Name: simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy
Uploaded: 2022-02-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Bu çalışma, NIH'den (no. 1DP2GM126894-01) bir hibe ve Pew Charitable Trusts ve Smith Family Foundation'dan R.S.'ye sağlanan fonlarla desteklendi. Yazarlar, protokollerin geliştirilmesine ve optimizasyonuna yaptığı katkılardan dolayı Dr. Shuo Jiang'a teşekkür eder.

1. Reaktifleri hazırlayın
<ol><li>Arabellekleri ve reaktifleri Tablo 1 ve Tablo 2'de belirtildiği gibi hazırlayın. Deney sırasında, aksi belirtilmedikçe, tüm çözeltileri buz üzerinde tutun.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Çözüm</td>
			<td colspan="2">Bileşen</td>
			<td>Önerilen Depolama Süresi</td>
			<td colspan="2...

<ol>
	<li>Subramanian, R., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+complexity:+insights+into+self-organized+assembly+of+microtubule-based+architectures.">Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures.</a> Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+determine+and+maintain+Drosophila+bristle+shape.">Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape.</a> Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).</li><li>Foe, V. E., von Dassow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+shape+the+myosin+activation+zone+during+cytokinetic+furrow+formation.">Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).</li><li>Pous, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specialization+of+stable+and+dynamic+microtubules+in+protein+traffic+in+WIF-B+cells.">Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells.</a> The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).</li><li>Uehara, R., Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+central+spindle+assembly+requires+de+novo+microtubule+generation+in+the+interchromosomal+region+during+anaphase.">Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+microtubule+plus-end+tracking+system+in+vitro.">Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro.</a> Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+pushing+and+braking+forces+generated+by+ensembles+of+Kinesin-5+crosslinking+two+microtubules.">Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules.</a> Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).</li><li>Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+single+microtubules+and+bundles+by+a+three-protein+module.">Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module.</a> Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).</li><li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTP+hydrolysis+in+microtubule+dynamics:+information+from+a+slowly+hydrolyzable+analogue,+GMPCPP.">Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).</li><li>Subramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+antiparallel+microtubule+crosslinking+by+PRC1,+a+conserved+nonmotor+microtubule+binding+protein.">Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein.</a> Cell. 142 (3), 433-443 (2010).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Wijeratne, S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+of+antiparallel+microtubule+bundles+regulates+relative+sliding+and+stalling+by+PRC1+and+Kif4A.">Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A.</a> eLife. 7, 32595 (2018).</li><li>Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+geometrical+features+of+microtubules+as+regulators+of+microtubule+organization.">Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization.</a> eLife. 10, 63880 (2021).</li><li>Freal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-driven+assembly+of+the+axon+initial+segment.">Feedback-driven assembly of the axon initial segment.</a> Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).</li><li>Ledbetter, M., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;microtubule&amp;#34;+in+plant+cell+fine+structure.">A &amp;#34;microtubule&amp;#34; in plant cell fine structure.</a> The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).</li><li>Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+reveals+distinct+protofilament-scale+structural+dynamics+in+depolymerizing+microtubule+arrays.">Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).</li></ol>

Burada açıklanan deney, geleneksel olarak tek mikrotübüller veya bir dizi türü üzerinde gerçekleştirilen geleneksel mikrotübül sulandırma tahlillerinin kapsamını ve karmaşıklığını önemli ölçüde genişletmektedir. Mevcut tahlil, iki popülasyonda, yani tek mikrotübüller ve çapraz bağlı demetler üzerindeki düzenleyici MAP aktivitesini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, bu tahlil iki tür demetin incelenmesine izin verir: dinamiklerin başlatılm...

Mikrotübüller, hücre içi taşıma ve organel konumlandırmasından hücre bölünmesi ve uzamasına kadar çoklu hücresel süreçler için gerekli olan yapısal iskeleleri oluşturan biyopolimerlerdir. Bu çeşitli işlevleri yerine getirmek için, bireysel mikrotübüller mitotik iğler, siliyer aksonemler, nöronal demetler, interfaz dizileri ve bitki kortikal dizileri gibi mikron boyutlu diziler halinde düzenlenir. Bu yapılarda bulunan her yerde bulunan bir mimari motif, uzunlukları boyunca çapraz bağlanmış bir mikrotübül demetidir1. Birkaç mikrotübül bazlı yapının ilgi çekici bir özelliği, demetlenmiş mikrotübüllerin ve çapraz bağlı olmayan tek mikrotübüllerin yakın uzamsal yakınlıkta bir arada bulunmasıdır. Bu mikrotübül alt popülasyonları, düzgün işlevleri için gerektiği gibi, birbirlerinden çok farklı polimerizasyon dinamikleri gösterebilir2,3,4,5. Örneğin, mitotik iş mili içinde, hücre merkezindeki mikron ölçekli bir bölgede kararlı çapraz bağlı demetler ve dinamik tek mikrotübüller bulunur6. Bu nedenle, birlikte bulunan mikrotübül popülasyonlarının dinamik özelliklerinin nasıl belirlendiğinin incelenmesi, mikrotübül bazlı yapıların montajını ve işlevini anlamak için merkezidir.
Mikrotübüller, polimerizasyon ve depolimerizasyon aşamaları arasında geçiş yapan, felaket ve kurtarma olarak bilinen olaylarda iki faz arasında geçiş yapan dinamik polimerlerdir7. Hücresel mikrotübüllerin dinamikleri, mikrotübül polimerizasyonu ve depolimerizasyon oranlarını ve felaket ve kurtarma olaylarının frekanslarını modüle eden sayısız Mikrotübül İlişkili Protein (MAP'ler) tarafından düzenlenir. Işık mikroskobunda, özellikle de yüksek mikrotübül yoğunluğuna sahip bölgelerde, uzamsal çözünürlüğün sınırlamaları nedeniyle, hücrelerdeki uzamsal proksimal diziler üzerindeki MAP'lerin aktivitesini araştırmak zordur. Dahası, aynı hücresel bölgede birden fazla MAP'nin varlığı, hücre biyolojik çalışmalarının yorumlanmasını engellemektedir. Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobu ile birlikte gerçekleştirilen in vitro sulandırma testleri, MAP'lerin belirli alt kümelerinin proksimal hücresel mikrotübül dizilerinin dinamiklerini düzenlediği mekanizmaları incelemenin zorluklarını aşmaktadır. Burada, in vitro olarak monte edilen mikrotübüllerin dinamikleri, kontrollü koşullar altında bir veya daha fazla rekombinant MAP'nin varlığında incelenir8,9,10. Bununla birlikte, geleneksel sulandırma testleri tipik olarak tek mikrotübüller veya bir dizi türü üzerinde gerçekleştirilir ve birlikte var olan popülasyonların görselleştirilmesini engeller.
Burada, aynı çözelti koşulları altında iki mikrotübül popülasyonunun eşzamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayan in vitro sulandırma testleri sunuyoruz11. Tek mikrotübüller ve mitotik iğle ilişkili protein PRC1 tarafından çapraz bağlanmış mikrotübül demetleri üzerinde birden fazla MAP'nin kolektif aktivitesini aynı anda görüntülemek için bir yöntem açıklıyoruz. PRC1 proteini tercihen anti-paralel mikrotübüller arasındaki örtüşmeye bağlanır ve onları çapraz bağlar9. Kısaca, bu protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: (i) stok çözeltilerinin ve reaktiflerin hazırlanması, (ii) mikroskopi deneyleri için görüntüleme odasını oluşturmak için kullanılan kapak fişlerinin temizlenmesi ve yüzey işlemi, (iii) deney sırasında polimerizasyonun başlatıldığı kararlı mikrotübül "tohumlarının" hazırlanması, (iv) mikrotübül dinamiklerini görselleştirmek için TIRF mikroskop ayarlarının spesifikasyonu, (v) mikrotübül tohumlarının immobilizasyonu ve çapraz bağlı mikrotübül demetlerinin üretilmesi görüntüleme odasında ve (vi) çözünür tübülin, MAP'ler ve nükleotidlerin eklenmesi üzerine TIRF mikroskobu ile görüntüleme odasındaki mikrotübül dinamiklerinin görselleştirilmesi. Bu testler, MAP lokalizasyonunun ve bunların iki mikrotübül popülasyonunun dinamikleri üzerindeki etkilerinin nitel olarak değerlendirilmesini ve nicel olarak incelenmesini sağlar. Ek olarak, çoklu MAP'lerin bu mikrotübül popülasyonları üzerindeki sinerjik etkilerinin çok çeşitli deneysel koşullarda değerlendirilmesini kolaylaştırırlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >238813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18x18 mm #1.5 coverslips&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24x60 mm #1.5 coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >405/488/560/647 nm Laser Quad Band&#160;</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>TRF89901-NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7699-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avidin, NeutrAvidin&#174; Biotin-binding Protein (Molecular Probes&#174;)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>343776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Catalase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Delicate Task Wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET610/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200-proof)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GMPCPP</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>NU-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hellmanex III detergent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion oil, Type A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>77010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kappa-casein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lanolin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microfuge 16 Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90&#176; Ground Edges, WHITE Frosted</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1380-50W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000&#160;</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>#NH2-PEG-VA-5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optima&#8482; Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraffin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5377-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petrolatum, White</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plasma Cleaner, 115V</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2520-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#8482; Pierce&#8482; Bond-Breaker&#8482; TCEP Solution, Neutral pH; 500mM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>PI-77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apochromat TIRF 100XC Oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIRF microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.1 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>362224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TLA 120.2 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T333P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL620M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTABOND&#174; Reagent, Tissue Section Adhesion</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>SP-1800-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VWR&#174; Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97025-630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous visualization of the dynamics of crosslinked and single microtubules in vitro by tirf microscopy

Mikrotübüller, hücrelerde farklı yapılara organize olan αβ-tübülin heterodimerlerinin polimerleridir. Mikrotübül tabanlı mimariler ve ağlar genellikle dinamik özelliklerinde farklılık gösteren mikrotübül dizilerinin alt kümelerini içerir. Örneğin, bölünen hücrelerde, çapraz bağlı mikrotübüllerin kararlı demetleri, dinamik çapraz bağlı olmayan mikrotübüllere yakın bir yerde bir arada bulunur. TIRF-mikroskopi tabanlı in vitro sulandırma çalışmaları, bu farklı mikrotübül dizilerinin dinamiklerinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesini sağlar. Bu tahlilde, bir görüntüleme odası, tek filamentler halinde bulunan veya çapraz bağlı demetler halinde organize edilen yüzey immobilize mikrotübüllerle birleştirilir. Tübülin, nükleotitler ve protein düzenleyicilerinin tanıtılması, ilişkili proteinlerin ve tek ve çapraz bağlı mikrotübüllerin dinamik özelliklerinin doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Ayrıca, dinamik tek mikrotübüller demetler halinde organize olurken meydana gelen değişiklikler gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Burada açıklanan yöntem, bireysel proteinlerin aktivitesinin ve lokalizasyonunun sistematik bir değerlendirmesinin yanı sıra, protein düzenleyicilerinin aynı deneysel koşullar altında iki farklı mikrotübül alt kümesi üzerindeki sinerjik etkilerinin sistematik bir şekilde değerlendirilmesine izin verir, böylece diğer yöntemlerle erişilemeyen mekanik bilgiler sağlar.

Yukarıda açıklanan deney, 647 nm florofor etiketli biyotinillenmiş mikrotübüller, 560 nm florofor etiketli biyotinillenmemiş mikrotübüller ve 560 nm florofor etiketli çözünür tübülin karışımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Mikrotübüller, çapraz bağlayıcı protein PRC1 (GFP etiketli) ile çapraz bağlandı. Yüzeysel hareketsiz demetler ve tek mikrotübüller üretildikten sonra (adım 5.11), görüntüleme odası bir TIRF 100X 1.49 NA yağ hedefi üzerine monte edildi ve 560 nm ve 647 nm f...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy at JoVE.com

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Hücresel mikrotübül dizileri, fonksiyon için gerekli olduğu gibi farklı dinamik özelliklere sahip mikrotübüllerin alt popülasyonlarını içerir. Bu protokol, düzenleyicilerin kolektif aktivitesinin, farklı özelliklere sahip proksimal mikrotübül alt popülasyonlarını nasıl verdiğini ele almaktadır. Bu aşağıdan yukarıya tazminat testi, tek mikrotübüller ve demetler gibi proksimal mikrotübül popülasyonlarının organizasyonunu ve dinamiklerini eşzamanlı olarak görselleştirmemizi ve öz-organizasyonlarının altında yatan mekanizmaları deşifre etmemizi sağlar.Çok bileşenli sulandırma, her birinin aktivitesini korurken pH, iyonik mukavemet ve protein konsantrasyonu gibi deneysel parametrelerin optimize edilmesini gerektirir. Çok proteinli tahlillerden önce bireysel bileşenlerin sistematik analizi son derece yararlıdır. Başlamak için, bir mikrolitre mikrotübül çözeltisi içinde 4.5 mikrolitre BRB ADDTT karışımını bir mikroskop slaytına pipetleyin.18 x 18 milimetrelik bir kapak kayışı ile örtün ve kenarları şeffaf oje veya VALAP sızdırmazlık maddesi ile kapatın. TIRF hedefini kapak fişinin altına yerleştirin. Yaklaşan deneylerde mikrotübüllerin hangi seyreltilmesinin kullanılacağını belirlemek için yeni polimerize edilmiş mikrotübülleri parlak karışımdaki floresan etiketli tübülin için uygun bir dalga boyunda görselleştirin.Deney için lazer yoğunluğunu ampirik olarak belirleyin, böylece tüm floresan proteinleri aydınlatılır, ancak deneyin zaman içinde önemli bir fotobeyazlatmaya maruz kalmazlar. Dinamik mikrotübülleri görüntülemek için mikroskop sıcaklığını 28 santigrat dereceye ayarlayın. 100X'lik bir hedefi %70 etanol ile temizlemek için lens kağıdı kullanın.Görüntülenecek floresan kanallara bağlı olarak filtre küpleri ve emisyon filtrelerinin en iyi kombinasyonunu kullanın. Görüntüleme sırasını ayarlayın. 647 nanometre florofor etiketli biyotinillenmiş mikrotübül, çözünür tübülin içinde 560 nanometre florofor etiketli biyotinillenmemiş mikrotübüller ve GFP etiketli protein ile yapılan bir deney için, 488 nanometre, 560 nanometre ve 647 nanometre kanallarını her 10 saniyede bir 20 dakika boyunca görüntüleyin.Çözünür tübülin ve mikrotübülle ilişkili proteinin eklenmesinden önce demetlerin referans görüntüsünü yakalamak için, her biri 560 nanometre ve 647 nanometre dalga boyu kanallarında bir görüntü içeren bir dizi oluşturun. Lazer ışınının mikroskop üzerindeki tavandaki konumunu kontrol edin ve yazılımı kullanarak ışında değişiklikler yapın. Lazer aydınlatıcının hizalandığından emin olun.Görüntülemeden önce, hedefe bir damla mikroskop daldırma yağı ekleyin. Çözünür tübülin karışımını buz üzerinde tutarken hazırlayın ve karışımı aşağı doğru döndürün. Mikrotübülleri biyotin-NeutrAvidin-biotin bağlantısı yoluyla hareketsiz hale getirmek için, önce oda dolana kadar yaklaşık 7.5 mikrolitre NeutrAvidin çözeltisi içinde akıtın ve beş dakika boyunca inkübe edin.10 mikrolitre MB soğuk ile yıkayın. Bloke edici protein KC'nin 7.5 mikrolitresinde akın ve iki dakika boyunca inkübe edin. Odayı mikrotübüllerin sokulmasına hazırlamak için 10 mikrolitre MB ılık ile yıkayın.BRB ADDTT'deki biyotinile mikrotübüllerin stokunu seyreltin ve bu seyreltmenin bir mikrolitresini dokuz mikrolitre MB sıcaklığa ekleyin. Karışımı odaya akıtın ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Hareketsiz mikrotübülleri 10 mikrolitre MB ılık ile yıkayın.Odaya 7.5 mikrolitre ılık KC akışı yapın ve iki dakika boyunca inkübe edin. Kuluçka sırasında, KC'de çapraz bağ veya protein PRC1'in iki nanomolar çözeltisini hazırlayın ve çözeltiyi aşağı doğru döndürün. Bu çözeltinin 10 mikrolitresini görüntüleme odasına akıtın ve beş dakika boyunca inkübe edin.Demetler yapmak için, odaya 10 mikrolitre biyotinillenmemiş mikrotübül akıtın ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Odayı 10 mikrolitre MB ılık ile iki kez yıkayın. 10 dakikalık inkübasyon süresi boyunca, ilgilenilen proteinleri, çözünür tübülini, nükleotitleri, oksijen temizleyicilerini ve antioksidanları içeren 10 mikrolitre tahlil karışımı hazırlayın ve aşağı doğru çevirin.Karışımı buz üzerinde tutun. Slayt tutucuya bantlanmış hazırlanmış görüntüleme odasını 100X TIRF hedefine yükleyin. Tek mikrotübüllerin ve demetlerin optimum sayısını ve yoğunluğunu içeren bir görüş alanı bulmak için 560 nanometre ve 647 nanometre kanallarını kullanın.Bir görüş alanı tanımlandıktan sonra, bir referans görüntüsü alın. Görüntüleme odasını rahatsız etmeden tahlil karışımında dikkatlice akıtın. Odanın açık uçlarını VALAP sızdırmazlık maddesi ile kapatın.Mikrotübülleri gözlemleyin ve görüntüleme dizisini başlatın. Mikrotübül tohumları hareketsiz hale getirildikten ve demetler oluşturulduktan sonra floresan görüntüler elde edildi. Tek mikrotübüller, 647 nanometre kanalındaki floresan sinyalle tanımlanırken, mikrotübüller her iki kanalda da floresan sinyalleri gösterdiğinde önceden oluşturulmuş demetler olarak tanımlandı.Tek mikrotübüllerin ve PRC1 çapraz bağlı demetlerin dinamikleri, KIF4A ve CLASP1 proteinlerinin varlığında incelenmiştir, bu da tek mikrotübüllerin tahlil boyunca uzadığını, çapraz bağlı mikrotübüllerin büyümesinin ise durduğunu ortaya koymuştur. Polimerize mikrotübülleri oda sıcaklığında veya üzerinde tutmaya dikkat edin. Çözünür tübülini buz üzerinde tutun ve görüntüleme odasını ve floresan etiketli mikrotübülleri ve proteinleri ışıktan koruyun.Bu analizler, mitotik iğde bulunan bir protein modülünün iş milinde bir arada bulunan iki farklı mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini farklı şekilde nasıl düzenleyebileceğine dair mekanik bir bakış açısı sağlamıştır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Hücre Dışı Veziküllerin Görüntülenmesi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Tek Nanopartikül Darkfield Mikroskopisi Kullanarak Hücre Zarında Altın Nanorodların Difüzyonel Dinamiklerini Görselleştirme

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...