Name: simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy
Uploaded: 2022-02-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do NIH (nº 1DP2GM126894-01), e por fundos da Pew Charitable Trusts e da Smith Family Foundation para r.S. Os autores agradecem ao Dr. Shuo Jiang por sua contribuição para o desenvolvimento e otimização dos protocolos.

1. Prepare os reagentes
<ol><li>Prepare buffers e reagentes conforme descrito na Tabela 1 e Tabela 2. Durante o experimento, mantenha todas as soluções no gelo, a menos que seja observado de outra forma.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solução</td>
			<td colspan="2">Componentes</td>
			<td>Duração recomendada do armazenamento</t...

<ol>
	<li>Subramanian, R., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+complexity:+insights+into+self-organized+assembly+of+microtubule-based+architectures.">Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures.</a> Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+determine+and+maintain+Drosophila+bristle+shape.">Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape.</a> Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).</li><li>Foe, V. E., von Dassow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+shape+the+myosin+activation+zone+during+cytokinetic+furrow+formation.">Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).</li><li>Pous, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specialization+of+stable+and+dynamic+microtubules+in+protein+traffic+in+WIF-B+cells.">Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells.</a> The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).</li><li>Uehara, R., Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+central+spindle+assembly+requires+de+novo+microtubule+generation+in+the+interchromosomal+region+during+anaphase.">Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+microtubule+plus-end+tracking+system+in+vitro.">Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro.</a> Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+pushing+and+braking+forces+generated+by+ensembles+of+Kinesin-5+crosslinking+two+microtubules.">Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules.</a> Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).</li><li>Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+single+microtubules+and+bundles+by+a+three-protein+module.">Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module.</a> Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).</li><li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTP+hydrolysis+in+microtubule+dynamics:+information+from+a+slowly+hydrolyzable+analogue,+GMPCPP.">Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).</li><li>Subramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+antiparallel+microtubule+crosslinking+by+PRC1,+a+conserved+nonmotor+microtubule+binding+protein.">Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein.</a> Cell. 142 (3), 433-443 (2010).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Wijeratne, S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+of+antiparallel+microtubule+bundles+regulates+relative+sliding+and+stalling+by+PRC1+and+Kif4A.">Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A.</a> eLife. 7, 32595 (2018).</li><li>Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+geometrical+features+of+microtubules+as+regulators+of+microtubule+organization.">Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization.</a> eLife. 10, 63880 (2021).</li><li>Freal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-driven+assembly+of+the+axon+initial+segment.">Feedback-driven assembly of the axon initial segment.</a> Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).</li><li>Ledbetter, M., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;microtubule&amp;#34;+in+plant+cell+fine+structure.">A &amp;#34;microtubule&amp;#34; in plant cell fine structure.</a> The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).</li><li>Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+reveals+distinct+protofilament-scale+structural+dynamics+in+depolymerizing+microtubule+arrays.">Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).</li></ol>

O experimento descrito aqui expande significativamente o escopo e a complexidade dos ensaios convencionais de reconstituição da microtúbula, que são tradicionalmente realizados em microtúbulos únicos ou em um tipo de matriz. O ensaio atual fornece um método para quantificar e comparar simultaneamente a atividade de MAP regulatório em duas populações, ou seja, microtúbulos únicos e pacotes interligados. Além disso, este ensaio permite o exame de dois tipos de feixes: aqueles que são pré-formados a partir de...

Microtúbulos são biopolímeros que formam andaimes estruturais essenciais para múltiplos processos celulares, desde transporte intracelular e posicionamento de organela até divisão celular e alongamento. Para executar essas diversas funções, microtúbulos individuais são organizados em matrizes do tamanho de micron, como fusos mitotísticos, axônios ciliares, feixes neuronais, matrizes interfásicas e matrizes corticais vegetais. Um motivo arquitetônico onipresente encontrado nessas estruturas é um feixe de microtúbulos interligados ao longo de seus comprimentos1. Uma característica intrigante de várias estruturas baseadas em microtúbulos é a coexistência de microtúbulos empacotados e microtúbulos únicos não-cruzados nas proximidades espaciais próximas. Essas subpopulações de microtúbulos podem exibir dinâmicas de polimerização totalmente diferentes umas das outras, conforme necessário para sua função adequada2,3,4,5. Por exemplo, dentro do eixo mitotístico, pacotes interligados estáveis e microtúbulos únicos dinâmicos estão presentes dentro de uma região de escala de micron no centro celular6. Estudar como as propriedades dinâmicas das populações de microtúbulos coexistindo são especificadas é, portanto, central para entender a montagem e função das estruturas baseadas em microtúbulos.
Microtúbulos são polímeros dinâmicos que pedalam entre fases de polimerização e despolimerização, alternando entre as duas fases em eventos conhecidos como catástrofe e resgate7. A dinâmica dos microtúbulos celulares é regulada por uma miríade de Proteínas Associadas a Microtúbulos (MAPs) que modulam as taxas de polimerização e despomerização de microtúbulos e as frequências de eventos de catástrofe e resgate. É desafiador investigar a atividade de MAPs em matrizes espacialmente proximais nas células, devido às limitações da resolução espacial na microscopia de luz, especialmente em regiões de alta densidade de microtúbulos. Além disso, a presença de múltiplos MAPs na mesma região celular dificulta interpretações de estudos biológicos celulares. Ensaios de reconstituição in vitro, realizados em conjunto com a microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total (TIRF), contornam os desafios de examinar mecanismos pelos quais subconjuntos específicos de MAPs regulam a dinâmica das matrizes de microtúbulos celulares proximais. Aqui, a dinâmica dos microtúbulos montados in vitro são examinadas na presença de um ou mais MAPs recombinantes em condições controladas8,9,10. No entanto, os ensaios convencionais de reconstituição são tipicamente realizados em microtúbulos únicos ou em um tipo de matriz, impedindo a visualização de populações coexistindo.
Aqui, apresentamos ensaios de reconstituição in vitro que permitem a visualização simultânea de duas populações de microtúbulos sob as mesmas condições de solução11. Descrevemos um método para visualizar simultaneamente a atividade coletiva de múltiplos MAPs em microtúbulos únicos e em feixes de microtúbulos interligados pela proteína mitomática associada ao fuso PRC1. A proteína PRC1 se liga preferencialmente à sobreposição entre microtúbulos anti-paralelos, cruzando-os9. Resumidamente, este protocolo consiste nas seguintes etapas: (i) preparação de soluções de estoque e reagentes, (ii) limpeza e tratamento superficial de deslizamentos de cobertura usados para criar a câmara de imagem para experimentos de microscopia, (iii) preparação de "sementes" de microtúbulos estáveis a partir das quais a polimerização é iniciada durante o experimento, (iv) especificação das configurações do microscópio TIRF para visualizar a dinâmica dos microtúbulos, (v) a imobilização de sementes de microtúbulos e a geração de feixes de microtúbulos transligados na câmara de imagem, e (vi) visualização da dinâmica do microtúbulo na câmara de imagem através da microscopia TIRF, mediante a adição de tubulina solúvel, MAPs e nucleotídeos. Esses ensaios permitem a avaliação qualitativa e o exame quantitativo da localização do MAP e seu efeito na dinâmica de duas populações microtúbulas. Além disso, facilitam a avaliação dos efeitos sinérgicos de múltiplos MAPs nessas populações de microtúbulos, em uma ampla gama de condições experimentais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >238813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18x18 mm #1.5 coverslips&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24x60 mm #1.5 coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >405/488/560/647 nm Laser Quad Band&#160;</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>TRF89901-NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7699-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avidin, NeutrAvidin&#174; Biotin-binding Protein (Molecular Probes&#174;)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Delicate Task Wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET610/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200-proof)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GMPCPP</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>NU-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hellmanex III detergent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion oil, Type A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>77010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kappa-casein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lanolin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microfuge 16 Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90&#176; Ground Edges, WHITE Frosted</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380-50W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000&#160;</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#NH2-PEG-VA-5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optima&#8482; Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraffin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5377-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petrolatum, White</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plasma Cleaner, 115V</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2520-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#8482; Pierce&#8482; Bond-Breaker&#8482; TCEP Solution, Neutral pH; 500mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>PI-77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apochromat TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.1 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>362224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.2 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL620M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTABOND&#174; Reagent, Tissue Section Adhesion</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>SP-1800-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VWR&#174; Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97025-630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy

Microtúbulos são polímeros de heterodimers αβ-tubulin que se organizam em estruturas distintas nas células. Arquiteturas e redes baseadas em microtúbulos geralmente contêm subconjuntos de matrizes de microtúbulos que diferem em suas propriedades dinâmicas. Por exemplo, na divisão de células, pacotes estáveis de microtúbulos transligados coexistem perto de microtúbulos dinâmicos não transligados. Estudos de reconstituição in vitro baseados em TIRF-microscopia permitem a visualização simultânea da dinâmica dessas diferentes matrizes de microtúbulos. Neste ensaio, uma câmara de imagem é montada com microtúbulos imobilizados pela superfície, que estão presentes como filamentos únicos ou organizados em feixes transligados. A introdução de tubulinas, nucleotídeos e reguladores de proteínas permite a visualização direta de proteínas associadas e de propriedades dinâmicas de microtúbulos unides e interligados. Além disso, mudanças que ocorrem à medida que microtúbulos únicos dinâmicos se organizam em pacotes podem ser monitorados em tempo real. O método descrito aqui permite uma avaliação sistemática da atividade e localização de proteínas individuais, bem como efeitos sinérgicos dos reguladores de proteínas em dois subconjuntos microtúbulos diferentes em condições experimentais idênticas, fornecendo assim insights mecanicistas que são inacessíveis por outros métodos.

O experimento descrito acima foi realizado usando microtubulos biotinilados biotinilados rotulados por 647 nm, microtubulas não biotiniladas com rótulo fluoreto, e mistura de tubulina solúvel com rótulo fluorólmico de 560 nm. Os microtúbulos foram cruzados pela proteína crosslinker PRC1 (rotulada por GFP). Após a gerada por feixes imobilizados e microtúbulos únicos (etapa 5.11), a câmara de imagem foi montada em um objetivo de óleo TIRF 100X 1.49 NA e visualizada nos canais de fluorescência de 560 nm e 647 n...

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Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Aqui, um ensaio de reconstituição in vitro baseado em microscopia TIRF é apresentado para quantificar e comparar simultaneamente a dinâmica de duas populações de microtúbulos. Um método é descrito para visualizar simultaneamente a atividade coletiva de múltiplas proteínas associadas a microtúbulos em feixes de microtúbulos interligados e microtúbulos únicos.

Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

As matrizes de microtúbulos celulares contêm subpopulações de microtúbulos com propriedades dinâmicas distintas, conforme necessário para a função. Este protocolo aborda como a atividade coletiva dos reguladores concede subpopulações proximais de microtúbulos com propriedades distintas. Este ensaio de restituição de baixo para cima nos permite visualizar simultaneamente a organização e a dinâmica das populações proximais de microtúbulos, como microtúbulos e pacotes únicos, e decifrar os mecanismos subjacentes à sua auto-organização.A reconstituição multicomponimento requer a otimização de parâmetros experimentais como pH, força iônica e concentração de proteínas, preservando a atividade de cada um. A análise sistemática de componentes individuais antes dos ensaios multifismes é extremamente útil. Para começar, pipeta uma mistura de 4,5 microlitros de BRB ADDTT em um microliter de solução de microtúbulo em um slide de microscópio.Cubra com uma tampa de 18 por 18 milímetros e sele as bordas com esmalte transparente ou selante VALAP. Posicione o objetivo da TIRF abaixo do deslizamento de cobertura. Visualize os microtúbulos recém-polimerizados em um comprimento de onda apropriado para a tubulina fluorescentemente rotulada na mistura brilhante para determinar que diluição de microtúbulos devem ser usados nos próximos experimentos.Determine a intensidade do laser para o experimento empiricamente de tal forma que todas as proteínas fluorescentes sejam iluminadas, mas não submetam fotobleaching significativo ao longo do tempo do experimento. Defina a temperatura do microscópio para 28 graus Celsius para visualizar microtúbulos dinâmicos. Use papel de lente para limpar um objetivo de 100X com 70% de etanol.Use a melhor combinação de cubos de filtro e filtros de emissão, dependendo dos canais fluorescentes a serem imagens. Configure a sequência de imagens. Para um experimento com microtúbulos biotinídos biotinilados rotulados por 647 nanômetros, 560 nanometros de microtúbulos não biotinilados rotulados em tubulina solúvel, e proteína de interesse rotulada por GFP, imagem dos canais de 488 nanômetros, 560 nanômetros e 647 nanômetros a cada 10 segundos por 20 minutos.Para capturar uma imagem de referência de feixes antes da adição de tubulina solúvel e proteína associada a microtúbulos, configure uma sequência com uma imagem cada em 560 nanômetros e 647 canais de comprimento de onda de nanômetros. Verifique a posição do raio laser no teto acima do microscópio e faça alterações no feixe usando software. Certifique-se de que o iluminador a laser esteja alinhado.Antes da imagem, adicione uma gota de óleo de imersão de microscópio ao objetivo. Prepare a mistura de tubulina solúvel enquanto a mantém no gelo e gire a mistura. Para imobilizar microtúbulos via linkagem biotina-NeutrAvidin-biotina, primeiro fluxo em aproximadamente 7,5 microliters de solução NeutrAvidin até que a câmara seja preenchida e incubada por cinco minutos.Lave com 10 microliters de MB frio. Flua em 7,5 microliters da proteína de bloqueio KC e incubar por dois minutos. Lave com 10 microliters de MB quentes para preparar a câmara para a introdução de microtúbulos.Diluir o estoque de microtúbulos biotinínilcos no BRB ADDTT e adicionar um microliter desta diluição a nove microlitrais de MB quente. Escoar a mistura na câmara e incubar por 10 minutos. Lave microtúbulos não imobilizados com 10 microlitres de MB quentes.Flua 7,5 microliters de KC quente na câmara e incubar por dois minutos. Durante a incubação, prepare uma solução de dois nanomolars do crosslink ou proteína PRC1 em KC e gire a solução. Flua 10 microliters desta solução para a câmara de imagem e incubar por cinco minutos.Para fazer pacotes, flua 10 microliters de microtúbulos não biotinilados na câmara e incubar por 10 minutos. Lave a câmara duas vezes com 10 microliters de MB quente. Durante o período de incubação de 10 minutos, prepare 10 microliters de mistura de ensaio contendo proteínas de interesse, tubulina solúvel, nucleotídeos, catadores de oxigênio e antioxidantes e gire-o para baixo.Mantenha a mistura no gelo. Carregue a câmara de imagem preparada colada no suporte de slides no objetivo 100X TIRF. Use os canais de 560 nanômetros e 647 nanômetros para encontrar um campo de visão que contenha um número e densidade ideal de microtúbulos e feixes únicos.Uma vez identificado um campo de visão, pegue uma imagem de referência. Flua cuidadosamente na mistura de ensaios sem perturbar a câmara de imagem. Sele as extremidades abertas da câmara com selante VALAP.Observe os microtúbulos e inicie a sequência de imagens. Após a imobilização de sementes de microtúbulos e os feixes geradores, foram obtidas imagens de fluorescência. Microtúbulos únicos foram identificados por sinal fluorescente no canal de 647 nanômetros, enquanto microtúbulos foram identificados como feixes pré-formados quando exibiam sinais fluorescentes em ambos os canais.A dinâmica dos microtúbulos únicos e dos feixes crosslinked prC1 foram estudadas na presença das proteínas KIF4A e CLASP1, que revelaram que os microtúbulos únicos se alongam ao longo do ensaio, enquanto o crescimento de microtúbulos interligados está parado. Tenha cuidado para manter os microtúbulos polimerizados a temperatura ambiente ou acima. Mantenha a tubulina solúvel no gelo e proteja a câmara de imagem e microtúbulos e proteínas fluorescentes da luz.Esses ensaios forneceram uma visão mecanicista de como um módulo proteico encontrado no fuso mitotístico poderia regular diferencialmente a dinâmica de duas populações diferentes de microtúbulos que coexistem no fuso.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Bioquímica

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imagens de vesículas extracelulares por microscopia de força atômica

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualizando dinâmica sadrindo de receptor estéta de células t usando microscopia de folha de luz de rede

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualizando dinâmica difusional de nanorods de ouro na membrana celular usando microscopia de campo escuro de nanopartícula única

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Usando Microfluidos e Microscopia de Fluorescência para Estudar a Dinâmica de Montagem de Filamentos e Pacotes de Actin Único

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Visualizando a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbula in vitro por microscopia de fluorescência interna total (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...