Name: simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy
Uploaded: 2022-02-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם NIH (מס ' 1DP2GM126894-01), ועל ידי כספים מקרנות הצדקה של פיו וקרן משפחת סמית ל- R.S. המחברים מודים לד"ר שו ג'יאנג על תרומתו לפיתוח ואופטימיזציה של הפרוטוקולים.

1. הכינו ריאגנטים
<ol><li>הכן מאגרים ורגנטים כמפורט בטבלה 1 ובטבלה 2. במהלך הניסוי, לשמור את כל הפתרונות על קרח, אלא אם כן צוין אחרת.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>תמיסה</td>
			<td colspan="2">רכיבים</td>
			<td>משך אחסון מומל...

<ol>
	<li>Subramanian, R., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+complexity:+insights+into+self-organized+assembly+of+microtubule-based+architectures.">Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures.</a> Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+determine+and+maintain+Drosophila+bristle+shape.">Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape.</a> Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).</li><li>Foe, V. E., von Dassow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+shape+the+myosin+activation+zone+during+cytokinetic+furrow+formation.">Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).</li><li>Pous, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specialization+of+stable+and+dynamic+microtubules+in+protein+traffic+in+WIF-B+cells.">Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells.</a> The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).</li><li>Uehara, R., Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+central+spindle+assembly+requires+de+novo+microtubule+generation+in+the+interchromosomal+region+during+anaphase.">Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+microtubule+plus-end+tracking+system+in+vitro.">Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro.</a> Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+pushing+and+braking+forces+generated+by+ensembles+of+Kinesin-5+crosslinking+two+microtubules.">Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules.</a> Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).</li><li>Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+single+microtubules+and+bundles+by+a+three-protein+module.">Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module.</a> Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).</li><li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTP+hydrolysis+in+microtubule+dynamics:+information+from+a+slowly+hydrolyzable+analogue,+GMPCPP.">Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).</li><li>Subramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+antiparallel+microtubule+crosslinking+by+PRC1,+a+conserved+nonmotor+microtubule+binding+protein.">Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein.</a> Cell. 142 (3), 433-443 (2010).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Wijeratne, S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+of+antiparallel+microtubule+bundles+regulates+relative+sliding+and+stalling+by+PRC1+and+Kif4A.">Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A.</a> eLife. 7, 32595 (2018).</li><li>Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+geometrical+features+of+microtubules+as+regulators+of+microtubule+organization.">Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization.</a> eLife. 10, 63880 (2021).</li><li>Freal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-driven+assembly+of+the+axon+initial+segment.">Feedback-driven assembly of the axon initial segment.</a> Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).</li><li>Ledbetter, M., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;microtubule&amp;#34;+in+plant+cell+fine+structure.">A &amp;#34;microtubule&amp;#34; in plant cell fine structure.</a> The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).</li><li>Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+reveals+distinct+protofilament-scale+structural+dynamics+in+depolymerizing+microtubule+arrays.">Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).</li></ol>

הניסוי המתואר כאן מרחיב באופן משמעותי את ההיקף והמורכבות של בדיקות שיקום מיקרוטובולות קונבנציונליות, המבוצעות באופן מסורתי על מיקרוטובולות בודדות או על סוג אחד של מערך. הבדיקה הנוכחית מספקת שיטה לכמת ולהשוות בו זמנית את פעילות MAP הרגולטורית על שתי אוכלוסיות, כלומר מיקרוטובולות בודדות וח...

מיקרוטובולים הם ביופולימרים היוצרים פיגומים מבניים החיוניים לתהליכים תאיים מרובים, החל מתחבורה תאית ומיצוב אברונים ועד לחלוקת תאים והתארכות. כדי לבצע פונקציות מגוונות אלה, microtubules בודדים מאורגנים לתוך מערכים בגודל מיקרון, כגון צירים מיטוטיים, אקסונמים ciliary, חבילות עצביות, מערכים אינטרפאזי, ומערכים קליפת המוח הצמחית. מוטיב אדריכלי הנמצא בכל מקום במבנים אלה הוא צרור של מיקרוטובולים המקושרים לאורכם1. מאפיין מסקרן של מספר מבנים מבוססי מיקרוטובולה הוא הדו-קיום של מיקרוטובולים ארוזים ומיקרוטובולות בודדות שאינן מקושרות בקרבה מרחבית קרובה. תת-אוכלוסיות מיקרוטובולות אלה יכולות להציג דינמיקת פילמור שונה בתכלית זו מזו, לפי הצורך לתפקודן התקין 2,3,4,5.5. לדוגמה, בתוך הציר המיטוטי, חבילות מקושרות יציבות ומיקרוטובולות בודדות דינמיות נמצאות בתוך אזור בקנה מידה מיקרוני במרכז התא6. לימוד האופן שבו המאפיינים הדינמיים של אוכלוסיות מיקרוטובולות מתקיימות יחד מצוין הוא, אם כן, מרכזי להבנת ההרכבה והתפקוד של מבנים מבוססי מיקרוטובולה.
מיקרוטובולים הם פולימרים דינמיים העוברים בין שלבי פילמור ודה-פילמור, ועוברים בין שני השלבים באירועים המכונים קטסטרופה והצלה7. הדינמיקה של מיקרוטובולים תאיים מוסדרת על ידי חלבונים נלווים Microtubule רבים (MAPs) המווסתים את שיעורי פילמור microtubule ו depolymerization ואת התדרים של קטסטרופה ואירועי הצלה. זה מאתגר לחקור את הפעילות של MAPs על מערכים פרוקסימליים מרחביים בתאים, בשל המגבלות של רזולוציה מרחבית במיקרוסקופיה קלה, במיוחד באזורים של צפיפות microtubule גבוהה. יתר על כן, נוכחותם של מספר MAPs באותו אזור תאי מעכבת פרשנויות של מחקרים ביולוגיים של התא. בדיקות שיחזור במבחנה, המבוצעות בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית השתקפות פנימית כוללת (TIRF), עוקפות את האתגרים של בחינת מנגנונים שבאמצעותם תת-קבוצות ספציפיות של MAPs מווסתות את הדינמיקה של מערכי מיקרוטובולה תאיים פרוקסימליים. כאן, הדינמיקה של microtubules מורכב במבחנה נבדקים בנוכחות אחד או יותר MAPs רקומביננטי בתנאים מבוקרים8,9,10. עם זאת, בדיקות שיקום קונבנציונליות מבוצעות בדרך כלל על מיקרוטובולות בודדות או על סוג אחד של מערך, ומונעות הדמיה של אוכלוסיות דו-קיום.
כאן, אנו מציגים בדיקות שיחזור במבחנה המאפשרות הדמיה סימולטנית של שתי אוכלוסיות microtubule תחת אותם תנאי פתרון11. אנו מתארים שיטה כדי להציג בו זמנית את הפעילות הקולקטיבית של MPs מרובים על microtubules יחיד ועל חבילות microtubule מוצלב על ידי ציר מיטואטי הקשורים חלבון PRC1. החלבון PRC1 נקשר באופן מועדף בחפיפה בין מיקרוטובולות אנטי-מקביליות, ומקשר אותן 9. בקצרה, פרוטוקול זה מורכב מהשלבים הבאים: (1) הכנת פתרונות מלאי ורגנטים, (ii) ניקוי וטיפול על פני השטח של כיסויים המשמשים ליצירת תא ההדמיה לניסויים במיקרוסקופיה, (iii) הכנת "זרעים" מיקרוטובוליים יציבים שמהם מתבצעת פילמור במהלך הניסוי, (4) מפרט של הגדרות מיקרוסקופ TIRF להדמיית דינמיקת מיקרוטובולה, (v) הטמעת זרעי מיקרוטובולה ויצירת חבילות מיקרוטובולה מקושרות בתא ההדמיה, ו-(vi) הדמיה של דינמיקת מיקרוטובול בתא ההדמיה באמצעות מיקרוסקופיה TIRF, בתוספת טובולין מסיס, MAPs ונוקלאוטידים. בדיקות אלה מאפשרות הערכה איכותית ובדיקה כמותית של לוקליזציה MAP והשפעתן על הדינמיקה של שתי אוכלוסיות מיקרוטובולות. בנוסף, הם מאפשרים את ההערכה של השפעות סינרגטיות של MAPs מרובים על אוכלוסיות microtubule אלה, על פני מגוון רחב של תנאים ניסיוניים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >238813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18x18 mm #1.5 coverslips&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24x60 mm #1.5 coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >405/488/560/647 nm Laser Quad Band&#160;</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>TRF89901-NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7699-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avidin, NeutrAvidin&#174; Biotin-binding Protein (Molecular Probes&#174;)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Delicate Task Wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET610/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200-proof)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GMPCPP</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>NU-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hellmanex III detergent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion oil, Type A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>77010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kappa-casein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lanolin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microfuge 16 Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90&#176; Ground Edges, WHITE Frosted</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380-50W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000&#160;</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#NH2-PEG-VA-5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optima&#8482; Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraffin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5377-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petrolatum, White</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plasma Cleaner, 115V</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2520-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#8482; Pierce&#8482; Bond-Breaker&#8482; TCEP Solution, Neutral pH; 500mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>PI-77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apochromat TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.1 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>362224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.2 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL620M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTABOND&#174; Reagent, Tissue Section Adhesion</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>SP-1800-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VWR&#174; Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97025-630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy

Microtubules הם פולימרים של הטרודימרים αβ-tubulin המארגנים למבנים נפרדים בתאים. ארכיטקטורות ורשתות מבוססות Microtubule מכילות לעתים קרובות תת-קבוצות של מערכי מיקרוטובולים השונים במאפייניהם הדינמיים. לדוגמה, בתאים מתחלקים, חבילות יציבות של מיקרוטובולות מקושרות מתקיימות בסמיכות למיקרוטובולות דינמיות שאינן מקושרות. מחקרי שחזור במבחנה מבוססי מיקרוסקופיה TIRF מאפשרים הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מערכי מיקרוטובולה שונים אלה. בבדיקה זו, תא הדמיה מורכב עם microtubules משותק פני השטח, אשר נמצאים גם חוטים בודדים או מאורגן לתוך חבילות מוצלבות. המבוא של טובולין, נוקלאוטידים, ויסותים חלבון מאפשר הדמיה ישירה של חלבונים הקשורים ושל תכונות דינמיות של microtubules יחיד מוצלב. יתר על כן, שינויים המתרחשים כמו microtubules יחיד דינמי לארגן לתוך חבילות ניתן לפקח בזמן אמת. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הערכה שיטתית של הפעילות והלוקליזציה של חלבונים בודדים, כמו גם השפעות סינרגטיות של רגולטורים של חלבונים על שתי תתי-קבוצות מיקרוטובולה שונות בתנאים ניסיוניים זהים, ובכך מספקת תובנות מכאניסטיות שאינן נגישות בשיטות אחרות.

הניסוי שתואר לעיל בוצע באמצעות 647 ננומטר מיקרוטובולות ביו-טינוליות עם תווית פלואורופור, 560 ננומטר פלואורופור שכותרתו מיקרוטובולות שאינן ביו-ביוטיניל, ותערובת טובולין מסיסה של 560 ננומטר פלואורופור. Microtubules היו מוצלבים על ידי חלבון crosslinker PRC1 (GFP שכותרתו). לאחר שנוצרו חבילות משותקות פני השטח ו?...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

כאן, בדיקת שחזור במבחנה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF מוצגת כדי לכמת ולהשוות בו זמנית את הדינמיקה של שתי אוכלוסיות microtubule. שיטה מתוארת כדי להציג בו זמנית את הפעילות הקולקטיבית של חלבונים מרובים הקשורים microtubule הקשורים על חבילות microtubule מקושרים ו microtubules יחיד.

הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מיקרוטובולים מקושרים ובודדים במבחנה על ידי מיקרוסקופיה TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

מערכי מיקרוטובולים תאיים מכילים תת-אוכלוסיות של מיקרוטובולות בעלות תכונות דינמיות ייחודיות כנדרש לתפקוד. פרוטוקול זה מתייחס לאופן שבו הפעילות הקולקטיבית של הרגולטורים מעניקה תת-אוכלוסיות מיקרו-רובוטיות פרוקסימליות עם תכונות שונות. בדיקת השבתה מלמטה למעלה זו מאפשרת לנו לדמיין בו זמנית את הארגון והדינמיקה של אוכלוסיות מיקרוטובולות פרוקסימליות כגון מיקרוטובולות וחבילות בודדות, ולפענח את המנגנונים העומדים בבסיס הארגון העצמי שלהם.שחזור רב-רכיבים דורש אופטימיזציה של פרמטרים ניסיוניים כמו pH, חוזק יוני וריכוז חלבונים תוך שמירה על הפעילות של כל אחד מהם. ניתוח שיטתי של רכיבים בודדים לפני בדיקות מרובות חלבונים הוא מאוד מועיל. כדי להתחיל, פיפטה תערובת של 4.5 מיקרוליטרים של BRB ADDTT במיקרוליטר אחד של פתרון microtubule על שקופית מיקרוסקופ.לכסות עם כיסוי 18 על 18 מ"מ ולאטום את הקצוות עם לק ברור או איטום VALAP. מקם את מטרת TIRF מתחת לכיסוי. דמיינו את המיקרוטובולות שעברו פולימר חדשים באורך גל המתאימים לטבולין המסומן בפלואורסצנטיות בתמהיל הבהיר כדי לקבוע באיזה דילול של מיקרוטובולות להשתמש בניסויים הקרובים.קבעו את עוצמת הלייזר לניסוי בצורה אמפירית כך שכל החלבונים הפלואורסצנטיים מוארים, אך אינם עוברים צילום משמעותי במהלך הניסוי. הגדר את טמפרטורת המיקרוסקופ ל 28 מעלות צלזיוס כדי להציג מיקרוטובולות דינמיות. השתמש בנייר עדשה כדי לנקות מטרה 100X עם 70% אתנול.השתמש בשילוב הטוב ביותר של קוביות מסנן ומסנני פליטה בהתאם לערוצי הפלואורסצנט שיש לדמות. הגדר את רצף ההדמיה. לניסוי עם 647 ננומטר פלואורופור שכותרתו biotinylated microtubules, 560 ננומטר פלואורופור שכותרתו מיקרוטובולות לא ביו-ביוטינילט בצינורולין מסיס, וחלבון GFP שכותרתו של עניין, תמונה 488 ננומטר, 560 ננומטר, ו 647 ננומטר ערוצים כל 10 שניות במשך 20 כל דקות.כדי ללכוד תמונת ייחוס של חבילות לפני התוספת של טובולין מסיס וחלבון הקשור למיקרוטובולה, הגדר רצף עם תמונה אחת כל אחד בתעלות 560 ננומטר ו 647 ננומטר אורך גל. בדוק את המיקום של קרן לייזר על התקרה מעל מיקרוסקופ ולבצע שינויים כדי לקרן באמצעות תוכנה. ודא כי מאיר הלייזר מיושר.לפני ההדמיה, להוסיף טיפה של שמן טבילה מיקרוסקופ למטרה. מכינים את תערובת טובולין מסיס תוך שמירה על קרח ומסובבים את התערובת. כדי לשתק microtubules באמצעות ביוטין-NeutrAvidin-ביוטין הצמדה, זרימה ראשונה בכ 7.5 מיקרוליטרים של פתרון NeutrAvidin עד שהתא מתמלא ודגר במשך חמש דקות.יש לשטוף עם 10 מיקרוליטרים של קור MB. זרימה ב-7.5 מיקרוליטרים של החלבון החוסם KC ודגרה לשתי דקות. לשטוף עם 10 microliters של MB חם כדי להכין את החדר להקדמה של microtubules.לדלל את המלאי של microtubules biotinylated ב- BRB ADDTT ולהוסיף מיקרוליטר אחד של דילול זה לתשעה מיקרוליטרים של MB חם. מזרימים את התערובת לתוך התא ודגורים במשך 10 דקות. יש לשטוף מיקרוטובולים שאינם משותקים עם 10 מיקרוליטרים של MB חם.יש להזרים 7.5 מיקרוליטרים של KC חם לתוך התא ולדגור במשך שתי דקות. במהלך הדגירה, להכין פתרון שני nanomolar של crosslink או חלבון PRC1 ב KC ולסובב את הפתרון. זרימה 10 מיקרוליטרים של פתרון זה לתוך תא ההדמיה ודגר במשך חמש דקות.כדי ליצור חבילות, זרימה 10 מיקרוליטרים של מיקרוטובולים שאינם ביו-ביוטינילים לתוך התא ודגרה במשך 10 דקות. לשטוף את התא פעמיים עם 10 מיקרוליטרים של MB חם. במהלך זמן הדגירה של 10 דקות, הכינו 10 מיקרוליטרים של תערובת בדיקה המכילה חלבונים מעניינים, טובולין מסיס, נוקלאוטידים, אוכלי נבלות חמצן ונוגדי חמצון וסובבו אותה.שמור את התערובת על קרח. טען את תא ההדמיה המוכן המודבק למחזיק השקופית במטרה 100X TIRF. השתמש בתעלות 560 ננומטר ו-647 ננומטר כדי למצוא שדה ראייה המכיל מספר וצפיפות אופטימליים של מיקרוטובולות וחבילות בודדות.לאחר זיהוי שדה תצוגה, צולם תמונת הפניה. בזהירות לזרום בתערובת הבדיקה מבלי להפריע לתא ההדמיה. לאטום את הקצוות הפתוחים של התא עם איטום VALAP.שים לב למיקרוטובולות ולהתחיל את רצף ההדמיה. לאחר השתקת זרעי microtubule ויצירת חבילות, תמונות פלואורסצנטיות התקבלו. מיקרוטובולות בודדות זוהו על ידי אות פלואורסצנטי בערוץ 647 ננומטר, ואילו מיקרוטובולות זוהו כחבילות מעוצבות מראש כאשר הם הציגו אותות פלואורסצנטיים בשני הערוצים.הדינמיקה של מיקרוטובולים בודדים וחבילות מוצלבות של PRC1 נחקרה בנוכחות החלבונים KIF4A ו- CLASP1, אשר גילו כי microtubules יחיד להאריך במהלך הבדיקה, בעוד הצמיחה של microtubules מקושר תקוע. יש להקפיד לשמור על מיקרוטובולות פולימריות בטמפרטורת החדר או מעליה. שמור טובולין מסיס על קרח והגן על תא ההדמיה ועל מיקרוטובולות וחלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית מפני אור.בדיקות אלה סיפקו תובנה מכאניסטית על האופן שבו מודול חלבון שנמצא בציר המיטוטי יכול לווסת באופן דיפרנציאלי את הדינמיקה של שתי אוכלוסיות מיקרוטובולות שונות שחיות יחד בציר.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

הדמיה של שלפוחיות ומסחטות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

הדמיה של דינמיקה דיפוזיונית של ננו-ירדס זהב על קרום התא באמצעות מיקרוסקופיה אחת של ננו-חלקיקים בדארקפילד

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

השתקפות הפרעה סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה מיקרוטובולים דינמיים וחלבונים נלווים

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...