Name: simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy
Uploaded: 2022-02-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (n° 1DP2GM126894-01) et par des fonds des Pew Charitable Trusts et de la Smith Family Foundation à R.S. Les auteurs remercient le Dr Shuo Jiang pour sa contribution au développement et à l’optimisation des protocoles.

1. Préparez les réactifs
<ol><li>Préparer les tampons et les réactifs comme indiqué dans les tableaux 1 et 2. Pendant l’expérience, conservez toutes les solutions sur la glace, sauf indication contraire.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solution</td>
			<td colspan="2">Composants</td>
			<td>Durée de stockage recommandée</td>
...

<ol>
	<li>Subramanian, R., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+complexity:+insights+into+self-organized+assembly+of+microtubule-based+architectures.">Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures.</a> Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+determine+and+maintain+Drosophila+bristle+shape.">Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape.</a> Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).</li><li>Foe, V. E., von Dassow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+shape+the+myosin+activation+zone+during+cytokinetic+furrow+formation.">Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).</li><li>Pous, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specialization+of+stable+and+dynamic+microtubules+in+protein+traffic+in+WIF-B+cells.">Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells.</a> The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).</li><li>Uehara, R., Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+central+spindle+assembly+requires+de+novo+microtubule+generation+in+the+interchromosomal+region+during+anaphase.">Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+microtubule+plus-end+tracking+system+in+vitro.">Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro.</a> Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+pushing+and+braking+forces+generated+by+ensembles+of+Kinesin-5+crosslinking+two+microtubules.">Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules.</a> Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).</li><li>Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+single+microtubules+and+bundles+by+a+three-protein+module.">Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module.</a> Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).</li><li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTP+hydrolysis+in+microtubule+dynamics:+information+from+a+slowly+hydrolyzable+analogue,+GMPCPP.">Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).</li><li>Subramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+antiparallel+microtubule+crosslinking+by+PRC1,+a+conserved+nonmotor+microtubule+binding+protein.">Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein.</a> Cell. 142 (3), 433-443 (2010).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Wijeratne, S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+of+antiparallel+microtubule+bundles+regulates+relative+sliding+and+stalling+by+PRC1+and+Kif4A.">Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A.</a> eLife. 7, 32595 (2018).</li><li>Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+geometrical+features+of+microtubules+as+regulators+of+microtubule+organization.">Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization.</a> eLife. 10, 63880 (2021).</li><li>Freal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-driven+assembly+of+the+axon+initial+segment.">Feedback-driven assembly of the axon initial segment.</a> Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).</li><li>Ledbetter, M., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;microtubule&amp;#34;+in+plant+cell+fine+structure.">A &amp;#34;microtubule&amp;#34; in plant cell fine structure.</a> The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).</li><li>Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+reveals+distinct+protofilament-scale+structural+dynamics+in+depolymerizing+microtubule+arrays.">Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).</li></ol>

L’expérience décrite ici élargit considérablement la portée et la complexité des essais conventionnels de reconstitution de microtubules, qui sont traditionnellement effectués sur des microtubules simples ou sur un type de réseau. Le test actuel fournit une méthode pour quantifier et comparer simultanément l’activité map régulatrice sur deux populations, à savoir les microtubules simples et les faisceaux réticulés. De plus, ce test permet d’examiner deux types de faisceaux : ceux qui sont préformés...

Les microtubules sont des biopolymères qui forment des échafaudages structurels essentiels à de multiples processus cellulaires, allant du transport intracellulaire et du positionnement des organites à la division cellulaire et à l’allongement. Pour exécuter ces diverses fonctions, les microtubules individuels sont organisés en réseaux de la taille d’un micron, tels que les fuseaux mitotiques, les axonèmes ciliaires, les faisceaux neuronaux, les réseaux interphasiques et les réseaux corticaux végétaux. Un motif architectural omniprésent que l’on retrouve dans ces structures est un faisceau de microtubules réticulés sur toute leur longueur1. Une caractéristique intrigante de plusieurs structures à base de microtubules est la coexistence de microtubules groupés et de microtubules simples non réticulés à proximité spatiale étroite. Ces sous-populations de microtubules peuvent présenter une dynamique de polymérisation très différente les unes des autres, selon les besoins pour leur bon fonctionnement2,3,4,5. Par exemple, dans le fuseau mitotique, des faisceaux réticulés stables et des microtubules simples dynamiques sont présents dans une région à l’échelle du micron au centre cellulaire6. L’étude de la façon dont les propriétés dynamiques des populations de microtubules coexistantes sont spécifiées est donc essentielle pour comprendre l’assemblage et la fonction des structures à base de microtubules.
Les microtubules sont des polymères dynamiques qui alternent entre les phases de polymérisation et de dépolymérisation, passant d’une phase à l’autre dans des événements connus sous le nom de catastrophe et de sauvetage7. La dynamique des microtubules cellulaires est régulée par une myriade de protéines associées aux microtubules (MAP) qui modulent les taux de polymérisation et de dépolymérisation des microtubules et les fréquences des catastrophes et des événements de sauvetage. Il est difficile d’étudier l’activité des MAP sur les réseaux proximaux spatiaux dans les cellules, en raison des limites de la résolution spatiale en microscopie optique, en particulier dans les régions à haute densité de microtubules. De plus, la présence de plusieurs MAP dans la même région cellulaire entrave l’interprétation des études biologiques cellulaires. Les essais de reconstitution in vitro, effectués conjointement avec la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF), contournent les défis liés à l’examen des mécanismes par lesquels des sous-ensembles spécifiques de MAP régulent la dynamique des réseaux de microtubules cellulaires proximaux. Ici, la dynamique des microtubules assemblés in vitro est examinée en présence d’un ou plusieurs MAP recombinants dans des conditions contrôlées8,9,10. Cependant, les essais de reconstitution conventionnels sont généralement effectués sur des microtubules simples ou sur un type de réseau, empêchant la visualisation de populations coexistantes.
Nous présentons ici des essais de reconstitution in vitro qui permettent la visualisation simultanée de deux populations de microtubules dans les mêmes conditions de solution11. Nous décrivons une méthode permettant de visualiser simultanément l’activité collective de plusieurs MAP sur des microtubules simples et sur des faisceaux de microtubules réticulés par la protéine mitotique associée au fuseau PRC1. La protéine PRC1 se lie préférentiellement au chevauchement entre les microtubules anti-parallèles, les réticulant9. En bref, ce protocole comprend les étapes suivantes: (i) préparation de solutions mères et de réactifs, (ii) nettoyage et traitement de surface des couvercles utilisés pour créer la chambre d’imagerie pour les expériences de microscopie, (iii) préparation de « graines » de microtubules stables à partir desquelles la polymérisation est initiée au cours de l’expérience, (iv) spécification des paramètres du microscope TIRF pour visualiser la dynamique des microtubules, (v) immobilisation des graines de microtubules et génération de faisceaux de microtubules réticulés dans la chambre d’imagerie, et (vi) visualisation de la dynamique des microtubules dans la chambre d’imagerie par microscopie TIRF, après addition de tubuline soluble, de MAP et de nucléotides. Ces essais permettent l’évaluation qualitative et l’examen quantitatif de la localisation de la MAP et de son effet sur la dynamique de deux populations de microtubules. En outre, ils facilitent l’évaluation des effets synergiques de plusieurs MAP sur ces populations de microtubules, dans un large éventail de conditions expérimentales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >238813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18x18 mm #1.5 coverslips&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24x60 mm #1.5 coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >405/488/560/647 nm Laser Quad Band&#160;</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>TRF89901-NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7699-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avidin, NeutrAvidin&#174; Biotin-binding Protein (Molecular Probes&#174;)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Delicate Task Wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET610/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200-proof)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GMPCPP</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>NU-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hellmanex III detergent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion oil, Type A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>77010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kappa-casein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lanolin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microfuge 16 Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90&#176; Ground Edges, WHITE Frosted</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380-50W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000&#160;</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#NH2-PEG-VA-5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optima&#8482; Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraffin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5377-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petrolatum, White</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plasma Cleaner, 115V</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2520-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#8482; Pierce&#8482; Bond-Breaker&#8482; TCEP Solution, Neutral pH; 500mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>PI-77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apochromat TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.1 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>362224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.2 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL620M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTABOND&#174; Reagent, Tissue Section Adhesion</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>SP-1800-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VWR&#174; Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97025-630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy

Les microtubules sont des polymères d’hétérodimères d’αβ-tubuline qui s’organisent en structures distinctes dans les cellules. Les architectures et les réseaux basés sur des microtubules contiennent souvent des sous-ensembles de réseaux de microtubules qui diffèrent par leurs propriétés dynamiques. Par exemple, dans les cellules en division, des faisceaux stables de microtubules réticulés coexistent à proximité de microtubules dynamiques non réticulés. Les études de reconstitution in vitro basées sur la microscopie TIRF permettent la visualisation simultanée de la dynamique de ces différents réseaux de microtubules. Dans ce test, une chambre d’imagerie est assemblée avec des microtubules immobilisés en surface, qui sont soit présents sous forme de filaments simples, soit organisés en faisceaux réticulés. L’introduction de la tubuline, des nucléotides et des régulateurs de protéines permet une visualisation directe des protéines associées et des propriétés dynamiques des microtubules simples et réticulés. De plus, les changements qui se produisent lorsque des microtubules uniques dynamiques s’organisent en faisceaux peuvent être surveillés en temps réel. La méthode décrite ici permet une évaluation systématique de l’activité et de la localisation de protéines individuelles, ainsi que des effets synergiques des régulateurs de protéines sur deux sous-ensembles de microtubules différents dans des conditions expérimentales identiques, fournissant ainsi des informations mécanistes inaccessibles par d’autres méthodes.

L’expérience décrite ci-dessus a été réalisée à l’aide de microtubules biotinylés marqués au fluorophore de 647 nm, de microtubules non biotinylés marqués au fluorophore de 560 nm et d’un mélange de tubuline soluble marqué au fluorophore de 560 nm. Les microtubules ont été réticulés par la protéine réticulée PRC1 (marquée GFP). Après la génération de faisceaux immobilisés en surface et de microtubules simples (étape 5.11), la chambre d’imagerie a été montée sur un objectif d’huile T...

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Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Ici, un essai de reconstitution in vitro basé sur la microscopie TIRF est présenté pour quantifier et comparer simultanément la dynamique de deux populations de microtubules. Une méthode est décrite pour visualiser simultanément l’activité collective de plusieurs protéines associées aux microtubules sur des faisceaux de microtubules réticulés et des microtubules simples.

Visualisation simultanée de la dynamique des microtubules réticulés et simples in vitro par microscopie TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Les réseaux de microtubules cellulaires contiennent des sous-populations de microtubules avec des propriétés dynamiques distinctes requises pour la fonction. Ce protocole traite de la façon dont l’activité collective des régulateurs confère des propriétés distinctes à des sous-populations de microtubules proximales. Ce test de restitution ascendant nous permet de visualiser simultanément l’organisation et la dynamique des populations de microtubules proximaux tels que les microtubules et les faisceaux uniques, et de déchiffrer les mécanismes sous-jacents à leur auto-organisation.La reconstitution multi-composants nécessite d’optimiser les paramètres expérimentaux tels que le pH, la force ionique et la concentration en protéines tout en préservant l’activité de chacun. L’analyse systématique des composants individuels avant les tests multi-protéines est extrêmement utile. Pour commencer, pipettez un mélange de 4,5 microlitres de BRB ADDTT dans un microlitre de solution de microtubules sur une lame de microscope.Couvrez avec un couvercle de 18 x 18 millimètres et scellez les bords avec du vernis à ongles transparent ou du scellant VALAP. Placez l’objectif TIRF sous le couvercle. Visualisez les microtubules nouvellement polymérisés à une longueur d’onde appropriée pour la tubuline marquée par fluorescence dans le mélange brillant afin de déterminer quelle dilution des microtubules utiliser dans les expériences à venir.Déterminer empiriquement l’intensité du laser pour l’expérience de manière à ce que toutes les protéines fluorescentes soient éclairées, mais ne subissent pas de photoblanchiment significatif au cours du temps de l’expérience. Réglez la température du microscope à 28 degrés Celsius pour afficher les microtubules dynamiques. Utilisez du papier d’objectif pour nettoyer un objectif 100X avec 70% d’éthanol.Utilisez la meilleure combinaison de cubes filtrants et de filtres d’émission en fonction des canaux fluorescents à imager. Configurez la séquence d’imagerie. Pour une expérience avec des microtubules biotinylés marqués au fluorophore de 647 nanomètres, des microtubules non biotinylés marqués au fluorophore de 560 nanomètres dans de la tubuline soluble et une protéine d’intérêt marquée GFP, imagez les canaux de 488 nanomètres, 560 nanomètres et 647 nanomètres toutes les 10 secondes pendant 20 minutes.Pour capturer une image de référence des faisceaux avant l’ajout de tubuline soluble et de protéine associée aux microtubules, établissez une séquence avec une image chacune dans des canaux de longueur d’onde de 560 nanomètres et 647 nanomètres. Vérifiez la position du faisceau laser sur le plafond au-dessus du microscope et apportez des modifications au faisceau à l’aide d’un logiciel. Assurez-vous que l’illuminateur laser est aligné.Avant l’imagerie, ajoutez une goutte d’huile d’immersion au microscope à l’objectif. Préparez le mélange de tubuline soluble tout en le gardant sur la glace et faites tourner le mélange. Pour immobiliser les microtubules via la liaison biotine-NeutrAvidin-biotine, d’abord s’écouler dans environ 7,5 microlitres de solution de NeutrAvidin jusqu’à ce que la chambre soit remplie et incuber pendant cinq minutes.Laver avec 10 microlitres de MB froid. Faire circuler 7,5 microlitres de la protéine bloquante KC et incuber pendant deux minutes. Laver à chaud 10 microlitres de MB pour préparer la chambre à l’introduction de microtubules.Diluer le stock de microtubules biotinylés dans BRB ADDTT et ajouter un microlitre de cette dilution à neuf microlitres de MB chaud. Verser le mélange dans la chambre et incuber pendant 10 minutes. Laver les microtubules non immobilisés avec 10 microlitres de MB chaud.Versez 7,5 microlitres de KC chaud dans la chambre et incubez pendant deux minutes. Pendant l’incubation, préparez une solution à deux nanomolaires de la réticulation ou de la protéine PRC1 dans KC et faites tourner la solution. Faites couler 10 microlitres de cette solution dans la chambre d’imagerie et incubez pendant cinq minutes.Pour faire des faisceaux, faites couler 10 microlitres de microtubules non biotinylés dans la chambre et incubez pendant 10 minutes. Lavez la chambre deux fois avec 10 microlitres de MB à chaud. Pendant le temps d’incubation de 10 minutes, préparez 10 microlitres de mélange de dosage contenant des protéines d’intérêt, de la tubuline soluble, des nucléotides, des piégeurs d’oxygène et des antioxydants et faites-le tourner.Gardez le mélange sur de la glace. Chargez la chambre d’imagerie préparée scotchée au support de diapositive sur l’objectif TIRF 100X. Utilisez les canaux de 560 nanomètres et 647 nanomètres pour trouver un champ de vision qui contient un nombre et une densité optimaux de microtubules et de faisceaux uniques.Une fois qu’un champ de vision est identifié, prenez une image de référence. Appliquer soigneusement dans le mélange d’essai sans perturber la chambre d’imagerie. Scellez les extrémités ouvertes de la chambre avec le scellant VALAP.Observez les microtubules et démarrez la séquence d’imagerie. Après avoir immobilisé les graines de microtubules et généré des faisceaux, des images de fluorescence ont été obtenues. Des microtubules simples ont été identifiés par signal fluorescent dans le canal de 647 nanomètres, tandis que les microtubules ont été identifiés comme des faisceaux préformés lorsqu’ils affichaient des signaux fluorescents dans les deux canaux.La dynamique des microtubules simples et des faisceaux réticulés PRC1 a été étudiée en présence des protéines KIF4A et CLASP1, ce qui a révélé que les microtubules simples s’allongent au cours du test, tandis que la croissance des microtubules réticulés est bloquée. Veillez à maintenir les microtubules polymérisés à température ambiante ou au-dessus. Conservez la tubuline soluble sur la glace et protégez la chambre d’imagerie et les microtubules et protéines marqués par fluorescence de la lumière.Ces essais ont fourni un aperçu mécaniste de la façon dont un module protéique trouvé au fuseau mitotique pourrait réguler différemment la dynamique de deux populations de microtubules différentes qui coexistent dans le fuseau.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sonder la Structure et la dynamique des nucléosomes à l’aide de la microscopie de Force atomique d’imagerie

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Recherche

Biochimie

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Échelle du protéome Quantification d’homogénéité à l’échelle de la molécule unique d’étiquetage

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imagerie des vésicules extracellulaires par microscopie de force atomique

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisation de la dynamique des récepteurs T-Cell de surface à quatre dimensions à l'aide de microscopie à feuilles de lumière en treillis

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Production d'ensembles moteurs d'adn et de kinésine sur des nanostructures d'origami d'ADN pour l'observation d'une seule molécule

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisation de la dynamique diffusionnelle des nanorods d’or sur la membrane cellulaire à l’aide d’une microscopie darkfield nanoparticule unique

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Analyse unicellulaire d’allèles transcriptionnellement actifs par molécule unique FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Microscopie à fluorescence par interférence simultanée et à réflexion interne totale pour l’imagerie de microtubules dynamiques et de protéines associées

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Utilisation de la microfluidique et de la microscopie à fluorescence pour étudier la dynamique d’assemblage des filaments et des faisceaux d’actine unique

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Visualisation de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules in vitro par microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...