Name: simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy
Uploaded: 2022-02-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des NIH (Nr. 1DP2GM126894-01) und durch Mittel der Pew Charitable Trusts und der Smith Family Foundation an R.S. unterstützt. Die Autoren danken Dr. Shuo Jiang für seinen Beitrag zur Entwicklung und Optimierung der Protokolle.

1. Reagenzien vorbereiten
<ol><li>Bereiten Sie Puffer und Reagenzien gemäß Tabelle 1 und Tabelle 2 vor. Bewahren Sie während des Experiments alle Lösungen auf Eis auf, sofern nicht anders angegeben.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Lösung</td>
			<td colspan="2">Komponenten</td>
			<td>Empfohlene Speicherdauer</td>
			<td colspan="...

<ol>
	<li>Subramanian, R., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+complexity:+insights+into+self-organized+assembly+of+microtubule-based+architectures.">Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures.</a> Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+determine+and+maintain+Drosophila+bristle+shape.">Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape.</a> Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).</li><li>Foe, V. E., von Dassow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+shape+the+myosin+activation+zone+during+cytokinetic+furrow+formation.">Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).</li><li>Pous, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specialization+of+stable+and+dynamic+microtubules+in+protein+traffic+in+WIF-B+cells.">Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells.</a> The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).</li><li>Uehara, R., Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+central+spindle+assembly+requires+de+novo+microtubule+generation+in+the+interchromosomal+region+during+anaphase.">Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+microtubule+plus-end+tracking+system+in+vitro.">Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro.</a> Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+pushing+and+braking+forces+generated+by+ensembles+of+Kinesin-5+crosslinking+two+microtubules.">Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules.</a> Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).</li><li>Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+single+microtubules+and+bundles+by+a+three-protein+module.">Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module.</a> Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).</li><li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTP+hydrolysis+in+microtubule+dynamics:+information+from+a+slowly+hydrolyzable+analogue,+GMPCPP.">Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).</li><li>Subramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+antiparallel+microtubule+crosslinking+by+PRC1,+a+conserved+nonmotor+microtubule+binding+protein.">Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein.</a> Cell. 142 (3), 433-443 (2010).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Wijeratne, S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+of+antiparallel+microtubule+bundles+regulates+relative+sliding+and+stalling+by+PRC1+and+Kif4A.">Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A.</a> eLife. 7, 32595 (2018).</li><li>Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+geometrical+features+of+microtubules+as+regulators+of+microtubule+organization.">Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization.</a> eLife. 10, 63880 (2021).</li><li>Freal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-driven+assembly+of+the+axon+initial+segment.">Feedback-driven assembly of the axon initial segment.</a> Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).</li><li>Ledbetter, M., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;microtubule&amp;#34;+in+plant+cell+fine+structure.">A &amp;#34;microtubule&amp;#34; in plant cell fine structure.</a> The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).</li><li>Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+reveals+distinct+protofilament-scale+structural+dynamics+in+depolymerizing+microtubule+arrays.">Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).</li></ol>

Das hier beschriebene Experiment erweitert den Umfang und die Komplexität herkömmlicher Mikrotubuli-Rekonstitutionsassays, die traditionell an einzelnen Mikrotubuli oder an einem Array-Typ durchgeführt werden, erheblich. Der aktuelle Assay bietet eine Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung und zum Vergleich der regulatorischen MAP-Aktivität an zwei Populationen, nämlich einzelnen Mikrotubuli und vernetzten Bündeln. Darüber hinaus ermöglicht dieser Assay die Untersuchung von zwei Arten von Bündeln: solchen, d...

Mikrotubuli sind Biopolymere, die strukturelle Gerüste bilden, die für mehrere zelluläre Prozesse unerlässlich sind, vom intrazellulären Transport und der Organellenpositionierung bis hin zur Zellteilung und -dehnung. Um diese vielfältigen Funktionen auszuführen, sind einzelne Mikrotubuli in mikrometergroße Arrays organisiert, wie z.B. mitotische Spindeln, Ziliaraxoneme, neuronale Bündel, Interphasenarrays und pflanzliche kortikale Arrays. Ein allgegenwärtiges architektonisches Motiv, das in diesen Strukturen zu finden ist, ist ein Bündel von Mikrotubuli, die entlang ihrer Länge miteinander verbunden sind1. Ein faszinierendes Merkmal mehrerer Mikrotubuli-basierter Strukturen ist die Koexistenz von gebündelten Mikrotubuli und nicht vernetzten Einzelmikrotubuli in unmittelbarer räumlicher Nähe. Diese Mikrotubuli-Subpopulationen können eine stark unterschiedliche Polymerisationsdynamik aufweisen, die für ihre ordnungsgemäße Funktion erforderlich ist2,3,4,5. Zum Beispiel sind innerhalb der mitotischen Spindel stabile vernetzte Bündel und dynamische einzelne Mikrotubuli innerhalb einer mikrometerskaligen Region im Zellzentrum vorhanden6. Die Untersuchung, wie die dynamischen Eigenschaften koexistierender Mikrotubulipopulationen spezifiziert werden, ist daher von zentraler Bedeutung für das Verständnis des Aufbaus und der Funktion von Mikrotubuli-basierten Strukturen.
Mikrotubuli sind dynamische Polymere, die zwischen Phasen der Polymerisation und Depolymerisation wechseln und zwischen den beiden Phasen in Ereignissen, die als Katastrophe und Rettung bekannt sind7 wechseln. Die Dynamik zellulärer Mikrotubuli wird durch unzählige Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAPs) reguliert, die die Raten der Mikrotubuli-Polymerisation und -Depolymerisation sowie die Häufigkeit von Katastrophen- und Rettungsereignissen modulieren. Es ist eine Herausforderung, die Aktivität von MAPs auf räumlich proximalen Arrays in Zellen zu untersuchen, da die räumliche Auflösung in der Lichtmikroskopie begrenzt ist, insbesondere in Regionen mit hoher Mikrotubulidichte. Darüber hinaus behindert das Vorhandensein mehrerer MAPs in derselben Zellregion die Interpretation zellbiologischer Studien. In-vitro-Rekonstitutionstests, die in Verbindung mit der TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) durchgeführt werden, umgehen die Herausforderungen der Untersuchung von Mechanismen, mit denen bestimmte Untergruppen von MAPs die Dynamik proximaler zellulärer Mikrotubuli-Arrays regulieren. Hier wird die Dynamik von in vitro zusammengesetzten Mikrotubuli in Gegenwart eines oder mehrerer rekombinanter MAPs unter kontrollierten Bedingungen untersucht8,9,10. Konventionelle Rekonstitutionsassays werden jedoch typischerweise an einzelnen Mikrotubuli oder an einer Art von Array durchgeführt, was die Visualisierung koexistierender Populationen ausschließt.
Hier stellen wir in vitro Rekonstitutionsassays vor, die die gleichzeitige Visualisierung von zwei Mikrotubulipopulationen unter den gleichen Lösungsbedingungen ermöglichen11. Wir beschreiben eine Methode, um gleichzeitig die kollektive Aktivität mehrerer MAPs auf einzelnen Mikrotubuli und auf Mikrotubulibündeln zu betrachten, die mit dem mitotischen Spindel-assoziierten Protein PRC1 vernetzt sind. Das Protein PRC1 bindet bevorzugt an der Überlappung zwischen antiparallelen Mikrotubuli und vernetzt sie9. Kurz gesagt, dieses Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: (i) Herstellung von Stammlösungen und Reagenzien, (ii) Reinigung und Oberflächenbehandlung von Deckgläsern, die zur Herstellung der Bildgebungskammer für Mikroskopieexperimente verwendet werden, (iii) Herstellung stabiler Mikrotubuli-"Samen", von denen während des Experiments eine Polymerisation eingeleitet wird, (iv) Spezifikation von TIRF-Mikroskopeinstellungen zur Visualisierung der Mikrotubuli-Dynamik, (v) Immobilisierung von Mikrotubuli-Samen und Erzeugung von vernetzten Mikrotubuli-Bündeln in der Bildgebungskammer und (vi) Visualisierung der Mikrotubulidynamik in der Bildgebungskammer durch TIRF-Mikroskopie unter Zugabe von löslichem Tubulin, MAPs und Nukleotiden. Diese Assays ermöglichen die qualitative Bewertung und quantitative Untersuchung der MAP-Lokalisierung und ihrer Wirkung auf die Dynamik zweier Mikrotubuli-Populationen. Darüber hinaus erleichtern sie die Bewertung der synergistischen Effekte mehrerer MAPs auf diese Mikrotubulipopulationen unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >238813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18x18 mm #1.5 coverslips&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24x60 mm #1.5 coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >405/488/560/647 nm Laser Quad Band&#160;</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>TRF89901-NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7699-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avidin, NeutrAvidin&#174; Biotin-binding Protein (Molecular Probes&#174;)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Delicate Task Wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET610/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200-proof)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GMPCPP</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>NU-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hellmanex III detergent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion oil, Type A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>77010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kappa-casein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lanolin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microfuge 16 Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90&#176; Ground Edges, WHITE Frosted</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380-50W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000&#160;</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#NH2-PEG-VA-5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optima&#8482; Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraffin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5377-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petrolatum, White</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plasma Cleaner, 115V</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2520-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#8482; Pierce&#8482; Bond-Breaker&#8482; TCEP Solution, Neutral pH; 500mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>PI-77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apochromat TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.1 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>362224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.2 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL620M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTABOND&#174; Reagent, Tissue Section Adhesion</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>SP-1800-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VWR&#174; Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97025-630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy

Mikrotubuli sind Polymere von αβ-Tubulin-Heterodimeren, die sich in Zellen zu unterschiedlichen Strukturen organisieren. Mikrotubuli-basierte Architekturen und Netzwerke enthalten häufig Teilmengen von Mikrotubuli-Arrays, die sich in ihren dynamischen Eigenschaften unterscheiden. Zum Beispiel koexistieren in sich teilenden Zellen stabile Bündel vernetzter Mikrotubuli in unmittelbarer Nähe zu dynamischen, nicht vernetzten Mikrotubuli. TIRF-mikroskopiebasierte In-vitro-Rekonstitutionsstudien ermöglichen die gleichzeitige Visualisierung der Dynamik dieser verschiedenen Mikrotubuli-Arrays. Bei diesem Assay wird eine Bildgebungskammer mit oberflächenimmobilisierten Mikrotubuli zusammengesetzt, die entweder als einzelne Filamente vorliegen oder in vernetzten Bündeln organisiert sind. Die Einführung von Tubulin, Nukleotiden und Proteinregulatoren ermöglicht die direkte Visualisierung von assoziierten Proteinen und von dynamischen Eigenschaften einzelner und vernetzter Mikrotubuli. Darüber hinaus können Änderungen, die auftreten, wenn sich dynamische einzelne Mikrotubuli zu Bündeln organisieren, in Echtzeit überwacht werden. Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine systematische Bewertung der Aktivität und Lokalisation einzelner Proteine sowie synergistischer Effekte von Proteinregulatoren auf zwei verschiedene Mikrotubuli-Untergruppen unter identischen experimentellen Bedingungen und liefert dadurch mechanistische Erkenntnisse, die mit anderen Methoden nicht zugänglich sind.

Das oben beschriebene Experiment wurde unter Verwendung von 647 nm fluorophormarkierten biotinylierten Mikrotubuli, 560 nm fluorophormarkierten nicht biotinylierten Mikrotubuli und 560 nm fluorophormarkierten löslichen Tubulinmischungen durchgeführt. Mikrotubuli wurden durch das Vernetzerprotein PRC1 (GFP-markiert) vernetzt. Nachdem oberflächenimmobilisierte Bündel und einzelne Mikrotubuli erzeugt wurden (Schritt 5.11), wurde die Bildgebungskammer auf einem TIRF 100X 1.49 NA Ölobjektiv montiert und in den 560 nm und...

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Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Hier wird ein TIRF-Mikroskopie-basierter In-vitro-Rekonstitutionsassay vorgestellt, um gleichzeitig die Dynamik zweier Mikrotubulipopulationen zu quantifizieren und zu vergleichen. Es wird ein Verfahren beschrieben, um gleichzeitig die kollektive Aktivität mehrerer Mikrotubuli-assoziierter Proteine auf vernetzten Mikrotubulibündeln und einzelnen Mikrotubuli zu betrachten.

Simultane Visualisierung der Dynamik von vernetzten und einzelnen Mikrotubuli in vitro mittels TIRF-Mikroskopie

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Zelluläre Mikrotubuli-Arrays enthalten Subpopulationen von Mikrotubuli mit unterschiedlichen dynamischen Eigenschaften, wie sie für die Funktion erforderlich sind. Dieses Protokoll befasst sich damit, wie die kollektive Aktivität von Regulatoren proximale Mikrotubuli-Subpopulationen mit unterschiedlichen Eigenschaften verleiht. Dieser Bottom-up-Restitutionsassay ermöglicht es uns, gleichzeitig die Organisation und Dynamik proximaler Mikrotubulipopulationen wie einzelne Mikrotubuli und Bündel zu visualisieren und die Mechanismen zu entschlüsseln, die ihrer Selbstorganisation zugrunde liegen.Die Mehrkomponenten-Rekonstitution erfordert die Optimierung experimenteller Parameter wie pH-Wert, Ionenstärke und Proteinkonzentration, während die Aktivität jedes einzelnen erhalten bleibt. Die systematische Analyse einzelner Komponenten vor Multi-Protein-Assays ist äußerst hilfreich. Zu Beginn pipettieren Sie eine Mischung aus 4,5 Mikrolitern BRB ADDTT in einem Mikroliter Mikrotubuli-Lösung auf einen Objektträger.Mit einem 18 x 18 Millimeter großen Deckglas abdecken und die Kanten entweder mit klarem Nagellack oder VALAP-Dichtungsmittel versiegeln. Positionieren Sie das TIRF-Objektiv unter dem Deckglas. Visualisieren Sie die neu polymerisierten Mikrotubuli bei einer Wellenlänge, die für das fluoreszierend markierte Tubulin in der hellen Mischung geeignet ist, um zu bestimmen, welche Verdünnung von Mikrotubuli in den bevorstehenden Experimenten verwendet werden soll.Bestimmen Sie die Laserintensität für das Experiment empirisch so, dass alle fluoreszierenden Proteine beleuchtet werden, aber im Laufe des Experiments keiner signifikanten Photobleiche unterzogen werden. Stellen Sie die Temperatur des Mikroskops auf 28 Grad Celsius ein, um dynamische Mikrotubuli anzuzeigen. Verwenden Sie Linsenpapier, um ein 100-faches Objektiv mit 70% Ethanol zu reinigen.Verwenden Sie die beste Kombination aus Filterwürfeln und Emissionsfiltern, abhängig von den abzubildenden Leuchtstoffkanälen. Richten Sie die Bildgebungssequenz ein. Für ein Experiment mit 647 Nanometer-Fluorophor-markierten biotinylierten Mikrotubuli, 560-Nanometer-Fluorophor-markierten nicht-biotinylierten Mikrotubuli in löslichem Tubulin und GFP-markiertem Protein von Interesse, stellen Sie die 488 Nanometer-, 560 Nanometer- und 647 Nanometer-Kanäle alle 10 Sekunden für 20 Minuten ab.Um ein Referenzbild von Bündeln vor der Zugabe von löslichem Tubulin und Mikrotubuli-assoziiertem Protein aufzunehmen, richten Sie eine Sequenz mit je einem Bild in 560-Nanometer- und 647-Nanometer-Wellenlängenkanälen ein. Überprüfen Sie die Position des Laserstrahls an der Decke über dem Mikroskop und nehmen Sie Änderungen am Strahl mithilfe der Software vor. Stellen Sie sicher, dass der Laserstrahler ausgerichtet ist.Geben Sie vor der Bildgebung einen Tropfen Mikroskop-Tauchöl in das Objektiv. Bereiten Sie die lösliche Tubulinmischung vor, während Sie sie auf Eis halten, und schleudern Sie die Mischung ab. Um Mikrotubuli über Biotin-NeutrAvidin-Biotin-Bindung zu immobilisieren, fließen Sie zuerst in etwa 7,5 Mikroliter NeutrAvidin-Lösung, bis die Kammer gefüllt ist, und inkubieren Sie fünf Minuten lang.Mit 10 Mikrolitern MB kalt waschen. Gießen Sie 7,5 Mikroliter des blockierenden Proteins KC ein und inkubieren Sie für zwei Minuten. Mit 10 Mikrolitern MB warm waschen, um die Kammer für die Einführung von Mikrotubuli vorzubereiten.Verdünnen Sie den Bestand an biotinylierten Mikrotubuli in BRB ADDTT und fügen Sie einen Mikroliter dieser Verdünnung zu neun Mikrolitern MB warm hinzu. Gießen Sie die Mischung in die Kammer und inkubieren Sie sie für 10 Minuten. Nicht immobilisierte Mikrotubuli mit 10 Mikrolitern MB warm wegwaschen.Gießen Sie 7,5 Mikroliter warmes KC in die Kammer und inkubieren Sie für zwei Minuten. Während der Inkubation stellen Sie eine zwei-nanomolare Lösung des Vernetzungs- oder Proteins PRC1 in KC vor und schleudern die Lösung aus. Gießen Sie 10 Mikroliter dieser Lösung in die Bildgebungskammer und inkubieren Sie fünf Minuten lang.Um Bündel herzustellen, lassen Sie 10 Mikroliter nicht biotinylierte Mikrotubuli in die Kammer und inkubieren Sie sie für 10 Minuten. Waschen Sie die Kammer zweimal mit 10 Mikrolitern MB warm. Bereiten Sie während der 10-minütigen Inkubationszeit 10 Mikroliter Assay-Mischung mit interessanten Proteinen, löslichem Tubulin, Nukleotiden, Sauerstofffängern und Antioxidantien vor und schleudern Sie sie aus.Halten Sie die Mischung auf Eis. Laden Sie die vorbereitete Bildgebungskammer, die auf den Objektträgerhalter geklebt ist, auf das 100X TIRF-Objektiv. Verwenden Sie die Kanäle 560 Nanometer und 647 Nanometer, um ein Sichtfeld zu finden, das eine optimale Anzahl und Dichte einzelner Mikrotubuli und Bündel enthält.Sobald ein Sichtfeld identifiziert ist, nehmen Sie ein Referenzbild auf. Lassen Sie die Assay-Mischung vorsichtig einfließen, ohne die Bildgebungskammer zu stören. Versiegeln Sie die offenen Enden der Kammer mit VALAP-Dichtstoff.Beobachten Sie die Mikrotubuli und starten Sie die Bildgebungssequenz. Nach der Immobilisierung von Mikrotubulisamen und der Erzeugung von Bündeln wurden Fluoreszenzbilder erhalten. Einzelne Mikrotubuli wurden durch Fluoreszenzsignal im 647-Nanometer-Kanal identifiziert, während Mikrotubuli als vorgeformte Bündel identifiziert wurden, wenn sie Fluoreszenzsignale in beiden Kanälen zeigten.Die Dynamik einzelner Mikrotubuli und PRC1-vernetzter Bündel wurde in Gegenwart der Proteine KIF4A und CLASP1 untersucht, was zeigte, dass sich die einzelnen Mikrotubuli im Verlauf des Assays verlängern, während das Wachstum von vernetzten Mikrotubuli zum Stillstand kommt. Achten Sie darauf, polymerisierte Mikrotubuli bei oder über Raumtemperatur zu halten. Halten Sie lösliches Tubulin auf Eis und schützen Sie die Bildgebungskammer und fluoreszierend markierte Mikrotubuli und Proteine vor Licht.Diese Assays lieferten mechanistische Einblicke in die Art und Weise, wie ein Proteinmodul an der mitotischen Spindel die Dynamik von zwei verschiedenen Mikrotubulipopulationen, die in der Spindel koexistieren, unterschiedlich regulieren könnte.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Forschung

Biochemie

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Bildgebung von extrazellulären Vesikeln durch Atomkraftmikroskopie

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisierung der Diffusionsdynamik von Gold-Nanostäben auf der Zellmembran mit Single Nanoparticle Darkfield-Mikroskopie

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Verwendung von Mikrofluidik und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der Montagedynamik von einzelnen Actin-Filamenten und -Bündeln

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Visualisierung der Dynamik der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in vitro durch Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...