Name: simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy
Uploaded: 2022-02-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом NIH (No 1DP2GM126894-01), а также средствами Pew Charitable Trusts и Smith Family Foundation для R.S. Авторы благодарят доктора Шуо Цзяна за его вклад в разработку и оптимизацию протоколов.

1. Подготовьте реагенты
<ol><li>Подготовьте буферы и реагенты, как показано в таблице 1 и таблице 2. Во время эксперимента держите все растворы на льду, если не указано иное.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Решение</td>
			<td colsp...

<ol>
	<li>Subramanian, R., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+complexity:+insights+into+self-organized+assembly+of+microtubule-based+architectures.">Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures.</a> Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+determine+and+maintain+Drosophila+bristle+shape.">Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape.</a> Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).</li><li>Foe, V. E., von Dassow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+shape+the+myosin+activation+zone+during+cytokinetic+furrow+formation.">Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).</li><li>Pous, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specialization+of+stable+and+dynamic+microtubules+in+protein+traffic+in+WIF-B+cells.">Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells.</a> The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).</li><li>Uehara, R., Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+central+spindle+assembly+requires+de+novo+microtubule+generation+in+the+interchromosomal+region+during+anaphase.">Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+microtubule+plus-end+tracking+system+in+vitro.">Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro.</a> Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+pushing+and+braking+forces+generated+by+ensembles+of+Kinesin-5+crosslinking+two+microtubules.">Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules.</a> Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).</li><li>Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+single+microtubules+and+bundles+by+a+three-protein+module.">Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module.</a> Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).</li><li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTP+hydrolysis+in+microtubule+dynamics:+information+from+a+slowly+hydrolyzable+analogue,+GMPCPP.">Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).</li><li>Subramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+antiparallel+microtubule+crosslinking+by+PRC1,+a+conserved+nonmotor+microtubule+binding+protein.">Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein.</a> Cell. 142 (3), 433-443 (2010).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Wijeratne, S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+of+antiparallel+microtubule+bundles+regulates+relative+sliding+and+stalling+by+PRC1+and+Kif4A.">Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A.</a> eLife. 7, 32595 (2018).</li><li>Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+geometrical+features+of+microtubules+as+regulators+of+microtubule+organization.">Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization.</a> eLife. 10, 63880 (2021).</li><li>Freal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-driven+assembly+of+the+axon+initial+segment.">Feedback-driven assembly of the axon initial segment.</a> Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).</li><li>Ledbetter, M., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;microtubule&amp;#34;+in+plant+cell+fine+structure.">A &amp;#34;microtubule&amp;#34; in plant cell fine structure.</a> The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).</li><li>Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+reveals+distinct+protofilament-scale+structural+dynamics+in+depolymerizing+microtubule+arrays.">Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).</li></ol>

Описанный здесь эксперимент значительно расширяет сферу применения и сложность обычных анализов восстановления микротрубочек, которые традиционно выполняются на одиночных микротрубочках или на одном типе массива. Текущий анализ обеспечивает метод одновременной количественной оце...

Микротрубочки представляют собой биополимеры, которые образуют структурные каркасы, необходимые для нескольких клеточных процессов, начиная от внутриклеточного транспорта и позиционирования органелл до деления и удлинения клеток. Для выполнения этих разнообразных функций отдельные микротрубочки организованы в массивы размером с микрон, такие как митотические веретена, цилиарные аксонемы, пучки нейронов, межфазные массивы и растительные корковые массивы. Вездесущим архитектурным мотивом, найденным в этих структурах, является пучок микротрубочек, сшитых по их длине1. Интригующей особенностью нескольких структур на основе микротрубочек является сосуществование пучковых микротрубочек и несшитых одиночных микротрубочек в непосредственной пространственной близости. Эти субпопуляции микротрубочек могут демонстрировать резко отличающуюся динамику полимеризации друг от друга, как это необходимо для их правильного функционирования2,3,4,5. Например, внутри митотического шпинделя стабильные сшитые пучки и динамические одиночные микротрубочки присутствуют в микронной области в центре ячейки6. Таким образом, изучение того, как определяются динамические свойства сосуществующих популяций микротрубочек, имеет решающее значение для понимания сборки и функции структур на основе микротрубочек.
Микротрубочки представляют собой динамические полимеры, которые циклически переключаются между фазами полимеризации и деполимеризации, переключаясь между двумя фазами в событиях, известных как катастрофа и спасение7. Динамика клеточных микротрубочек регулируется мириадами микротрубочек,ассоциированных белков (MAP), которые модулируют скорость полимеризации и деполимеризации микротрубочек и частоты катастроф и спасательных событий. Исследовать активность MAP на пространственно проксимальных массивах в клетках сложно из-за ограничений пространственного разрешения в световой микроскопии, особенно в областях с высокой плотностью микротрубочек. Более того, наличие нескольких MAP в одной и той же клеточной области затрудняет интерпретацию клеточных биологических исследований. Анализы восстановления in vitro, выполняемые в сочетании с микроскопией полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF), обходят проблемы изучения механизмов, с помощью которых конкретные подмножества MAP регулируют динамику проксимальных клеточных микротрубочек. Здесь исследуется динамика собранных in vitro микротрубочек в присутствии одного или нескольких рекомбинантных MAP в контролируемых условиях8,9,10. Однако обычные анализы восстановления обычно выполняются на одиночных микротрубочках или на одном типе массива, что исключает визуализацию сосуществующих популяций.
Здесь мы представляем анализы восстановления in vitro , которые позволяют одновременно визуализировать две популяции микротрубочек в одних и тех же условиях решения11. Описан способ одновременного просмотра коллективной активности нескольких MAP на одиночных микротрубочках и на пучках микротрубочек, сшитых митотическим веретенно-ассоциированным белком PRC1. Белок PRC1 преимущественно связывается при перекрытии между антипараллельными микротрубочками, сшивая их9. Вкратце, этот протокол состоит из следующих этапов: (i) подготовка исходных растворов и реагентов, (ii) очистка и обработка поверхности покровных пластин, используемых для создания камеры визуализации для микроскопических экспериментов, (iii) подготовка стабильных «семян» микротрубочек, из которых полимеризация инициируется в ходе эксперимента, (iv) спецификация настроек микроскопа TIRF для визуализации динамики микротрубочек, (v) иммобилизация семян микротрубочек и генерация сшитых пучков микротрубочек в камере визуализации и (vi) визуализация динамики микротрубочек в камере визуализации с помощью микроскопии TIRF при добавлении растворимого тубулина, MAP и нуклеотидов. Эти анализы позволяют качественно оценить и количественно изучить локализацию MAP и их влияние на динамику двух популяций микротрубочек. Кроме того, они облегчают оценку синергетического воздействия нескольких MAP на эти популяции микротрубочек в широком диапазоне экспериментальных условий.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >238813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18x18 mm #1.5 coverslips&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24x60 mm #1.5 coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >405/488/560/647 nm Laser Quad Band&#160;</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>TRF89901-NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7699-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avidin, NeutrAvidin&#174; Biotin-binding Protein (Molecular Probes&#174;)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Delicate Task Wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET610/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200-proof)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GMPCPP</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>NU-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hellmanex III detergent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion oil, Type A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>77010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kappa-casein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lanolin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microfuge 16 Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90&#176; Ground Edges, WHITE Frosted</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380-50W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000&#160;</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#NH2-PEG-VA-5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optima&#8482; Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraffin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5377-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petrolatum, White</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plasma Cleaner, 115V</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2520-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#8482; Pierce&#8482; Bond-Breaker&#8482; TCEP Solution, Neutral pH; 500mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>PI-77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apochromat TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.1 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>362224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.2 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL620M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTABOND&#174; Reagent, Tissue Section Adhesion</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>SP-1800-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VWR&#174; Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97025-630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy

Микротрубочки представляют собой полимеры гетеродимеров αβ-тубулина, которые организуются в различные структуры в клетках. Архитектуры и сети на основе микротрубочек часто содержат подмножества массивов микротрубочек, которые различаются по своим динамическим свойствам. Например, в делящихся клетках стабильные пучки сшитых микротрубочек сосуществуют в непосредственной близости от динамических несшитых микротрубочек. Исследования восстановления in vitro на основе TIRF-микроскопии позволяют одновременно визуализировать динамику этих различных массивов микротрубочек. В этом анализе камера визуализации собирается с поверхностно-иммобилизованными микротрубочками, которые либо присутствуют в виде одиночных нитей, либо организованы в сшитые пучки. Введение тубулина, нуклеотидов и белковых регуляторов позволяет непосредственно визуализировать ассоциированные белки и динамические свойства одиночных и сшитых микротрубочек. Кроме того, изменения, которые происходят, когда динамические одиночные микротрубочки организуются в пучки, могут отслеживаться в режиме реального времени. Описанный здесь способ позволяет проводить систематическую оценку активности и локализации отдельных белков, а также синергетических эффектов белковых регуляторов на два разных подмножества микротрубочек в идентичных экспериментальных условиях, тем самым обеспечивая механистические идеи, недоступные другим методам.

Эксперимент, описанный выше, проводили с использованием 647 нм флуорофор-меченых биотинилированных микротрубочек, 560 нм флуорофор-меченых небиотинилированных микротрубочек и 560 нм флуорофор-меченой растворимой тубулиновой смеси. Микротрубочки были сшиты сшиваемым белком PRC1 (меченым GFP...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Здесь представлен анализ восстановления in vitro на основе микроскопии TIRF для одновременной количественной оценки и сравнения динамики двух популяций микротрубочек. Описан способ одновременного просмотра коллективной активности нескольких микротрубочек-ассоциированных белков на сшитых пучках микротрубочек и одиночных микротрубочек.

Одновременная визуализация динамики сшитых и одиночных микротрубочек in vitro методом TIRF-микроскопии

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Клеточные массивы микротрубочек содержат субпопуляции микротрубочек с различными динамическими свойствами, необходимыми для функционирования. В этом протоколе рассматривается вопрос о том, как коллективная деятельность регуляторов наделяет проксимальные субпопуляции микротрубочек различными свойствами. Этот анализ реституции снизу вверх позволяет нам одновременно визуализировать организацию и динамику проксимальных популяций микротрубочек, таких как одиночные микротрубочки и пучки, и расшифровать механизмы, лежащие в основе их самоорганизации.Многокомпонентное восстановление требует оптимизации экспериментальных параметров, таких как pH, ионная сила и концентрация белка при сохранении активности каждого из них. Систематический анализ отдельных компонентов перед многобелковыми анализами чрезвычайно полезен. Для начала пипетка смеси из 4,5 микролитров BRB ADDTT в одном микролитре раствора микротрубочки на предметное стекло микроскопа.Накройте крышкой размером 18 на 18 миллиметров и запечатайте края либо прозрачным лаком для ногтей, либо герметиком VALAP. Поместите цель TIRF под крышкой. Визуализируйте вновь полимеризованные микротрубочки на длине волны, соответствующей флуоресцентно меченому тубулину в яркой смеси, чтобы определить, какое разбавление микротрубочек использовать в предстоящих экспериментах.Определить интенсивность лазера для эксперимента эмпирически таким образом, чтобы все флуоресцентные белки освещались, но не подвергались значительному фотоотбеливанию в течение времени эксперимента. Установите температуру микроскопа на 28 градусов Цельсия для просмотра динамических микротрубочек. Используйте бумагу для линз для очистки объектива 100X с 70% этанолом.Используйте наилучшую комбинацию фильтрующих кубов и эмиссионных фильтров в зависимости от флуоресцентных каналов, которые будут визуализированы. Настройте последовательность изображений. Для эксперимента с 647-нанометровыми флуорофорами, мечеными биотинилированными микротрубочками, 560-нанометровыми флуорофорами, мечеными небиотинилированными микротрубочками в растворимом тубулине, и интересующим белком, меченым GFP, изображайте 488-нанометровые, 560-нанометровые и 647 нанометровые каналы каждые 10 секунд в течение 20 минут.Чтобы захватить эталонное изображение пучков до добавления растворимого тубулина и белка, связанного с микротрубочками, создали последовательность с одним изображением каждый в каналах длиной волны 560 нанометров и 647 нанометров. Проверьте положение лазерного луча на потолке над микроскопом и внесите изменения в луч с помощью программного обеспечения. Убедитесь, что лазерный осветитель выровнен.Перед визуализацией добавьте каплю погружного масла микроскопа к объективу. Приготовьте растворимую тубулиновую смесь, держа ее на льду, и раскрутите смесь. Чтобы обездвижить микротрубочки через связь биотин-нейтравидин-биотин, сначала протоите примерно в 7,5 микролитрах раствора НейтрАвидина до тех пор, пока камера не будет заполнена и инкубируется в течение пяти минут.Мойте 10 микролитрами МБ холода. Протойте в 7,5 микролитрах блокирующего белка KC и инкубируйте в течение двух минут. Промыть 10 микролитрами МБ тепла, чтобы подготовить камеру к введению микротрубочек.Разбавьте запас биотинилированных микротрубочек в BRB ADDTT и добавьте один микролитр этого разведения к девяти микролитрам МБ теплого. Перетейте смесь в камеру и инкубируйте в течение 10 минут. Смойте неиммобилизованные микротрубочки с 10 микролитрами МБ тепла.Влить в камеру 7,5 микролитров теплого KC и инкубировать в течение двух минут. Во время инкубации готовят два наномолярных раствора сшивки или белка PRC1 в KC и раскручивают раствор вниз. Пропустите 10 микролитров этого раствора в камеру визуализации и инкубируйте в течение пяти минут.Для изготовления пучков влейте в камеру 10 микролитров небиотинилированных микротрубочек и инкубируйте в течение 10 минут. Дважды промыть камеру 10 микролитрами МБ тепла. В течение 10-минутного инкубационного времени подготовьте 10 микролитров пробирной смеси, содержащей интересующие белки, растворимый тубулин, нуклеотиды, поглотители кислорода и антиоксиданты, и раскрутите ее вниз.Держите смесь на льду. Загрузите подготовленную камеру визуализации, приклеенную к держателю слайда на объективе 100X TIRF. Используйте 560-нанометровый и 647-нанометровый каналы, чтобы найти поле зрения, содержащее оптимальное количество и плотность одиночных микротрубочек и пучков.После определения поля зрения сделайте эталонное изображение. Осторожно течь в пробирную смесь, не нарушая камеру визуализации. Запечатайте открытые концы камеры герметиком VALAP.Понаблюдайте за микротрубочками и начните последовательность визуализации. После иммобилизации семян микротрубочек и генерации пучков были получены флуоресцентные изображения. Одиночные микротрубочки были идентифицированы флуоресцентным сигналом в 647-нанометровом канале, тогда как микротрубочки были идентифицированы как предварительно сформированные пучки, когда они отображали флуоресцентные сигналы в обоих каналах.Изучена динамика одиночных микротрубочек и сшитых пучков PRC1 в присутствии белков KIF4A и CLASP1, что показало, что одиночные микротрубочки удлиняются в ходе анализа, тогда как рост сшитых микротрубочек застопорился. Будьте осторожны, чтобы держать полимеризованные микротрубочки при комнатной температуре или выше. Держите растворимый тубулин на льду и защищайте камеру визуализации и флуоресцентно меченые микротрубочки и белки от света.Эти анализы дали механистическое представление о том, как белковый модуль, обнаруженный в митотическом веретене, может дифференциально регулировать динамику двух различных популяций микротрубочек, которые сосуществуют в веретене.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Проверка структуры и динамики нуклеосом с помощью атомно-силовой микроскопии изображений

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Изображение внеклеточных пузырьков с помощью атомной микроскопии силы

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Визуализация поверхности T-клеточного рецептора динамики четыре-Dimensionally использование решетки светлист микроскопии

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Производство динамовских и кинезинских моторных ансамблей на наноструктурах ДНК оригами для наблюдения за одной молекулой

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Визуализация диффузной динамики золотых нанородов на клеточной мембране с помощью одной наночастицы Darkfield Microscopy

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Одноклеточный анализ транскрипционно активных аллелей одной молекулой FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Одновременное интерференционное отражение и флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения для визуализации динамических микротрубочек и связанных с ними белков

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Использование микрофлюидики и флуоресцентной микроскопии для изучения динамики сборки одноактиновых нитей и пучков

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Визуализация динамики связи актина и микротрубочек in vitro с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...