Name: simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy
Uploaded: 2022-02-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NIH (nr. 1DP2GM126894-01), og av midler fra Pew Charitable Trusts og Smith Family Foundation til R.S. Forfatterne takker Dr. Shuo Jiang for hans bidrag til utvikling og optimalisering av protokollene.

1. Forbered reagenser
<ol><li>Klargjør buffere og reagenser som beskrevet i tabell 1 og tabell 2. Under eksperimentet, hold alle løsninger på is, med mindre annet er angitt.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Løsning</td>
			<td colspan="2">Komponenter</td>
			<td>Anbefalt lagringsvarighet</td>
			<td colspan="2">Notater</stro...

<ol>
	<li>Subramanian, R., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+complexity:+insights+into+self-organized+assembly+of+microtubule-based+architectures.">Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures.</a> Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+determine+and+maintain+Drosophila+bristle+shape.">Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape.</a> Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).</li><li>Foe, V. E., von Dassow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+shape+the+myosin+activation+zone+during+cytokinetic+furrow+formation.">Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).</li><li>Pous, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specialization+of+stable+and+dynamic+microtubules+in+protein+traffic+in+WIF-B+cells.">Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells.</a> The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).</li><li>Uehara, R., Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+central+spindle+assembly+requires+de+novo+microtubule+generation+in+the+interchromosomal+region+during+anaphase.">Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+microtubule+plus-end+tracking+system+in+vitro.">Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro.</a> Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+pushing+and+braking+forces+generated+by+ensembles+of+Kinesin-5+crosslinking+two+microtubules.">Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules.</a> Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).</li><li>Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+single+microtubules+and+bundles+by+a+three-protein+module.">Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module.</a> Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).</li><li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTP+hydrolysis+in+microtubule+dynamics:+information+from+a+slowly+hydrolyzable+analogue,+GMPCPP.">Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).</li><li>Subramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+antiparallel+microtubule+crosslinking+by+PRC1,+a+conserved+nonmotor+microtubule+binding+protein.">Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein.</a> Cell. 142 (3), 433-443 (2010).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Wijeratne, S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+of+antiparallel+microtubule+bundles+regulates+relative+sliding+and+stalling+by+PRC1+and+Kif4A.">Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A.</a> eLife. 7, 32595 (2018).</li><li>Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+geometrical+features+of+microtubules+as+regulators+of+microtubule+organization.">Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization.</a> eLife. 10, 63880 (2021).</li><li>Freal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-driven+assembly+of+the+axon+initial+segment.">Feedback-driven assembly of the axon initial segment.</a> Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).</li><li>Ledbetter, M., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;microtubule&amp;#34;+in+plant+cell+fine+structure.">A &amp;#34;microtubule&amp;#34; in plant cell fine structure.</a> The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).</li><li>Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+reveals+distinct+protofilament-scale+structural+dynamics+in+depolymerizing+microtubule+arrays.">Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).</li></ol>

Eksperimentet beskrevet her utvider omfanget og kompleksiteten til konvensjonelle mikrotubul rekonstitueringsanalyser, som tradisjonelt utføres på enkeltmikrotubuler eller på en type array. Den nåværende analysen gir en metode for samtidig å kvantifisere og sammenligne den regulatoriske MAP-aktiviteten på to populasjoner, nemlig enkle mikrotubuler og krysskoblede bunter. Videre tillater denne analysen undersøkelse av to typer bunter: de som er forhåndsformet fra stabile frø før oppstart av dynamikk, og de som ...

Mikrotubuler er biopolymerer som danner strukturelle stillaser som er avgjørende for flere cellulære prosesser, alt fra intracellulær transport og organellposisjonering til celledeling og forlengelse. For å utføre disse forskjellige funksjonene, er individuelle mikrotubuler organisert i mikron-størrelse arrays, for eksempel mitotiske spindler, ciliary axonemes, nevronale bunter, interfase arrays og plante kortikale arrayer. Et allestedsnærværende arkitektonisk motiv som finnes i disse strukturene er en bunt mikrotubuler krysset langs lengdene1. Et spennende trekk ved flere mikrotubulebaserte strukturer er sameksistensen av buntede mikrotubuler og ikke-krysskoblede enkeltmikrotubuler i nær romlig nærhet. Disse mikrotubule subpopulations kan vise sterkt forskjellig polymerisasjonsdynamikk fra hverandre, etter behov for riktig funksjon2,3,4,5. For eksempel, innenfor den mitotiske spindelen, er stabile krysskoblede bunter og dynamiske enkeltmikrotubuler til stede i et mikronskalaområde ved cellesenteret6. Å studere hvordan de dynamiske egenskapene til sameksistens mikrotubulpopulasjoner er spesifisert, er derfor sentralt for å forstå montering og funksjon av mikrotubulebaserte strukturer.
Mikrotubuler er dynamiske polymerer som veksler mellom faser av polymerisasjon og depolymerisering, og bytter mellom de to fasene i hendelser kjent som katastrofe og redning7. Dynamikken i cellulære mikrotubuler er regulert av myriade Microtubule Associated Proteins (MAPs) som modulerer frekvensen av mikrotubul polymerisering og depolymerisering og frekvensene av katastrofe- og redningshendelser. Det er utfordrende å undersøke maps aktivitet på romlig proksimale arrayer i celler, på grunn av begrensningene i romlig oppløsning i lysmikroskopi, spesielt i områder med høy mikrotubul tetthet. Videre hindrer tilstedeværelsen av flere MAPer i samme cellulære region tolkninger av cellebiologiske studier. In vitro rekonstitueringsanalyser, utført i forbindelse med TOTAL Internal Reflection Fluorescence (TIRF) mikroskopi, omgår utfordringene med å undersøke mekanismer der spesifikke undergrupper av MAPer regulerer dynamikken i proksimale cellulære mikrotubule arrayer. Her undersøkes dynamikken i mikrotubuler samlet in vitro i nærvær av en eller flere rekombinante MAPer under kontrollerte forhold8,9,10. Konvensjonelle rekonstitueringsanalyser utføres imidlertid vanligvis på enkle mikrotubuler eller på en type matrise, noe som utelukker visualiseringen av samtidige populasjoner.
Her presenterer vi in vitro rekonstitueringsanalyser som muliggjør samtidig visualisering av to mikrotubulpopulasjoner under de samme løsningsbetingelsene11. Vi beskriver en metode for samtidig å se den kollektive aktiviteten til flere MAPer på enkeltmikrotubuler og på mikrotubulbunter krysskoblet av det mititotiske spindel-assosierte proteinet PRC1. Proteinet PRC1 binder seg fortrinnsvis ved overlappingen mellom anti-parallelle mikrotubuler, krysskobler dem9. Kort sagt består denne protokollen av følgende trinn: (i) fremstilling av lagerløsninger og reagenser, (ii) rengjøring og overflatebehandling av deksler som brukes til å lage bildekammeret for mikroskopiforsøk, (iii) fremstilling av stabile mikrotubule "frø" hvorfra polymerisasjon initieres under eksperimentet, (iv) spesifikasjon av TIRF mikroskopinnstillinger for å visualisere mikrotubuldynamikk, (v) immobilisering av mikrotubule frø og generering av krysskoblede mikrotubule bunter i bildekammeret, og (vi) visualisering av mikrotubuldynamikk i bildekammeret gjennom TIRF-mikroskopi, ved tilsetning av løselig tubulin, MAPer og nukleotider. Disse analysene muliggjør kvalitativ evaluering og kvantitativ undersøkelse av MAP lokalisering og deres effekt på dynamikken i to mikrotubule populasjoner. I tillegg legger de til rette for evaluering av synergistiske effekter av flere MAPer på disse mikrotubule populasjonene, på tvers av et bredt spekter av eksperimentelle forhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >238813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18x18 mm #1.5 coverslips&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24x60 mm #1.5 coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >405/488/560/647 nm Laser Quad Band&#160;</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>TRF89901-NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7699-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avidin, NeutrAvidin&#174; Biotin-binding Protein (Molecular Probes&#174;)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Delicate Task Wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET610/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200-proof)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GMPCPP</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>NU-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hellmanex III detergent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion oil, Type A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>77010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kappa-casein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lanolin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microfuge 16 Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90&#176; Ground Edges, WHITE Frosted</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380-50W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000&#160;</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#NH2-PEG-VA-5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optima&#8482; Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraffin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5377-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petrolatum, White</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plasma Cleaner, 115V</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2520-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#8482; Pierce&#8482; Bond-Breaker&#8482; TCEP Solution, Neutral pH; 500mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>PI-77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apochromat TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.1 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>362224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.2 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL620M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTABOND&#174; Reagent, Tissue Section Adhesion</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>SP-1800-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VWR&#174; Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97025-630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy

Mikrotubuler er polymerer av αβ-tubulin heterodimers som organiserer seg i forskjellige strukturer i celler. Mikrotubulebaserte arkitekturer og nettverk inneholder ofte delsett av mikrotubule-matriser som er forskjellige i deres dynamiske egenskaper. For eksempel, i å dele celler, sameksisterer stabile bunter av krysskoblede mikrotubuler i nærheten av dynamiske ikke-krysskoblede mikrotubuler. TIRF-mikroskopibaserte in vitro rekonstitueringsstudier muliggjør samtidig visualisering av dynamikken i disse forskjellige mikrotubule arrayene. I denne analysen er et bildekammer montert med overflate-immobiliserte mikrotubuler, som enten er til stede som enkeltfilamenter eller organisert i krysskoblede bunter. Innføring av tubulin-, nukleotider og proteinregulatorer tillater direkte visualisering av tilknyttede proteiner og av dynamiske egenskaper av enkle og krysskoblede mikrotubuler. Videre kan endringer som skjer som dynamiske enkeltmikrotubuler organiseres i bunter overvåkes i sanntid. Metoden beskrevet her tillater en systematisk evaluering av aktiviteten og lokaliseringen av individuelle proteiner, samt synergistiske effekter av proteinregulatorer på to forskjellige mikrotubule-delsett under identiske eksperimentelle forhold, og gir dermed mekanistisk innsikt som er utilgjengelig ved andre metoder.

Eksperimentet beskrevet ovenfor ble utført ved hjelp av 647 nm fluorofor-merkede biotinylerte mikrotubuler, 560 nm fluorofor-merket ikke-biotinylerte mikrotubuler og 560 nm fluorofor-merket løselig tubulinblanding. Mikrotubuler ble krysskoblet av krysskoblingsproteinet PRC1 (GFP-merket). Etter at overflate-immobiliserte bunter og enkeltmikrotubuler ble generert (trinn 5.11), ble bildekammeret montert på et TIRF 100X 1.49 NA oljemål og sett i 560 nm og 647 nm fluorescenskanaler. Enkeltmikrotubuler ble identifisert av ...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Her presenteres en TIRF-mikroskopibasert in vitro rekonstitueringsanalyse for samtidig å kvantifisere og sammenligne dynamikken i to mikrotubulpopulasjoner. En metode er beskrevet for samtidig å se den kollektive aktiviteten til flere mikrotubule-assosierte proteiner på krysskoblede mikrotubulbunter og enkle mikrotubuler.

Samtidig visualisering av dynamikken i krysskoblede og enkle mikrotubuler in vitro av TIRF mikroskopi

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Cellulære mikrotubule-matriser inneholder delpopulasjoner av mikrotubuler med distinkte dynamiske egenskaper etter behov for funksjon. Denne protokollen tar for seg hvordan den kollektive aktiviteten til regulatorer gir proksimale mikrotubule subpopulations med distinkte egenskaper. Denne nedenfra-og-opp-restitusjonsanalysen gjør det mulig for oss samtidig å visualisere organiseringen og dynamikken i proksimale mikrotubulpopulasjoner som enkle mikrotubuler og bunter, og å dechiffrere mekanismene som ligger til grunn for deres selvorganisering.Rekonstituering av flere komponenter krever optimalisering av eksperimentelle parametere som pH, ionstyrke og proteinkonsentrasjon samtidig som aktiviteten til hver av dem bevares. Systematisk analyse av individuelle komponenter før multiproteinanalyser er ekstremt nyttig. Til å begynne med pipette en blanding av 4,5 mikroliter BRB ADDTT i en mikroliter mikrotubulløsning på et mikroskopsklie.Dekk med en 18 x 18 millimeter dekslerlip og forsegle kantene med enten klar neglelakk eller VALAP tetningsmasse. Plasser TIRF-målet under dekslene. Visualiser de nylig polymeriserte mikrotubulene ved en bølgelengde som passer for fluorescerende merket tubulin i den lyse blandingen for å bestemme hvilken fortynning av mikrotubuler som skal brukes i de kommende forsøkene.Bestem laserintensiteten for eksperimentet empirisk slik at alle fluorescerende proteiner lyser, men ikke gjennomgår betydelig fotobleaching i løpet av eksperimentet. Sett mikroskoptemperaturen til 28 grader Celsius for å se dynamiske mikrotubuler. Bruk linsepapir til å rengjøre et 100X-mål med 70 % etanol.Bruk den beste kombinasjonen av filterbiter og utslippsfiltre avhengig av fluorescerende kanaler som skal avbildes. Sett opp bildesekvensen. For et eksperiment med 647 nanometer fluorofor-merkede biotinylerte mikrotubuler, 560 nanometer fluorofor-merket ikke-biotinylerte mikrotubuler i løselig tubulin, og GFP-merket protein av interesse, bilde 488 nanometer, 560 nanometer og 647 nanometerkanaler hvert 10.For å fange et referansebilde av bunter før tilsetning av løselig tubulin og mikrotubule-assosiert protein, sett opp en sekvens med ett bilde hver i 560 nanometer og 647 nanometerbølgelengdekanaler. Kontroller posisjonen til laserstrålen i taket over mikroskopet og gjør endringer i strålen ved hjelp av programvare. Kontroller at laserbelysningen er justert.Før avbildning, legg til en dråpe mikroskop nedsenkningsolje til målet. Forbered den oppløselige tubulinblandingen mens du holder den på is og spinn ned blandingen. For å immobilisere mikrotubuler via biotin-NeutrAvidin-biotinkobling, strømning først i ca. 7,5 mikroliter NeutrAvidin-oppløsning til kammeret er fylt og inkubert i fem minutter.Vask med 10 mikroliter MB kaldt. Strømning i 7,5 mikroliter av det blokkerende proteinet KC og inkuber i to minutter. Vask med 10 mikroliter MB varme for å forberede kammeret for innføring av mikrotubuler.Fortynn bestanden av biotinylerte mikrotubuler i BRB ADDTT og tilsett en mikroliter av denne fortynning til ni mikroliter MB varme. Strømning blandingen inn i kammeret og inkuber i 10 minutter. Vask bort ikke-immobiliserte mikrotubuler med 10 mikroliter MB varme.Strømning 7,5 mikroliter varm KC inn i kammeret og inkuber i to minutter. Under inkubasjonen, lag en to nanomolarløsning av krysskoblingen eller proteinet PRC1 i KC og spinn ned løsningen. Strømning 10 mikroliter av denne løsningen inn i bildekammeret og inkuber i fem minutter.For å lage bunter, strømning 10 mikroliter ikke-biotinylerte mikrotubuler inn i kammeret og inkubere i 10 minutter. Vask kammeret to ganger med 10 mikroliter MB varme. I løpet av 10-minutters inkubasjonstid, lag 10 mikroliter analyseblanding som inneholder proteiner av interesse, løselig tubulin, nukleotider, oksygenfangere og antioksidanter og spinn den ned.Hold blandingen på is. Legg det forberedte bildekammeret teipet til skyveholderen på 100X TIRF-målet. Bruk 560 nanometer og 647 nanometerkanaler for å finne et synsfelt som inneholder et optimalt antall og tetthet av enkle mikrotubuler og bunter.Når et synsfelt er identifisert, tar du et referansebilde. Strømning forsiktig i analyseblandingen uten å forstyrre bildekammeret. Forsegle de åpne endene av kammeret med VALAP tetningsmasse.Vær oppmerksom på mikrotubulene og start bildesekvensen. Etter å ha immobilisert mikrotubule frø og generere bunter, ble fluorescensbilder oppnådd. Enkeltmikrotubuler ble identifisert ved fluorescerende signal i 647 nanometerkanalen, mens mikrotubuler ble identifisert som forhåndsformede bunter da de viste fluorescerende signaler i begge kanaler.Dynamikken i enkeltmikrotubuler og PRC1 krysskoblede bunter ble studert i nærvær av proteinene KIF4A og CLASP1, som avslørte at de enkle mikrotubulene forlenger i løpet av analysen, mens veksten av krysskoblede mikrotubuler stoppes. Pass på å holde polymeriserte mikrotubuler ved eller over romtemperatur. Hold løselig tubulin på is og beskytt bildekammeret og fluorescerende merkede mikrotubuler og proteiner mot lys.Disse analysene ga mekanistisk innsikt i hvordan en proteinmodul som finnes ved den mitotiske spindelen, differensialt kunne regulere dynamikken i to forskjellige mikrotubulpopulasjoner som sameksisterer i spindelen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Verifiserer strukturen og dynamikken i Nucleosomes med Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imaging av ekstracellulære blemmer av Atomic Force mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-cell reseptor Dynamics firedimensjonalt ved hjelp av gitter lysark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produksjon av Dynein og Kinesin motor ensembler på DNA Origami nanostrukturer for single molekyl observasjon

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisere diffus dynamikk av gull nanorods på cellemembran ved hjelp av enkelt nanopartikkel Darkfield mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse av transkripsjonsaktive alleler av enkeltmolekyl fisk

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Samtidig interferensrefleksjon og total intern refleksjon Fluorescensmikroskopi for avbildning av dynamiske mikrotubuler og tilhørende proteiner

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Bruke mikrofluidikk og fluorescensmikroskopi til å studere monteringsdynamikken til enkelt actinfilamenter og bunter

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Visualisere Actin og Microtubule Koblingsdynamikk In Vitro av Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopi

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...