Name: measurement of oxygen consumption rate in acute striatal slices from adult mice
Uploaded: 2022-06-08T12:40:00
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Nous remercions Wangchen Tsering et Pamela Walter pour leur lecture critique et leur édition de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 à C.J. L. et NS098393 à H.Z.) et le Département de neurosciences de l’Université Thomas Jefferson (Startup Funds à H.Z.).

Toutes les procédures, y compris le travail sur les animaux, ont été menées conformément aux directives nationales et internationales et ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Thomas Jefferson. Des souris mâles FVB/NTac âgées de 3 à 14 mois ont été utilisées. Les étapes suivantes ont été effectuées dans un environnement non stérile, mais il faut faire preuve de prudence pour que tout reste aussi propre que possible.
REMA...

<ol>
	<li>Hauser, D. N., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+Parkinson's+disease+and+monogenic+parkinsonism.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism.</a> Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).</li><li>Swerdlow, R. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease+mutations+in+PINK1+result+in+decreased+Complex+I+activity+and+deficient+synaptic+function.">Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function.</a> EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).</li><li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements.">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li><li>Ferrick, D. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+assay+for+respiration+in+isolated+brain+microvessels+reveals+impaired+mitochondrial+function+in+the+aged+mice.">A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice.</a> Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).</li><li>Schuh, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+microplate-based+respirometry+for+hippocampal+slices+and+analysis+of+respiratory+capacity.">Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity.</a> Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).</li><li>Zhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PINK1+causes+age-dependent+decrease+of+dopamine+release+and+mitochondrial+dysfunction.">Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction.</a> Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).</li><li>Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mitochondrial+analysis+in+acute+brain+sections+from+adult+rats+reveals+mitochondrial+dysfunction+in+a+rat+model+of+migraine.">Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).</li><li>Qi, G., Mi, Y., Yin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+brain+metabolic+function+ex+vivo+with+acute+mouse+slice+punches.">Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).</li><li>Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assessing+tissue+respiration+in+anatomically+defined+brain+regions.">A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).</li></ol>

La méthode que nous avons développée a permis d’utiliser un analyseur XF pour mesurer l’OCR dans des tranches striatales de souris adultes sur une période de 4 h. Cette méthode offre une nouvelle façon de mesurer la bioénergétique cellulaire dans les poinçons excisés à partir de structures cérébrales anatomiquement définies. Étant donné que les échantillons de tissus analysés sont plutôt petits, les paramètres métaboliques de zones cérébrales spécifiques impliquées dans une maladie peuvent ê...

Le dysfonctionnement mitochondrial a été impliqué dans plusieurs maladies neurologiques, y compris la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington et la maladie d’Alzheimer 1,2,3. Les modèles tels que les souris et les rats PINK1 knockout (KO) présentent une altération de la fonction mitochondriale 4,5,6,7,8,9,10,11. Les mitochondries isolées du striatum (STR) ou du cerveau entier d’une souris ROSE1 KO âgée présentent des défauts dans le complexe I 7,10,12,13. La mesure directe du taux de consommation d’oxygène (OCR) est l’une des méthodes les plus courantes pour évaluer la fonction mitochondriale puisque l’OCR est couplée à la production d’ATP, la fonction principale des mitochondries14. Par conséquent, la mesure de l’OCR dans des modèles de maladie ou des échantillons / tissus dérivés du patient peut aider à étudier comment le dysfonctionnement mitochondrial conduit à la maladie.
Actuellement, il existe plusieurs façons de mesurer l’OCR mitochondriale, y compris l’électrode Clark et d’autresélectrodes O2, le colorant fluorescent O 2 et l’analyseur de flux extracellulaire 15,16,17,18,19. En avantage, les méthodes à base d’électrodes O2 permettent d’ajouter facilement divers substrats. Cependant, ils sont insuffisants pour mesurer simultanément plusieurs échantillons. Par rapport aux méthodestraditionnelles à base d’électrodes O 2, l’analyseur de flux extracellulaire, un outil couramment utilisé pour l’OCR dans les cultures cellulaires ou les mitochondries purifiées, offre un débit amélioré de 15,18,20. Néanmoins, toutes ces méthodes sont généralement appliquées pour mesurer l’OCR dans des mitochondries isolées ou des cultures cellulaires 6,16,17,19,20,21. L’isolement des mitochondries cause des dommages par inadvertance, et les mitochondries extraites ou les cultures cellulaires sont moins pertinentes physiologiquement que les tranches de cerveau intactes22. Même lorsque les microélectrodes sont utilisées en tranches, elles sont moins sensibles et plus difficiles à utiliser que dans les cellules cultivées23.
Pour relever ces défis, nous avons développé une méthode utilisant l’analyseur de flux extracellulaire XF24, qui permet d’analyser plusieurs paramètres métaboliques à partir de tranches cérébrales striatales aiguës de souris24. Cette technique fournit une quantification directe continue de la respiration mitochondriale via l’OCR. En bref, de petites sections de tranches cérébrales striatales sont placées dans des puits de la plaque d’îlot, et l’analyseur utilise des biocapteurs fluorescents à base d’oxygène et de protons pour mesurer l’OCR et le taux d’acidification extracellulaire, respectivement 17,21,25.
L’une des caractéristiques uniques de l’analyseur est les quatre puits d’injection, qui permettent la mesure continue de l’OCR tout en injectant séquentiellement jusqu’à quatre composés ou réactifs; cela permet de mesurer plusieurs paramètres de respiration cellulaire, tels que l’OCR mitochondriale basale, l’OCR liée à l’ATP et l’OCR mitochondriale maximale. Les composés injectés lors des mesures pour le protocole montrés ici étaient des concentrations de travail de 10 mM de pyruvate dans le puits de la première solution (port A), de 20 μM d’oligomycine dans le puits de la deuxième solution (port B), de 10 μM de cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) dans le troisième puits (port C) et de 20 μM d’antimycine A dans le quatrième puits (port D), d’après Fried et al.25. Il convient de noter que ces concentrations étaient des concentrations de travail et que des solutions mères de 10x, 11x, 12x et 13x ont été injectées dans les ports de solution A à D, respectivement. Le but de l’utilisation de chaque solution était le suivant: 1) Le pyruvate était nécessaire car, sans lui, l’ajout de FCCP aurait une réponse OCR diminuée causée par une limitation des substrats disponibles; 2) L’oligomycine inhibe l’ATP synthase et permet de mesurer la respiration liée à l’ATP; 3) FCCP découple l’oxydation de la phosphorylation et permet la mesure de la capacité mitochondriale maximale; 4) L’antimycine A inhibe le complexe III dans la chaîne de transport d’électrons et, par conséquent, permet la mesure de l’OCR non liée aux mitochondries.
La concentration d’oligomycine utilisée a été déterminée pour les raisons suivantes : 1) La dose recommandée d’oligomycine pour la plupart des types de cellules (mitochondries isolées ou cultures cellulaires) est de 1,5 μM. D’après l’expérience, généralement 3x-10x de la dose de cellules dissociées est utilisée pour les expériences de tranches, car il peut y avoir un gradient et la pénétration de la solution dans les tranches prend du temps. Par conséquent, la concentration doit être comprise entre 5 μM et 25 μM. 2) Une concentration de 20 μM a été choisie sur la base de Fried et al.25. Des concentrations plus élevées n’ont pas été essayées en raison de la toxicité non spécifique de l’olélicine. 3) Dans le rapport d’Underwood et al.26, les auteurs ont fait une expérience de titrage pour l’oligomycine et ont constaté que des doses de 6,25, 12,5, 25 et 50 μg / mL entraînaient une inhibition similaire. La concentration plus élevée d’oligomycine (50 μg/mL) n’a pas inhibé davantage, mais a eu une plus grande variance. 4) Dans notre observation, le facteur déterminant semble être la capacité de pénétration de l’olligomycine. Il est difficile pour l’oligomycine de pénétrer dans le tissu, et c’est pourquoi il faut au moins 7 à 8 cycles pour atteindre le plateau, la réponse maximale. Tant qu’il atteint le plateau, l’inhibition est supposée être maximale.
L’un des principaux défis techniques de l’adaptation de l’analyseur de flux extracellulaire pour mesurer l’OCR dans les tranches striatales est de prévenir l’hypoxie tissulaire. Comme le tampon n’a pas été oxygéné pendant toute la durée des mesures (environ 4 h), l’hypoxie était un problème central. Cela est particulièrement vrai pour les échantillons de tissus plus épais, où l’oxygène ne peut pas diffuser dans les échantillons. Pour surmonter ce problème, des tranches ont été sectionnées à 150 μm d’épaisseur, de sorte que l’oxygène ambiant puisse pénétrer au milieu des tranches de cerveau. De plus, 4 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) ont été ajoutés au tampon du liquide céphalo-rachidien artificiel préoxygéné (ACSF), ce qui a facilité la détermination de l’OCR maximale, comme suggéré précédemment23. Nous avons examiné si les cellules étaient vivantes. Tout d’abord, Hoechst 33258 (10 μM) et l’iodure de propidium (10 μM) ont été utilisés pour examiner si les cellules étaient saines dans ces conditions. Nous avons ensuite examiné si les neurones épineux moyens étaient fonctionnellement sains à l’aide de l’enregistrement patch-clamp. Nous avons ensuite évalué si les terminaux dopaminergiques (DA) dans les tranches striatales étaient fonctionnellement sains en mesurant la libération de DA à l’aide de la voltampérométrie à balayage rapide. Les résultats ont montré que les tranches striatales qui n’étaient pas oxygénées (groupe ACSF/BSA) étaient aussi saines que le groupe témoinoxygéné 24.
Nous avons ensuite testé différentes combinaisons d’épaisseur de tranche et de taille de poinçon pour déterminer les conditions optimales de la tranche striatale pour le test de respiration de flux. Des tranches striatales dorsales de différentes épaisseurs (150 μm et 200 μm) et de différentes tailles de poinçonnage (1,0 mm, 1,5 mm et 2,0 mm de diamètre) ont été utilisées pour l’analyse OCR à l’aide de l’analyseur. Les tranches striatales de 150 μm d’épaisseur avec une taille de poinçon de 1,5 mm de diamètre avaient l’efficacité de couplage la plus élevée et des OCR dans une plage optimale pour l’analyseur24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accumet AB150 pH benchtop meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB150</td>
			<td>To measure pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A8674</td>
			<td>To inhibit complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6003</td>
			<td>To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2920</td>
			<td>To uncouple mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>To dissovle compounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H3375</td>
			<td>To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified non-CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-683-230D</td>
			<td>To hydrate plates at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>O4876</td>
			<td>To inhibit mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td>sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3616</td>
			<td>To inhibit complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103681-100</td>
			<td>Solution for seahorse calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 FluxPaks</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>101174-100</td>
			<td>Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens,&#160; calibrant solution and calibration plates; assay kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2256</td>
			<td>To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel biopsy punches</td>
			<td>Miltex</td>
			<td></td>
			<td>Device used to punch slices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Eppendrof</td>
			<td>0030700102</td>
			<td>Used for slice punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>To slice brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific Precision</td>
			<td>282-115</td>
			<td>To heat buffer and solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rate in acute striatal slices from adult mice

Les mitochondries jouent un rôle important dans la production cellulaire d’ATP, la régulation des espèces réactives de l’oxygène etle contrôle de la concentration de Ca 2 +. Le dysfonctionnement mitochondrial a été impliqué dans la pathogenèse de multiples maladies neurodégénératives, y compris la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington et la maladie d’Alzheimer. Pour étudier le rôle des mitochondries dans les modèles de ces maladies, nous pouvons mesurer la respiration mitochondriale via le taux de consommation d’oxygène (OCR) comme proxy de la fonction mitochondriale. L’OCR a déjà été mesurée avec succès dans des cultures cellulaires, ainsi que dans des mitochondries isolées. Cependant, ces techniques sont moins pertinentes physiologiquement que la mesure de l’OCR dans les tranches de cerveau aiguës. Pour surmonter cette limitation, les auteurs ont développé une nouvelle méthode utilisant un analyseur Seahorse XF pour mesurer directement l’OCR dans les tranches striatales aiguës de souris adultes. La technique est optimisée en mettant l’accent sur le striatum, une zone du cerveau impliquée dans la MP et la maladie de Huntington. L’analyseur effectue un test de cellules vivantes à l’aide d’une plaque de 24 puits, ce qui permet la mesure cinétique simultanée de 24 échantillons. La méthode utilise des morceaux perforés circulairement de tranches cérébrales striatales comme échantillons. Nous démontrons l’efficacité de cette technique en identifiant une OCR basale inférieure dans des tranches striatales d’un modèle murin de MP. Cette méthode intéressera grandement les chercheurs travaillant dans le domaine de la MP et de la maladie de Huntington.

La première étape de cette étude consistait à optimiser l’épaisseur de la tranche et la taille du poinçon utilisée pour exciser une section du striatum de la tranche (figure 3A). Une tranche de 150 μm d’épaisseur et une taille de poinçon de 1,5 mm ont donné les meilleurs résultats déterminés par l’efficacité du couplage (Figure 3B-C). Comme le montre la figure 3B, l’OCR est re...

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Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice

Le taux de consommation d’oxygène (OCR) est un indicateur commun de la fonction mitochondriale et peut être utilisé pour étudier différents modèles de maladie. Nous avons développé une nouvelle méthode utilisant un analyseur Seahorse XF pour mesurer directement l’OCR dans les tranches striatales aiguës de souris adultes qui est plus pertinente physiologiquement que d’autres méthodes.

Mesure du taux de consommation d’oxygène dans les tranches striatales aiguës de souris adultes

Mitochondria play an important role in cellular ATP production, reactive oxygen species regulation, and Ca2+ concentration control. Mitochondrial ...

Nous avons développé une nouvelle méthode utilisant un analyseur XF hippocampe pour mesurer directement le taux de consommation d’oxygène. Mais proxy commun pour la fonction mitochondriale dans la tranche de lame aiguë de souris adultes. Cette méthode mesure un cellulaire par l’énergie dans les ponctions à partir de structures cérébrales anatomiquement définies.L’utilisation de tranches aiguës imite plus étroitement l’environnement cellulaire physiologique, ce qui ne peut pas être réalisé de la même manière que les cellules mitochondriales ou de culture isolées. Cette méthode intéressera grandement les chercheurs travaillant dans le domaine de la maladie de Parkinson et de la maladie de Huntington. Pour commencer, ouvrez le kit de dosage de flux extracellulaire et retirez à la fois la cartouche du capteur et la plaque utilitaire.Placez ensuite la cartouche du capteur de côté et ne touchez pas les capteurs. Ensuite, ajoutez 600 microlitres de solution d’étalonnage à chaque paroi de la plaque utilitaire. Placez la cartouche de capteur sur le dessus de la plaque d’utilité et immergez les capteurs dans la solution d’étalonnage, en vous assurant que l’encoche triangulaire de l’utilitaire et la plaque de cartouche de capteur sont correctement alignées.Ensuite, scellez le kit de dosage de flux extracellulaire avec un film d’étanchéité pour empêcher l’évaporation de la solution d’étalonnage, puis placez-le dans un incubateur de 37 degrés Celsius non complété par du dioxyde de carbone ou de l’oxygène, pendant la nuit. Ouvrez la micro plaque de capture des œillets et retirez la plaque d’œillets pour la position assise des tissus. Ensuite, réchauffez un volume approprié de tampon de liquide céphalorachidien artificiel modifié pré-oxygéné à 37 degrés Celsius dans un tube de 50 millilitres.Ensuite, ajoutez BSA à une concentration finale de quatre milligrammes par millilitre pour préparer le tampon respiratoire. Ajoutez soigneusement 625 microlitres de tampon respiratoire à chaque puits de la plaque oculaire tout en évitant de secouer la plaque, en vous assurant qu’aucune bulle d’air n’est présente dans le tampon de chaque puits. Disséquez immédiatement le cerveau dans 10 millilitres de solution de coupe pré-oxygénée glacée.Ensuite, en utilisant une section vibratome de tranches striatales coronales, en suivant les instructions du fabricant à une épaisseur de 150 micromètres dans une solution de coupe pré-oxygénée glacée. Ensuite, récupérez les tranches dans 50 millilitres de liquide céphalorachidien artificiel oxygéné. Et conservez-les en solution jusqu’à 30 minutes à température ambiante.Après récupération, transférer les tranches dans une boîte de Petri de 35 par 10 millimètres avec cinq millimètres de tampon respiratoire. À l’aide d’un poinçon de biopsie en acier inoxydable, créez un morceau de tissu circulaire dans la zone souhaitée du cerveau tranché en appuyant doucement sur le poinçon tout en gardant la tranche dans le tampon. Ensuite, retirez le reste du tissu, soulevez le poinçon et retirez le morceau de tissu circulaire dans le tampon.Ensuite, coupez l’extrémité même d’une pointe de pipette d’un millilitre pour faire un trou d’un diamètre d’un point cinq à deux points zéro millimètre et utilisez-le pour maintenir et transférer la tranche perforée vers le haut de l’écran de capture. Aspirez un morceau de tissu cérébral perforé et placez soigneusement le tissu sur le côté maillé de l’écran de capture, un morceau de plastique circulaire avec le maillage attaché d’un côté. À l’aide d’un mouchoir en papier, séchez doucement l’écran de capture et éliminez l’humidité, ce qui permet au tissu de devenir collant et attaché au centre du maillage.Ensuite, maintenez l’écran de capture côté tranche vers le bas avec une pince à épiler et placez-le dans l’un des puits de la plaque d’œillets en incubation. Ensuite, incubez la plaque d’œillets à 37 degrés Celsius dans un incubateur pendant au moins 30 minutes pour permettre l’équilibrage de la température et du pH avant d’exécuter le test. Diluer les composés souhaités et le liquide céphalorachidien artificiel modifié sans BSA jusqu’à la concentration finale en stock de la concentration de travail pour les ports A à D, respectivement.Préchargez doucement 75 microlitres des composés dilués dans les orifices d’injection appropriés de la cartouche de capteur en plaçant les pointes à mi-chemin dans les orifices d’injection à un angle de 45 degrés avec la pointe contre la paroi de l’orifice d’injection, car une insertion complète peut provoquer une fuite de composé à travers le port. Ensuite, retirez soigneusement les embouts des orifices sans créer de bulles d’air et ne touchez aucune partie de la cartouche pour éviter d’atténuer les bulles d’air. Ensuite, inspectez visuellement les orifices d’injection pour un chargement uniforme en vous assurant que tout le liquide est dans le port et qu’aucune goutte résiduelle n’est présente sur le dessus de la cartouche.Après avoir placé la cartouche du capteur sur la plaque utilitaire, placez-la dans un incubateur pendant 30 minutes pour lui permettre de chauffer jusqu’à 37 degrés Celsius tout en la manipulant avec précaution en ne tenant que la plaque utilitaire et en la déplaçant le moins possible. Chargez d’abord le modèle de test dans le logiciel, puis appuyez sur le bouton de démarrage vert. Chargez ensuite la cartouche de capteur sur la plaque utilitaire dans le plateau d’instruments, en vous assurant que la plaque est correctement assise et à plat, en chargeant la cartouche de capteur remplie de médicament dans l’analyseur pour étalonnage.Ensuite, suivez les instructions à l’écran afin de calibrer. Et équilibrez les capteurs. Une fois l’étape d’équilibrage terminée, retirez la plaque d’étalonnage et remplacez-la par la plaque d’œillet contenant le maillage et les tranches de tissu.Ensuite, mesurez le taux de consommation d’oxygène dans chaque puits de la plaque, en utilisant les protocoles de dosage décrits dans le manuscrit. Ensuite, analysez les données de mesure du taux de consommation d’oxygène et les données d’efficacité du couplage. Les taux de consommation d’oxygène pour différentes épaisseurs et tailles de poinçonnage des tranches du groupe témoin ont montré une respiration basale stable sur l’ensemble de la mesure et étaient proportionnels au volume de la tranche.De plus, les taux de consommation d’oxygène ont été relativement stables pendant cinq heures avec moins de 10 % de réduction. L’efficacité du couplage mitochondrial a été comparée et la tranche à l’épaisseur de 150 micromètres et à une taille de poinçon de 1,5 millimètre a montré l’efficacité de couplage la plus élevée. Les taux de consommation d’oxygène ont été mesurés pour les groupes jeunes et âgés de Pink1 knockout et leurs souris de type sauvage appariées selon l’âge.Le taux de consommation basale d’oxygène était similaire dans les groupes knockout et wild-type pour les jeunes souris. Cependant, il a diminué pour les souris knock-out dans l’ancien groupe. Cependant, le dysfonctionnement mitochondrial chez les souris knockout a été observé pour le groupe d’âge jeune, indiqué par la diminution de l’efficacité du couplage causée par le knockout de Pink1.Les étapes critiques de ce protocole comprennent la préparation des tranches de cerveau, leur transfert en haut de l’écran de capture, le placement des diapositives dans les puits et leur maintien attachés à l’écran de capture pendant les mesures.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Préparation des coupes d&#39;hippocampe aiguë chez des rats et des souris transgéniques pour l&#39;étude des altérations synaptiques au cours du vieillissement et de l&#39;amylose pathologie

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Recherche

Neurosciences

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Dynamique présynaptique de la dopamine dans le striatum avec des tranches de cerveau de voltampérométrie cyclique à balayage rapide

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur souris adultes

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Préparation des tranches aiguës zone sous-ventriculaire pour l&#39;imagerie calcique

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imagerie intracellulaire de Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux dans Striatale astrocytes de souris adultes utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Enquête de Synaptic étiquetage / capture et de la Croix-capture à l&#39;aide aiguë coupes d&#39;hippocampe des rongeurs

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Préparation tranches rétiniennes fraîches de poisson-zèbre adulte pour Ex Vivo des expériences d’imagerie

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Évaluation de l'induction à long terme de dépression dans les tranches de cérévelateur adultes

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Indicateurs synapses uniques de la libération et de l’absorption des glutamates dans les tranches cérébrales aigues des souris normales et huntingtones