisk motiv, der findes i disse strukturer, er et bundt mikrotubuli, der er tværbundet langs deres længder1. Et spændende træk ved flere mikrotubuli-baserede strukturer er sameksistensen af bundtede mikrotubuli og ikke-tværbundne enkeltmikrotubuli i tæt rumlig nærhed. Disse mikrotubuli subpopulationer kan vise stærkt forskellige polymerisationsdynamikker fra hinanden efter behov for deres korrekte funktion2,3,4,5. For eksempel er der inden for den mitotiske spindel stabile tværbundne bundter og dynamiske enkeltmikrotubuli til stede inden for en mikronskalaregion i cellecentret6. At studere, hvordan de dynamiske egenskaber ved sameksisterende mikrotubulipopulationer specificeres, er derfor centralt for at forstå samlingen og funktionen af mikrotubulibaserede strukturer.
Mikrotubuli er dynamiske polymerer, der cykler mellem faser af polymerisation og depolymerisation og skifter mellem de to faser i begivenheder kendt som katastrofe og redning7. Dynamikken i cellulære mikrotubuli reguleres af utallige mikrotubuli associerede proteiner (MAPs), der modulerer hastigheden af mikrotubuli polymerisation og depolymerisering og frekvenserne af katastrofe- og redningshændelser. Det er udfordrende at undersøge aktiviteten af MAPs på rumligt proksimale arrays i celler på grund af begrænsningerne i rumlig opløsning i lysmikroskopi, især i områder med høj mikrotubuli densitet. Desuden hindrer tilstedeværelsen af flere MAPs i samme cellulære region fortolkninger af cellebiologiske undersøgelser. In vitro-rekonstitutionsassays, der udføres i forbindelse med TIRF-mikroskopi (Total Internal Reflection Fluorescence), omgår udfordringerne ved at undersøge mekanismer, hvormed specifikke delmængder af MAPs regulerer dynamikken i proksimale cellulære mikrotubuli arrays. Her undersøges dynamikken i mikrotubuli samlet in vitro i nærvær af en eller flere rekombinante MAPs under kontrollerede forhold8,9,10. Imidlertid udføres konventionelle rekonstitutionsassays typisk på enkelte mikrotubuli eller på en type array, hvilket forhindrer visualisering af sameksisterende populationer.
Her præsenterer vi in vitro-rekonstitutionsassays, der muliggør samtidig visualisering af to mikrotubulipopulationer under de samme løsningsbetingelser11. Vi beskriver en metode til samtidig at se den kollektive aktivitet af flere MAPs på enkelte mikrotubuli og på mikrotubuli bundter tværbundtet af det mitotiske spindel-associerede protein PRC1. Proteinet PRC1 binder fortrinsvis ved overlapningen mellem antiparallelle mikrotubuli og tværbinder dem9. Kort fortalt består denne protokol af følgende trin: (i) fremstilling af stamopløsninger og reagenser, (ii) rengøring og overfladebehandling af dæksedler, der anvendes til at skabe billeddannelseskammeret til mikroskopiforsøg, (iii) fremstilling af stabile mikrotubuli "frø", hvorfra polymerisation initieres under eksperimentet, (iv) specifikation af TIRF-mikroskopindstillinger for at visualisere mikrotubuli dynamik, (v) immobilisering af mikrotubuli frø og generering af tværbundne mikrotubuli bundter i billedkammeret og (vi) visualisering af mikrotubulidynamik i billeddannelseskammeret gennem TIRF-mikroskopi ved tilsætning af opløseligt tubulin, MAPs og nukleotider. Disse assays muliggør kvalitativ evaluering og kvantitativ undersøgelse af MAP-lokalisering og deres virkning på dynamikken i to mikrotubulipopulationer. Derudover letter de evalueringen af synergistiske virkninger af flere MAPs på disse mikrotubulipopulationer på tværs af en lang række eksperimentelle betingelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >238813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18x18 mm #1.5 coverslips&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24x60 mm #1.5 coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >405/488/560/647 nm Laser Quad Band&#160;</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>TRF89901-NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7699-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avidin, NeutrAvidin&#174; Biotin-binding Protein (Molecular Probes&#174;)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Delicate Task Wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET610/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200-proof)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GMPCPP</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>NU-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hellmanex III detergent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion oil, Type A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>77010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kappa-casein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lanolin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microfuge 16 Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90&#176; Ground Edges, WHITE Frosted</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380-50W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000&#160;</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#NH2-PEG-VA-5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optima&#8482; Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraffin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5377-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petrolatum, White</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plasma Cleaner, 115V</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2520-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#8482; Pierce&#8482; Bond-Breaker&#8482; TCEP Solution, Neutral pH; 500mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>PI-77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apochromat TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.1 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>362224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.2 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL620M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTABOND&#174; Reagent, Tissue Section Adhesion</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>SP-1800-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VWR&#174; Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97025-630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy

Mikrotubuli er polymerer af αβ-tubulin heterodimerer, der organiserer sig i forskellige strukturer i celler. Mikrotubulibaserede arkitekturer og netværk indeholder ofte delmængder af mikrotubuli arrays, der adskiller sig i deres dynamiske egenskaber. For eksempel eksisterer stabile bundter af tværbundne mikrotubuli i opdeling af celler i nærheden af dynamiske ikke-tværbundne mikrotubuli. TIRF-mikroskopibaserede in vitro-rekonstitutionsundersøgelser muliggør samtidig visualisering af dynamikken i disse forskellige mikrotubuli-arrays. I dette assay samles et billeddannelseskammer med overfladeimmobiliserede mikrotubuli, som enten er til stede som enkeltfilamenter eller organiseret i tværbundne bundter. Introduktion af tubulin, nukleotider og proteinregulatorer muliggør direkte visualisering af associerede proteiner og af dynamiske egenskaber af enkelt- og tværbundne mikrotubuli. Desuden kan ændringer, der opstår, når dynamiske enkeltmikrotubuli organiseres i bundter, overvåges i realtid. Metoden beskrevet her giver mulighed for en systematisk evaluering af aktiviteten og lokaliseringen af individuelle proteiner samt synergistiske virkninger af proteinregulatorer på to forskellige mikrotubuli under identiske eksperimentelle betingelser, hvorved mekanistisk indsigt, der er utilgængelige ved andre metoder, giver.

Det ovenfor beskrevne eksperiment blev udført under anvendelse af 647 nm fluoroformærkede biotinylerede mikrotubuli, 560 nm fluoroformærkede ikke-biotinylerede mikrotubuli og 560 nm fluorophore-mærket opløselig tubulinblanding. Mikrotubuli blev tværbundet af tværbindingsproteinet PRC1 (GFP-mærket). Efter at overflade-immobiliserede bundter og enkelte mikrotubuli blev genereret (trin 5.11), blev billeddannelseskammeret monteret på et TIRF 100X 1.49 NA oliemål og set i 560 nm og 647 nm fluorescenskanaler. Enkelte...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Her præsenteres et TIRF-mikroskopibaseret in vitro-rekonstitutionsassay for samtidig at kvantificere og sammenligne dynamikken i to mikrotubulipopulationer. En metode er beskrevet til samtidig at se den kollektive aktivitet af flere mikrotubuli-associerede proteiner på tværbundne mikrotubuli bundter og enkelte mikrotubuli.

Samtidig visualisering af dynamikken i tværbundne og enkelte mikrotubuli in vitro ved hjælp af TIRF-mikroskopi

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Cellulære mikrotubuli arrays indeholder subpopulationer af mikrotubuli med forskellige dynamiske egenskaber som krævet for funktion. Denne protokol omhandler, hvordan regulatorernes kollektive aktivitet giver proksimale mikrotubuli subpopulationer med forskellige egenskaber. Dette bottom-up restitutionsassay gør det muligt for os samtidig at visualisere organisationen og dynamikken i proksimale mikrotubulipopulationer såsom enkelte mikrotubuli og bundter og at dechiffrere de mekanismer, der ligger til grund for deres selvorganisering.Multikomponent rekonstitution kræver optimering af eksperimentelle parametre som pH, ionstyrke og proteinkoncentration, samtidig med at aktiviteten af hver enkelt bevares. Systematisk analyse af individuelle komponenter forud for multiproteinassays er yderst nyttig. Til at begynde med pipetteres en blanding af 4,5 mikroliter BRB ADDTT i en mikroliter mikrotubuliopløsning på et mikroskopdias.Dæk med en 18 til 18 millimeter dækslips og forsegl kanterne med enten klar neglelak eller VALAP-fugemasse. Placer TIRF-målet under dæksedlen. Visualiser de nyligt polymeriserede mikrotubuli ved en bølgelængde, der passer til det fluorescerende mærkede tubulin i den lyse blanding for at bestemme, hvilken fortynding af mikrotubuli der skal bruges i de kommende eksperimenter.Bestem laserintensiteten for eksperimentet empirisk, således at alle fluorescerende proteiner belyses, men ikke gennemgår signifikant fotoblegelse i løbet af eksperimentets forløb. Indstil mikroskoptemperaturen til 28 grader Celsius for at se dynamiske mikrotubuli. Brug objektivpapir til at rengøre et 100X mål med 70 % ethanol.Brug den bedste kombination af filterkuber og emissionsfiltre afhængigt af de fluorescerende kanaler, der skal afbildes. Konfigurer billedsekvensen. For et eksperiment med 647 nanometer fluorophore-mærkede biotinylerede mikrotubuli, 560 nanometer fluorophore-mærkede ikke-biotinylerede mikrotubuli i opløseligt tubulin og GFP-mærket protein af interesse, billede 488 nanometer, 560 nanometer og 647 nanometer kanaler hvert 10. sekund i 20 ethvert minut.For at tage et referencebillede af bundter før tilsætning af opløseligt tubulin og mikrotubuli-associeret protein skal du oprette en sekvens med et billede hver i 560 nanometer og 647 nanometer bølgelængdekanaler. Kontroller placeringen af laserstrålen i loftet over mikroskopet, og foretag ændringer i strålen ved hjælp af software. Sørg for, at laserlyset er justeret.Før billeddannelse skal du tilføje en dråbe mikroskopnedsænkningsolie til målet. Forbered den opløselige tubulinblanding, mens du holder den på is og spinder blandingen ned. For at immobilisere mikrotubuli via biotin-NeutrAvidin-biotin-koblingen strømmer først ca. 7,5 mikroliter NeutrAvidin-opløsning ind, indtil kammeret er fyldt og inkuberes i fem minutter.Vask med 10 mikroliter MB koldt. Flow i 7,5 mikroliter af det blokerende protein KC og inkuber i to minutter. Vask med 10 mikroliter MB varmt for at forberede kammeret til introduktion af mikrotubuli.Fortynd bestanden af biotinylerede mikrotubuli i BRB ADDTT og tilsæt en mikroliter af denne fortynding til ni mikroliter MB varm. Flyd blandingen ind i kammeret og inkuber i 10 minutter. Vask ikke-immobiliserede mikrotubuli væk med 10 mikroliter MB varmt.Flow 7,5 mikroliter varm KC ind i kammeret og inkuber i to minutter. Under inkubationen fremstilles en to nanomolær opløsning af tværbindingen eller proteinet PRC1 i KC og spindes ned opløsningen. Flow 10 mikroliter af denne opløsning ind i billedkammeret og inkuber i fem minutter.For at lave bundter strømmer 10 mikroliter ikke-biotinylerede mikrotubuli ind i kammeret og inkuberer i 10 minutter. Vask kammeret to gange med 10 mikroliter MB varmt. I løbet af 10-minutters inkubationstiden skal du forberede 10 mikroliter assayblanding indeholdende proteiner af interesse, opløseligt tubulin, nukleotider, iltrensere og antioxidanter og dreje det ned.Hold blandingen på is. Læg det forberedte billedkammer, der er tapet til glideholderen, på 100X TIRF-målet. Brug kanalerne 560 nanometer og 647 nanometer til at finde et synsfelt, der indeholder et optimalt antal og densitet af enkelte mikrotubuli og bundter.Når et synsfelt er identificeret, skal du tage et referencebillede. Flyd forsigtigt i analyseblandingen uden at forstyrre billedkammeret. Forsegl de åbne ender af kammeret med VALAP-fugemasse.Overhold mikrotubuli og start billedsekvensen. Efter immobilisering af mikrotubuli frø og generering af bundter blev fluorescensbilleder opnået. Enkelte mikrotubuli blev identificeret ved fluorescerende signal i 647 nanometerkanalen, mens mikrotubuli blev identificeret som præformede bundter, når de viste fluorescerende signaler i begge kanaler.Dynamikken i enkelte mikrotubuli og PRC1 tværbundne bundter blev undersøgt i nærværelse af proteinerne KIF4A og CLASP1, hvilket afslørede, at de enkelte mikrotubuli forlænges i løbet af analysen, mens væksten af tværbundne mikrotubuli er standset. Pas på at holde polymeriserede mikrotubuli ved eller over stuetemperatur. Opbevar opløseligt tubulin på is og beskyt billedkammeret og fluorescerende mærkede mikrotubuli og proteiner mod lys.Disse assays gav mekanistisk indsigt i, hvordan et proteinmodul fundet ved den mitotiske spindel kunne differentieret regulere dynamikken i to forskellige mikrotubulipopulationer, der sameksisterer i spindelen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondering struktur og dynamik af Nucleosomes ved hjælp af Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Billeddannelse af ekstracellulære vesikler ved atomkraften mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-Cell Receptor Dynamics Fire-Dimensionelt Ved hjælp af gitter light-sheet mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion af dynein og Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer til observation af et enkelt molekyle

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisering af Diffusional Dynamics of Gold Nanorods på cellemembran ved hjælp af Single Nanoparticle Darkfield Mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Samtidig interferensrefleksion og total intern refleksion fluorescensmikroskopi til billeddannelse af dynamiske mikrotubuli og tilhørende proteiner

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Brug af mikrofluidik og fluorescensmikroskopi til at studere samlingsdynamikken i enkeltaktinfilamenter og bundter

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Visualisering af actin- og mikrotubulikoblingsdynamik in vitro ved total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...