Name: simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy
Uploaded: 2022-02-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por una subvención de los NIH (no. 1DP2GM126894-01), y por fondos de Pew Charitable Trusts y Smith Family Foundation a R.S. Los autores agradecen al Dr. Shuo Jiang por su contribución al desarrollo y optimización de los protocolos.

1. Preparar reactivos
<ol><li>Prepare tampones y reactivos como se describe en la Tabla 1 y la Tabla 2. Durante el experimento, mantenga todas las soluciones en hielo, a menos que se indique lo contrario.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solución</td>
			<td colspan="2">Componentes</td>
			<td>Duración de almacenamiento recomendada</t...

<ol>
	<li>Subramanian, R., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+complexity:+insights+into+self-organized+assembly+of+microtubule-based+architectures.">Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures.</a> Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+determine+and+maintain+Drosophila+bristle+shape.">Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape.</a> Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).</li><li>Foe, V. E., von Dassow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+shape+the+myosin+activation+zone+during+cytokinetic+furrow+formation.">Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).</li><li>Pous, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specialization+of+stable+and+dynamic+microtubules+in+protein+traffic+in+WIF-B+cells.">Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells.</a> The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).</li><li>Uehara, R., Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+central+spindle+assembly+requires+de+novo+microtubule+generation+in+the+interchromosomal+region+during+anaphase.">Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+microtubule+plus-end+tracking+system+in+vitro.">Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro.</a> Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+pushing+and+braking+forces+generated+by+ensembles+of+Kinesin-5+crosslinking+two+microtubules.">Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules.</a> Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).</li><li>Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+single+microtubules+and+bundles+by+a+three-protein+module.">Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module.</a> Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).</li><li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTP+hydrolysis+in+microtubule+dynamics:+information+from+a+slowly+hydrolyzable+analogue,+GMPCPP.">Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).</li><li>Subramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+antiparallel+microtubule+crosslinking+by+PRC1,+a+conserved+nonmotor+microtubule+binding+protein.">Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein.</a> Cell. 142 (3), 433-443 (2010).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Wijeratne, S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+of+antiparallel+microtubule+bundles+regulates+relative+sliding+and+stalling+by+PRC1+and+Kif4A.">Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A.</a> eLife. 7, 32595 (2018).</li><li>Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+geometrical+features+of+microtubules+as+regulators+of+microtubule+organization.">Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization.</a> eLife. 10, 63880 (2021).</li><li>Freal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-driven+assembly+of+the+axon+initial+segment.">Feedback-driven assembly of the axon initial segment.</a> Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).</li><li>Ledbetter, M., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;microtubule&amp;#34;+in+plant+cell+fine+structure.">A &amp;#34;microtubule&amp;#34; in plant cell fine structure.</a> The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).</li><li>Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+reveals+distinct+protofilament-scale+structural+dynamics+in+depolymerizing+microtubule+arrays.">Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).</li></ol>

El experimento descrito aquí amplía significativamente el alcance y la complejidad de los ensayos convencionales de reconstitución de microtúbulos, que tradicionalmente se realizan en microtúbulos individuales o en un tipo de matriz. El ensayo actual proporciona un método para cuantificar y comparar simultáneamente la actividad reguladora de MAP en dos poblaciones, a saber, microtúbulos individuales y haces reticulados. Además, este ensayo permite el examen de dos tipos de haces: los que están preformados a par...

Los microtúbulos son biopolímeros que forman andamios estructurales esenciales para múltiples procesos celulares, que van desde el transporte intracelular y el posicionamiento de orgánulos hasta la división celular y el alargamiento. Para ejecutar estas diversas funciones, los microtúbulos individuales se organizan en matrices del tamaño de micras, como husos mitóticos, axonemas ciliares, haces neuronales, matrices interfase y matrices corticales de plantas. Un motivo arquitectónico omnipresente que se encuentra en estas estructuras es un haz de microtúbulos reticulados a lo largo de sus longitudes1. Una característica intrigante de varias estructuras basadas en microtúbulos es la coexistencia de microtúbulos agrupados y microtúbulos individuales no reticulados en estrecha proximidad espacial. Estas subpoblaciones de microtúbulos pueden mostrar una dinámica de polimerización marcadamente diferente entre sí, según sea necesario para su correcto funcionamiento2,3,4,5. Por ejemplo, dentro del huso mitótico, haces reticulados estables y microtúbulos individuales dinámicos están presentes dentro de una región a escala de micras en el centro celular6. Estudiar cómo se especifican las propiedades dinámicas de las poblaciones coexistentes de microtúbulos es, por lo tanto, fundamental para comprender el ensamblaje y la función de las estructuras basadas en microtúbulos.
Los microtúbulos son polímeros dinámicos que circulan entre las fases de polimerización y despolimerización, cambiando entre las dos fases en eventos conocidos como catástrofe y rescate7. La dinámica de los microtúbulos celulares está regulada por una miríada de proteínas asociadas a microtúbulos (MAP) que modulan las tasas de polimerización y despolimerización de microtúbulos y las frecuencias de catástrofes y eventos de rescate. Es difícil investigar la actividad de los MAP en matrices espacialmente proximales en células, debido a las limitaciones de la resolución espacial en microscopía de luz, especialmente en regiones de alta densidad de microtúbulos. Además, la presencia de múltiples MAP en la misma región celular dificulta las interpretaciones de los estudios biológicos celulares. Los ensayos de reconstitución in vitro, realizados junto con la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), evitan los desafíos de examinar los mecanismos por los cuales subconjuntos específicos de MAP regulan la dinámica de las matrices de microtúbulos celulares proximales. Aquí, la dinámica de los microtúbulos ensamblados in vitro se examina en presencia de uno o más MAP recombinantes en condiciones controladas8,9,10. Sin embargo, los ensayos de reconstitución convencionales se realizan típicamente en microtúbulos individuales o en un tipo de matriz, lo que impide la visualización de poblaciones coexistentes.
Aquí, presentamos ensayos de reconstitución in vitro que permiten la visualización simultánea de dos poblaciones de microtúbulos en las mismas condiciones de solución11. Describimos un método para ver simultáneamente la actividad colectiva de múltiples MAP en microtúbulos individuales y en haces de microtúbulos reticulados por la proteína PRC1 asociada al huso mitótico. La proteína PRC1 se une preferentemente a la superposición entre microtúbulos antiparalelos, reticulándolos9. Brevemente, este protocolo consta de los siguientes pasos: (i) preparación de soluciones madre y reactivos, (ii) limpieza y tratamiento superficial de los cubrebocas utilizados para crear la cámara de imágenes para experimentos de microscopía, (iii) preparación de "semillas" de microtúbulos estables a partir de las cuales se inicia la polimerización durante el experimento, (iv) especificación de los ajustes del microscopio TIRF para visualizar la dinámica de los microtúbulos, (v) inmovilización de semillas de microtúbulos y generación de haces de microtúbulos reticulados en la cámara de imágenes, y (vi) visualización de la dinámica de microtúbulos en la cámara de imágenes a través de microscopía TIRF, tras la adición de tubulina soluble, MAP y nucleótidos. Estos ensayos permiten la evaluación cualitativa y el examen cuantitativo de la localización de MAP y su efecto en la dinámica de dos poblaciones de microtúbulos. Además, facilitan la evaluación de los efectos sinérgicos de múltiples MAP en estas poblaciones de microtúbulos, a través de una amplia gama de condiciones experimentales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >238813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18x18 mm #1.5 coverslips&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24x60 mm #1.5 coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >405/488/560/647 nm Laser Quad Band&#160;</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>TRF89901-NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7699-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avidin, NeutrAvidin&#174; Biotin-binding Protein (Molecular Probes&#174;)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Delicate Task Wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET610/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200-proof)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GMPCPP</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>NU-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hellmanex III detergent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion oil, Type A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>77010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kappa-casein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lanolin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microfuge 16 Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90&#176; Ground Edges, WHITE Frosted</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380-50W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000&#160;</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#NH2-PEG-VA-5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optima&#8482; Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraffin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5377-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petrolatum, White</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plasma Cleaner, 115V</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2520-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#8482; Pierce&#8482; Bond-Breaker&#8482; TCEP Solution, Neutral pH; 500mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>PI-77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apochromat TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.1 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>362224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.2 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL620M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTABOND&#174; Reagent, Tissue Section Adhesion</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>SP-1800-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VWR&#174; Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97025-630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy

Los microtúbulos son polímeros de heterodímeros de αβ-tubulina que se organizan en estructuras distintas en las células. Las arquitecturas y redes basadas en microtúbulos a menudo contienen subconjuntos de matrices de microtúbulos que difieren en sus propiedades dinámicas. Por ejemplo, en las células en división, los haces estables de microtúbulos reticulados coexisten muy cerca de los microtúbulos dinámicos no reticulados. Los estudios de reconstitución in vitro basados en microscopía TIRF permiten la visualización simultánea de la dinámica de estas diferentes matrices de microtúbulos. En este ensayo, se ensambla una cámara de imágenes con microtúbulos inmovilizados en la superficie, que están presentes como filamentos individuales u organizados en haces reticulados. La introducción de tubulina, nucleótidos y reguladores de proteínas permite la visualización directa de proteínas asociadas y de las propiedades dinámicas de microtúbulos simples y reticulados. Además, los cambios que ocurren a medida que los microtúbulos individuales dinámicos se organizan en haces se pueden monitorear en tiempo real. El método descrito aquí permite una evaluación sistemática de la actividad y localización de proteínas individuales, así como los efectos sinérgicos de los reguladores de proteínas en dos subconjuntos de microtúbulos diferentes en condiciones experimentales idénticas, proporcionando así información mecanicista que es inaccesible por otros métodos.

El experimento descrito anteriormente se realizó utilizando microtúbulos biotinilados marcados con fluoróforos de 647 nm, microtúbulos no biotinilados marcados con fluoróforos de 560 nm y mezcla de tubulina soluble marcada con fluoróforos de 560 nm. Los microtúbulos fueron reticulados por la proteína reticulante PRC1 (marcada con GFP). Después de generar haces inmovilizados en la superficie y microtúbulos individuales (paso 5.11), la cámara de imágenes se montó en un objetivo de aceite TIRF 100X 1.49 NA y se...

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Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Aquí, se presenta un ensayo de reconstitución in vitro basado en microscopía TIRF para cuantificar y comparar simultáneamente la dinámica de dos poblaciones de microtúbulos. Se describe un método para ver simultáneamente la actividad colectiva de múltiples proteínas asociadas a microtúbulos en haces de microtúbulos reticulados y microtúbulos individuales.

Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Las matrices de microtúbulos celulares contienen subpoblaciones de microtúbulos con propiedades dinámicas distintas según sea necesario para la función. Este protocolo aborda cómo la actividad colectiva de los reguladores otorga a las subpoblaciones de microtúbulos proximales propiedades distintas. Este ensayo de restitución de abajo hacia arriba nos permite visualizar simultáneamente la organización y la dinámica de las poblaciones de microtúbulos proximales, como los microtúbulos y los haces individuales, y descifrar los mecanismos subyacentes a su autoorganización.La reconstitución de múltiples componentes requiere optimizar parámetros experimentales como el pH, la fuerza iónica y la concentración de proteínas, preservando al mismo tiempo la actividad de cada uno. El análisis sistemático de componentes individuales antes de los ensayos de múltiples proteínas es extremadamente útil. Para comenzar, pipetee una mezcla de 4,5 microlitros de BRB ADDTT en un microlitro de solución de microtúbulos en un portaobjetos de microscopio.Cubra con una cubierta de 18 por 18 milímetros y selle los bordes con esmalte de uñas transparente o sellador VALAP. Coloque el objetivo TIRF debajo del cobertor. Visualice los microtúbulos recién polimerizados a una longitud de onda apropiada para la tubulina marcada fluorescentemente en la mezcla brillante para determinar qué dilución de microtúbulos usar en los próximos experimentos.Determine empíricamente la intensidad del láser para el experimento de modo que todas las proteínas fluorescentes estén iluminadas, pero no se sometan a un fotoblanqueo significativo en el transcurso del experimento. Ajuste la temperatura del microscopio a 28 grados Celsius para ver microtúbulos dinámicos. Use papel de lente para limpiar un objetivo 100X con 70% de etanol.Utilice la mejor combinación de cubos de filtro y filtros de emisión dependiendo de los canales fluorescentes a fotografiar. Configure la secuencia de imágenes. Para un experimento con microtúbulos biotinilados marcados con fluoróforos de 647 nanómetros, microtúbulos no biotinilados marcados con fluoróforos de 560 nanómetros en tubulina soluble y proteína de interés marcada con GFP, obtenga imágenes de los canales de 488 nanómetros, 560 nanómetros y 647 nanómetros cada 10 segundos durante 20 minutos.Para capturar una imagen de referencia de haces antes de la adición de tubulina soluble y proteína asociada a microtúbulos, configure una secuencia con una imagen cada uno en canales de longitud de onda de 560 nanómetros y 647 nanómetros. Verifique la posición del rayo láser en el techo sobre el microscopio y realice cambios en el haz utilizando un software. Asegúrese de que el iluminador láser esté alineado.Antes de tomar imágenes, agregue una gota de aceite de inmersión de microscopio al objetivo. Prepare la mezcla de tubulina soluble mientras la mantiene en hielo y haga girar la mezcla. Para inmovilizar microtúbulos a través del enlace biotina-NeutrAvidin-biotina, primero fluya en aproximadamente 7,5 microlitros de solución de NeutrAvidin hasta que la cámara se llene e incube durante cinco minutos.Lavar con 10 microlitros de MB de frío. Fluye en 7,5 microlitros de la proteína bloqueadora KC e incuba durante dos minutos. Lavar con 10 microlitros de MB calientes para preparar la cámara para la introducción de microtúbulos.Diluya el stock de microtúbulos biotinilados en BRB ADDTT y agregue un microlitro de esta dilución a nueve microlitros de MB calientes. Vierta la mezcla en la cámara e incube durante 10 minutos. Lave los microtúbulos no inmovilizados con 10 microlitros de MB calientes.Fluya 7.5 microlitros de KC caliente en la cámara e incube durante dos minutos. Durante la incubación, prepare una solución de dos nanomolares del reticulado o proteína PRC1 en KC y haga girar la solución. Fluya 10 microlitros de esta solución en la cámara de imágenes e incube durante cinco minutos.Para hacer haces, fluya 10 microlitros de microtúbulos no biotinilados en la cámara e incube durante 10 minutos. Lavar la cámara dos veces con 10 microlitros de MB calientes. Durante el tiempo de incubación de 10 minutos, prepare 10 microlitros de mezcla de ensayo que contenga proteínas de interés, tubulina soluble, nucleótidos, eliminadores de oxígeno y antioxidantes y hágalo girar.Mantenga la mezcla en hielo. Cargue la cámara de imagen preparada pegada al soporte deslizante en el objetivo 100X TIRF. Utilice los canales de 560 nanómetros y 647 nanómetros para encontrar un campo de visión que contenga un número y una densidad óptimos de microtúbulos y haces individuales.Una vez que se identifica un campo de visión, tome una imagen de referencia. Fluya cuidadosamente en la mezcla de ensayo sin perturbar la cámara de imágenes. Selle los extremos abiertos de la cámara con sellador VALAP.Observe los microtúbulos e inicie la secuencia de imágenes. Después de inmovilizar las semillas de microtúbulos y generar haces, se obtuvieron imágenes de fluorescencia. Los microtúbulos individuales se identificaron por señal fluorescente en el canal de 647 nanómetros, mientras que los microtúbulos se identificaron como haces preformados cuando mostraban señales fluorescentes en ambos canales.La dinámica de los microtúbulos individuales y los haces reticulados PRC1 se estudiaron en presencia de las proteínas KIF4A y CLASP1, lo que reveló que los microtúbulos individuales se alargan en el transcurso del ensayo, mientras que el crecimiento de los microtúbulos reticulados está estancado. Tenga cuidado de mantener los microtúbulos polimerizados a temperatura ambiente o por encima de ella. Mantenga la tubulina soluble en hielo y proteja la cámara de imágenes y los microtúbulos y proteínas marcados fluorescentemente de la luz.Estos ensayos proporcionaron una visión mecanicista de cómo un módulo de proteínas que se encuentra en el huso mitótico podría regular diferencialmente la dinámica de dos poblaciones diferentes de microtúbulos que coexisten en el huso.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondear la estructura y dinámica de nucleosomas utilizando imágenes de microscopía de fuerza atómica

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Investigación

Bioquímica

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imagen de vesículas extracelulares mediante microscopía de fuerza atómica

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualización de la dinámica del receptor de células T de superficie de cuatro dimensiones mediante la microscopía de hoja de luz de celosía

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Producción de Conjuntos de Motores de Dynein y Kinesin en Nanoestructuras de Origami de ADN para Observación de MoléculaS Simples

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualización de dinámicas diffusionales de nanorods de oro en la membrana celular mediante microscopía de campo oscuro de nanopartícula única

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Análisis unicelular de alelos transcripcionalmente activos por FISH de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Reflexión de interferencia simultánea y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Uso de microfluídica y microscopía de fluorescencia para estudiar la dinámica de ensamblaje de filamentos y haces de actina única

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Visualización de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos in vitro mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...