Name: simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy
Uploaded: 2022-02-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH (nr 1DP2GM126894-01) och av medel från Pew Charitable Trusts och Smith Family Foundation till R.S. Författarna tackar Dr. Shuo Jiang för hans bidrag till utveckling och optimering av protokollen.

1. Förbered reagenser
<ol><li>Förbereda buffertar och reagenser enligt tabell 1 och tabell 2. Under experimentet, håll alla lösningar på is, om inte annat anges.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Lösning</td>
			<td colspan="2">Komponenter</td>
			<td>Rekommenderad lagringstid</td>
			<td colspan="2">Anteckningar</...

<ol>
	<li>Subramanian, R., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+complexity:+insights+into+self-organized+assembly+of+microtubule-based+architectures.">Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures.</a> Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+determine+and+maintain+Drosophila+bristle+shape.">Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape.</a> Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).</li><li>Foe, V. E., von Dassow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+shape+the+myosin+activation+zone+during+cytokinetic+furrow+formation.">Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).</li><li>Pous, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specialization+of+stable+and+dynamic+microtubules+in+protein+traffic+in+WIF-B+cells.">Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells.</a> The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).</li><li>Uehara, R., Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+central+spindle+assembly+requires+de+novo+microtubule+generation+in+the+interchromosomal+region+during+anaphase.">Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+microtubule+plus-end+tracking+system+in+vitro.">Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro.</a> Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+pushing+and+braking+forces+generated+by+ensembles+of+Kinesin-5+crosslinking+two+microtubules.">Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules.</a> Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).</li><li>Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+single+microtubules+and+bundles+by+a+three-protein+module.">Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module.</a> Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).</li><li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTP+hydrolysis+in+microtubule+dynamics:+information+from+a+slowly+hydrolyzable+analogue,+GMPCPP.">Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).</li><li>Subramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+antiparallel+microtubule+crosslinking+by+PRC1,+a+conserved+nonmotor+microtubule+binding+protein.">Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein.</a> Cell. 142 (3), 433-443 (2010).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Wijeratne, S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+of+antiparallel+microtubule+bundles+regulates+relative+sliding+and+stalling+by+PRC1+and+Kif4A.">Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A.</a> eLife. 7, 32595 (2018).</li><li>Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+geometrical+features+of+microtubules+as+regulators+of+microtubule+organization.">Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization.</a> eLife. 10, 63880 (2021).</li><li>Freal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-driven+assembly+of+the+axon+initial+segment.">Feedback-driven assembly of the axon initial segment.</a> Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).</li><li>Ledbetter, M., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;microtubule&amp;#34;+in+plant+cell+fine+structure.">A &amp;#34;microtubule&amp;#34; in plant cell fine structure.</a> The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).</li><li>Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+reveals+distinct+protofilament-scale+structural+dynamics+in+depolymerizing+microtubule+arrays.">Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).</li></ol>

Experimentet som beskrivs här utökar avsevärt omfattningen och komplexiteten hos konventionella mikrotubuli rekonstitutionsanalyser, som traditionellt utförs på enskilda mikrotubuli eller på en typ av matris. Den nuvarande analysen ger en metod för att samtidigt kvantifiera och jämföra den regulatoriska MAP-aktiviteten på två populationer, nämligen enstaka mikrotubuli och tvärbundna buntar. Vidare möjliggör denna analys undersökning av två typer av buntar: de som är förformade av stabila frön före in...

Mikrotubuli är biopolymerer som bildar strukturella byggnadsställningar som är väsentliga för flera cellulära processer, allt från intracellulär transport och organellpositionering till celldelning och förlängning. För att utföra dessa olika funktioner organiseras enskilda mikrotubuli i mikronstora arrays, såsom mitotiska spindlar, ciliary axonemes, neuronala buntar, interfasmatriser och växtkortikala arrays. Ett allestädes närvarande arkitektoniskt motiv som finns i dessa strukturer är en bunt mikrotubuli tvärbundna längs deras längder1. En spännande egenskap hos flera mikrotubulibaserade strukturer är samexistensen av buntade mikrotubuli och icke-tvärbundna enskilda mikrotubuli i närheten av rumslig närhet. Dessa mikrotubuli delpopulationer kan uppvisa starkt olika polymerisationsdynamik från varandra, efter behov för deras korrekta funktion2,3,4,5. Till exempel, inom den mitotiska spindeln, finns stabila tvärbundna buntar och dynamiska enskilda mikrotubuli närvarande inom en mikronskala region vid cellcentret6. Att studera hur de dynamiska egenskaperna hos samexisterande mikrotubulipopulationer specificeras är därför centralt för att förstå sammansättningen och funktionen hos mikrotubulibaserade strukturer.
Mikrotubuli är dynamiska polymerer som cyklar mellan faser av polymerisation och depolymerisation och växlar mellan de två faserna i händelser som kallas katastrof och räddning7. Dynamiken hos cellulära mikrotubuli regleras av myriad microtubule associated proteins (MAPs) som modulerar hastigheterna för mikrotubulär polymerisation och depolymerisation och frekvenserna av katastrof- och räddningshändelser. Det är utmanande att undersöka MAPs aktivitet på rumsligt proximala arrays i celler, på grund av begränsningarna av rumslig upplösning i ljusmikroskopi, särskilt i regioner med hög mikrotubulär densitet. Dessutom hindrar närvaron av flera MAPs i samma cellulära region tolkningar av cellbiologiska studier. In vitro-rekonstitutionsanalyser, utförda i samband med TIRF-mikroskopi (Total Internal Reflection Fluorescence), kringgår utmaningarna med att undersöka mekanismer genom vilka specifika delmängder av MAPs reglerar dynamiken hos proximala cellulära mikrotubuli arrays. Här undersöks dynamiken hos mikrotubuli monterade in vitro i närvaro av en eller flera rekombinanta MAPs under kontrollerade förhållanden8,9,10. Konventionella rekonstitutionsanalyser utförs emellertid vanligtvis på enskilda mikrotubuli eller på en typ av matris, vilket utesluter visualisering av samexisterande populationer.
Här presenterar vi in vitro-rekonstitutionsanalyser som möjliggör samtidig visualisering av två mikrotubulipopulationer under samma lösningsbetingelser11. Vi beskriver en metod för att samtidigt se den kollektiva aktiviteten hos flera MAPs på enstaka mikrotubuli och på mikrotubuli buntar tvärbundna av det mitotiska spindelassocierade proteinet PRC1. Proteinet PRC1 binder företrädesvis vid överlappningen mellan antiparallella mikrotubuli och tvärbinder dem9. Kortfattat består detta protokoll av följande steg: (i) beredning av stamlösningar och reagenser, (ii) rengöring och ytbehandling av täckglas som används för att skapa bildkammaren för mikroskopiexperiment, (iii) beredning av stabila mikrotubuli "frön" från vilka polymerisation initieras under experimentet, (iv) specifikation av TIRF-mikroskopinställningar för att visualisera mikrotubulidynamik, (v) immobilisering av mikrotubulifrön och generering av tvärbundna mikrotubulibuntar i bildkammaren och (vi) visualisering av mikrotubulidynamik i bildkammaren genom TIRF-mikroskopi, vid tillsats av lösligt tubulin, MAPs och nukleotider. Dessa analyser möjliggör kvalitativ utvärdering och kvantitativ undersökning av MAP-lokalisering och deras effekt på dynamiken hos två mikrotubulipopulationer. Dessutom underlättar de utvärderingen av synergistiska effekter av flera MAPs på dessa mikrotubuli populationer, över ett brett spektrum av experimentella förhållanden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >238813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18x18 mm #1.5 coverslips&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24x60 mm #1.5 coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >405/488/560/647 nm Laser Quad Band&#160;</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>TRF89901-NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7699-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avidin, NeutrAvidin&#174; Biotin-binding Protein (Molecular Probes&#174;)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Delicate Task Wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET610/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200-proof)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GMPCPP</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>NU-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hellmanex III detergent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion oil, Type A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>77010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kappa-casein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lanolin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microfuge 16 Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90&#176; Ground Edges, WHITE Frosted</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380-50W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000&#160;</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#NH2-PEG-VA-5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optima&#8482; Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraffin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5377-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petrolatum, White</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plasma Cleaner, 115V</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2520-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#8482; Pierce&#8482; Bond-Breaker&#8482; TCEP Solution, Neutral pH; 500mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>PI-77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apochromat TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.1 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>362224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.2 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL620M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTABOND&#174; Reagent, Tissue Section Adhesion</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>SP-1800-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VWR&#174; Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97025-630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy

Mikrotubuli är polymerer av αβ-tubulin heterodimerer som organiserar sig i distinkta strukturer i celler. Mikrotubulibaserade arkitekturer och nätverk innehåller ofta delmängder av mikrotubuli arrays som skiljer sig åt i deras dynamiska egenskaper. Till exempel, i delande celler, samexisterar stabila buntar av tvärbundna mikrotubuli i närheten av dynamiska icke-tvärbundna mikrotubuli. TIRF-mikroskopibaserade in vitro-rekonstitueringsstudier möjliggör samtidig visualisering av dynamiken i dessa olika mikrotubuli-arrayer. I denna analys monteras en bildkammare med ytimmobiliserade mikrotubuli, vilka antingen är närvarande som enskilda filament eller organiserade i tvärbundna buntar. Introduktion av tubulin, nukleotider och proteinregulatorer möjliggör direkt visualisering av associerade proteiner och av dynamiska egenskaper hos enskilda och tvärbundna mikrotubuli. Dessutom kan förändringar som uppstår när dynamiska enskilda mikrotubuli organiseras i buntar övervakas i realtid. Metoden som beskrivs här möjliggör en systematisk utvärdering av aktiviteten och lokaliseringen av enskilda proteiner, liksom synergistiska effekter av proteinregulatorer på två olika mikrotubuli delmängder under identiska experimentella förhållanden, vilket ger mekanistiska insikter som är otillgängliga med andra metoder.

Experimentet som beskrivs ovan utfördes med användning av 647 nm fluoroformärkta biotinylerade mikrotubuli, 560 nm fluoroformärkta icke-biotinylerade mikrotubuli och 560 nm fluoroformärkt löslig tubulinblandning. Mikrotubuli korslänkades av tvärbindningsproteinet PRC1 (GFP-märkt). Efter att ytimmobiliserade buntar och enstaka mikrotubuli genererats (steg 5.11) monterades bildkammaren på ett TIRF 100X 1.49 NA-oljemål och sågs i fluorescenskanalerna 560 nm och 647 nm. Enstaka mikrotubuli identifierades av deras...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Här presenteras en TIRF-mikroskopibaserad in vitro-rekonstitutionsanalys för att samtidigt kvantifiera och jämföra dynamiken hos två mikrotubulipopulationer. En metod beskrivs för att samtidigt se den kollektiva aktiviteten hos flera mikrotubuliassocierade proteiner på tvärbundna mikrotubulibuntar och enstaka mikrotubuli.

Samtidig visualisering av dynamiken i tvärbundna och enskilda mikrotubuli in vitro med TIRF-mikroskopi

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Cellulära mikrotubuli arrays innehåller delpopulationer av mikrotubuli med distinkta dynamiska egenskaper som krävs för funktion. Detta protokoll behandlar hur regulatorernas kollektiva aktivitet ger proximala mikrotubuli delpopulationer med distinkta egenskaper. Denna bottom-up-återbetalningsanalys gör det möjligt för oss att samtidigt visualisera organisationen och dynamiken hos proximala mikrotubulipopulationer som enskilda mikrotubuli och buntar och att dechiffrera mekanismerna bakom deras självorganisation.Multikomponentrekonstituering kräver optimering av experimentella parametrar som pH, jonstyrka och proteinkoncentration samtidigt som aktiviteten hos var och en bevaras. Systematisk analys av enskilda komponenter före multiproteinanalyser är till stor hjälp. Till att börja med pipettera en blandning av 4,5 mikroliter BRB ADDTT i en mikroliter mikrotubulilösning på en mikroskopbild.Täck med en 18 till 18 millimeter täckglas och försegla kanterna med antingen klart nagellack eller VALAP-tätningsmedel. Placera TIRF-målet under täckglaset. Visualisera de nyligen polymeriserade mikrotubuli vid en våglängd som är lämplig för det fluorescerande märkta tubulinet i den ljusa blandningen för att bestämma vilken utspädning av mikrotubuli som ska användas i de kommande experimenten.Bestäm laserintensiteten för experimentet empiriskt så att alla fluorescerande proteiner är upplysta, men genomgår inte signifikant fotoblekning under experimentets gång. Ställ in mikroskoptemperaturen på 28 grader Celsius för att visa dynamiska mikrotubuli. Använd linspapper för att rengöra ett 100X-mål med 70% etanol.Använd den bästa kombinationen av filterkuber och emissionsfilter beroende på vilka fluorescerande kanaler som ska avbildas. Ställ in bildsekvensen. För ett experiment med 647 nanometer fluoroformärkta biotinylerade mikrotubuli, 560 nanometer fluoroformärkta icke-biotinylerade mikrotubuli i lösligt tubulin och GFP-märkt protein av intresse, avbilda 488 nanometer, 560 nanometer och 647 nanometer kanaler var 10: e sekund i 20 minuter.För att fånga en referensbild av buntar före tillsats av lösligt tubulin och mikrotubuliassocierat protein, sätt upp en sekvens med en bild vardera i 560 nanometer och 647 nanometer våglängdskanaler. Kontrollera laserstrålens position i taket ovanför mikroskopet och gör ändringar i strålen med hjälp av programvara. Se till att laserbelysningen är inriktad.Innan avbildning, tillsätt en droppe mikroskop nedsänkningsolja till målet. Förbered den lösliga tubulinblandningen medan du håller den på is och snurra ner blandningen. För att immobilisera mikrotubuli via biotin-NeutrAvidin-biotin-koppling, flöda först i cirka 7,5 mikroliter NeutrAvidin-lösning tills kammaren är fylld och inkubera i fem minuter.Tvätta med 10 mikroliter MB kyla. Flöda i 7,5 mikroliter av det blockerande proteinet KC och inkubera i två minuter. Tvätta med 10 mikroliter MB varmt för att förbereda kammaren för införande av mikrotubuli.Späd ut beståndet av biotinylerade mikrotubuli i BRB ADDTT och tillsätt en mikroliter av denna utspädning till nio mikroliter MB varm. Flöda blandningen in i kammaren och inkubera i 10 minuter. Tvätta bort icke-immobiliserade mikrotubuli med 10 mikroliter MB varmt.Flöda 7,5 mikroliter varm KC in i kammaren och inkubera i två minuter. Under inkubationen bereds en två nanomolär lösning av tvärbindningen eller proteinet PRC1 i KC och snurra ner lösningen. Flöda 10 mikroliter av denna lösning in i bildkammaren och inkubera i fem minuter.För att göra buntar, flöda 10 mikroliter icke-biotinylerade mikrotubuli in i kammaren och inkubera i 10 minuter. Tvätta kammaren två gånger med 10 mikroliter MB varmt. Under 10-minuters inkubationstiden, förbered 10 mikroliter analysblandning innehållande proteiner av intresse, lösligt tubulin, nukleotider, syreavskigare och antioxidanter och snurra ner det.Håll blandningen på is. Ladda den förberedda bildkammaren tejpad på glidhållaren på 100X TIRF-målet. Använd kanalerna 560 nanometer och 647 nanometer för att hitta ett synfält som innehåller ett optimalt antal och densitet av enskilda mikrotubuli och buntar.När ett synfält har identifierats tar du en referensbild. Flöda försiktigt i analysblandningen utan att störa bildkammaren. Försegla kammarens öppna ändar med VALAP tätningsmedel.Observera mikrotubuli och starta bildsekvensen. Efter immobilisering av mikrotubulifrön och generering av buntar erhölls fluorescensbilder. Enstaka mikrotubuli identifierades av fluorescerande signal i 647 nanometerkanalen, medan mikrotubuli identifierades som förformade buntar när de visade fluorescerande signaler i båda kanalerna.Dynamiken hos enskilda mikrotubuli och PRC1-tvärbundna buntar studerades i närvaro av proteinerna KIF4A och CLASP1, vilket avslöjade att de enskilda mikrotubuli förlängs under analysens gång, medan tillväxten av tvärbundna mikrotubuli avstannar. Var noga med att hålla polymeriserade mikrotubuli vid eller över rumstemperatur. Håll lösligt tubulin på is och skydda bildkammaren och fluorescerande märkta mikrotubuli och proteiner från ljus.Dessa analyser gav mekanistisk inblick i hur en proteinmodul som finns vid den mitotiska spindeln differentiellt kan reglera dynamiken i två olika mikrotubulipopulationer som samexisterar i spindeln.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondera strukturen och dynamiken i Nucleosomes med hjälp av Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Avbildning av extracellulära blåsor med atomkraft mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisera Surface T-cellsreceptordynamik fyrdimensionellt använda lattice ljusark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisera diffusionell dynamik av guldnanroder på cellmembran med hjälp av en nanopartikel Darkfield Mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Samtidig interferensreflektion och total intern reflektion Fluorescensmikroskopi för avbildning av dynamiska mikrotubuli och associerade proteiner

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Använda mikrofluidik och fluorescensmikroskopi för att studera monteringsdynamiken hos enstaka aktinfilament och buntar

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Visualisering av aktin- och mikrotubulikopplingsdynamik in vitro genom total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...