Name: measurement of oxygen consumption rate in acute striatal slices from adult mice
Uploaded: 2022-06-08T12:40:00
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Wir danken Wangchen Tsering und Pamela Walter für ihre kritische Lektüre und Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 bis C.J. L. und NS098393 bis H.Z.) und dem Department of Neuroscience der Thomas Jefferson University (Startup Funds to H.Z.) unterstützt.

Alle Verfahren, einschließlich der Tierarbeit, wurden nach nationalen und internationalen Richtlinien durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee der Thomas Jefferson University genehmigt. Männliche FVB/NTac-Mäuse im Alter von 3 bis 14 Monaten wurden verwendet. Die folgenden Schritte wurden in einer nicht sterilen Umgebung durchgeführt, aber Vorsicht ist geboten, um alles so sauber wie möglich zu halten.
HINWEIS: Die hier vorgestellte Methode wurde in der von Zhi et <sup class="xr...

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	<li>Hauser, D. N., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+Parkinson's+disease+and+monogenic+parkinsonism.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism.</a> Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).</li><li>Swerdlow, R. 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M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+expression+of+Parkinson's+disease-related+mitochondrial+abnormalities+in+PINK1+knockout+rats.">Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats.</a> Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).</li><li>Morais, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1+loss-of-function+mutations+affect+mitochondrial+complex+I+activity+via+NdufA10+ubiquinone+uncoupling.">PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling.</a> Science. 344 (6180), 203-207 (2014).</li><li>Morais, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease+mutations+in+PINK1+result+in+decreased+Complex+I+activity+and+deficient+synaptic+function.">Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function.</a> EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).</li><li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements.">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li><li>Ferrick, D. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+assay+for+respiration+in+isolated+brain+microvessels+reveals+impaired+mitochondrial+function+in+the+aged+mice.">A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice.</a> Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).</li><li>Schuh, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+microplate-based+respirometry+for+hippocampal+slices+and+analysis+of+respiratory+capacity.">Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity.</a> Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).</li><li>Zhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PINK1+causes+age-dependent+decrease+of+dopamine+release+and+mitochondrial+dysfunction.">Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction.</a> Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).</li><li>Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mitochondrial+analysis+in+acute+brain+sections+from+adult+rats+reveals+mitochondrial+dysfunction+in+a+rat+model+of+migraine.">Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).</li><li>Qi, G., Mi, Y., Yin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+brain+metabolic+function+ex+vivo+with+acute+mouse+slice+punches.">Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).</li><li>Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assessing+tissue+respiration+in+anatomically+defined+brain+regions.">A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).</li></ol>

Die von uns entwickelte Methode ermöglichte die Verwendung eines XF-Analysators zur Messung der OCR in striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen über einen Zeitraum von 4 h. Diese Methode bietet eine neue Möglichkeit, zelluläre Bioenergetik in Stempeln zu messen, die aus anatomisch definierten Gehirnstrukturen herausgeschnitten wurden. Da die analysierten Gewebeproben eher klein sind, können die Stoffwechselparameter bestimmter Hirnareale, die an einer Krankheit beteiligt sind, untersucht werden. Darüber hinaus ...

Mitochondriale Dysfunktion wurde mit mehreren neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Parkinson-Krankheit (PD), Huntington-Krankheit und Alzheimer-Krankheit 1,2,3. PD-Modelle wie PINK1 Knockout (KO) Mäuse und Ratten zeigen eine beeinträchtigte mitochondriale Funktion 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitochondrien, die aus dem Striatum (STR) oder dem ganzen Gehirn der gealterten PINK1 KO-Maus isoliert wurden, weisen Defekte im Komplex I 7,10,12,13 auf. Die direkte Messung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) ist eine der gebräuchlichsten Methoden zur Bewertung der mitochondrialen Funktion, da die OCR mit der ATP-Produktion, der Hauptfunktion der Mitochondrien14, gekoppelt ist. Daher kann die Messung der OCR in Krankheitsmodellen oder von Patienten abgeleiteten Proben / Geweben helfen zu untersuchen, wie mitochondriale Dysfunktion zu Krankheiten führt.
Derzeit gibt es mehrere Möglichkeiten, die mitochondriale OCR zu messen, einschließlich der Clark-Elektrode und anderer O2-Elektroden, desO2-Fluoreszenzfarbstoffs und des extrazellulären Flussanalysators 15,16,17,18,19. Als Vorteil ermöglichen O2-Elektroden-basierte Verfahren die einfache Zugabe verschiedener Substrate. Sie reichen jedoch nicht aus, um mehrere Proben gleichzeitig zu messen. Im Vergleich zu herkömmlichen O2-Elektroden-basierten Methoden bietet der extrazelluläre Flussanalysator, ein häufig verwendetes Werkzeug für OCR in Zellkulturen oder gereinigten Mitochondrien, einen verbesserten Durchsatz15,18,20. Dennoch werden alle diese Methoden in der Regel angewendet, um OCR in isolierten Mitochondrien oder Zellkulturen 6,16,17,19,20,21 zu messen. Die Isolierung von Mitochondrien verursacht unbeabsichtigte Schäden, und extrahierte Mitochondrien oder Zellkulturen sind physiologisch weniger relevant als intakte Hirnschnitte22. Selbst wenn Mikroelektroden in Schnitten verwendet werden, sind sie weniger empfindlich und schwieriger zu bedienen als in kultivierten Zellen23.
Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir mit dem XF24 extrazellulären Flussanalysator eine Methode entwickelt, die die Analyse mehrerer Stoffwechselparameter aus akuten striatalen Hirnschnitten von Mäusen24 ermöglicht. Diese Technik ermöglicht eine kontinuierliche direkte Quantifizierung der mitochondrialen Atmung über die OCR. Kurz gesagt, kleine Abschnitte von striatalen Hirnschnitten werden in Vertiefungen der Inselplatte platziert, und der Analysator verwendet Sauerstoff- und Protonenfluoreszenz-basierte Biosensoren, um die OCR und die extrazelluläre Versauerungsrate zu messen, bzw. 17,21,25.
Eines der einzigartigen Merkmale des Analysators sind die vier Injektionsquellen, die die kontinuierliche Messung der OCR ermöglichen, während nacheinander bis zu vier Verbindungen oder Reagenzien injiziert werden; Dies ermöglicht die Messung mehrerer zellulärer Atmungsparameter, wie z. B. basale mitochondriale OCR, ATP-verknüpfte OCR und maximale mitochondriale OCR. Die Verbindungen, die während der Messungen für das hier gezeigte Protokoll injiziert wurden, waren Arbeitskonzentrationen von 10 mM Pyruvat in der ersten Lösungsvertiefung (Port A), 20 μM Oligomycin in der zweiten Lösungsvertiefung (Port B), 10 μM Carbonylcyanid 4-(Trifluormethoxy) Phenylhydrazon (FCCP) in der dritten Vertiefung (Port C) und 20 μM Antimycin A in der vierten Vertiefung (Port D), basierend auf Fried et al.25. Es muss beachtet werden, dass diese Konzentrationen Arbeitskonzentrationen waren, und Stammlösungen von 10x, 11x, 12x und 13x wurden in die Lösungsports A bis D injiziert. Der Zweck der Verwendung jeder Lösung war wie folgt: 1) Pyruvat war notwendig, da ohne es die Zugabe von FCCP eine verringerte OCR-Reaktion hätte, die durch eine Einschränkung der verfügbaren Substrate verursacht wurde; 2) Oligomycin hemmt die ATP-Synthase und ermöglicht die Messung der ATP-verknüpften Atmung; 3) FCCP entkoppelt die Oxidation von der Phosphorylierung und ermöglicht die Messung der maximalen mitochondrialen Kapazität; 4) Antimycin A hemmt den Komplex III in der Elektronentransportkette und ermöglicht daher die Messung von OCR, die nicht mit den Mitochondrien verbunden sind.
Die verwendete Konzentration von Oligomycin wurde aus folgenden Gründen bestimmt: 1) Die empfohlene Dosis von Oligomycin für die meisten Zelltypen (isolierte Mitochondrien oder Zellkulturen) beträgt 1,5 μM. Aus Erfahrung wird normalerweise 3x-10x der dissoziierten Zelldosis für die Scheibenexperimente verwendet, da es einen Gradienten geben kann und das Eindringen von Lösung in die Scheiben Zeit in Anspruch nimmt. Daher sollte die Konzentration im Bereich von 5 μM bis 25 μM liegen. 2) Basierend auf Fried et al.25 wurde eine Konzentration von 20 μM ausgewählt. Höhere Konzentrationen wurden aufgrund der unspezifischen Toxizität von Oligomycin nicht ausprobiert. 3) In dem Bericht von Underwood et al.26 führten die Autoren ein Titrationsexperiment für Oligomycin durch und fanden heraus, dass Dosen bei 6,25, 12,5, 25 und 50 μg / ml zu einer ähnlichen Hemmung führten. Die höhere Konzentration von Oligomycin (50 μg/ml) hemmte nicht mehr, hatte aber eine größere Varianz. 4) Nach unserer Beobachtung scheint der bestimmende Faktor die Durchdringungsfähigkeit von Oligomycin zu sein. Es ist schwierig für Oligomycin, das Gewebe zu durchdringen, und deshalb dauert es mindestens 7 bis 8 Zyklen, um das Plateau, die maximale Reaktion, zu erreichen. Solange es das Plateau erreicht, wird die Hemmung als maximal angenommen.
Eine zentrale technische Herausforderung bei der Anpassung des extrazellulären Flussanalysators zur Messung der OCR in striatalen Schnitten besteht darin, Gewebehypoxie zu verhindern. Da der Puffer während der gesamten Messdauer (ca. 4 h) nicht mit Sauerstoff angereichert war, war die Hypoxie ein zentrales Thema. Dies gilt insbesondere für dickere Gewebeproben, bei denen Sauerstoff nicht durch die Proben diffundieren kann. Um dieses Problem zu lösen, wurden Scheiben mit einer Dicke von 150 μm geschnitten, so dass Umgebungssauerstoff die Mitte der Gehirnscheiben durchdringen konnte. Darüber hinaus wurden 4 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) dem voroxygenierten Puffer der künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) zugesetzt, was die Bestimmung der maximalen OCR erleichterte, wie zuvor vorgeschlagen23. Wir untersuchten, ob Zellen am Leben waren. Zunächst wurden Hoechst 33258 (10 μM) und Propidiumiodid (10 μM) verwendet, um zu untersuchen, ob Zellen unter diesen Bedingungen gesund sind. Wir untersuchten dann, ob mittelstachelige Neuronen funktionell gesund waren, indem wir Patch-Clamp-Recording verwendeten. Wir bewerteten weiter, ob Dopamin (DA) -Terminals in den striatalen Scheiben funktionell gesund waren, indem wir die DA-Freisetzung mittels Fast-Scan-Voltammetrie maßen. Die Ergebnisse zeigten, dass striatale Scheiben, die nicht mit Sauerstoff angereichert waren (ACSF/BSA-Gruppe), genauso gesund waren wie die sauerstoffhaltige Kontrollgruppe24.
Anschließend testeten wir verschiedene Kombinationen von Schichtdicke und Stanzgröße, um optimale striatale Schichtbedingungen für den Flussmittel-Atmungsassay zu bestimmen. Für die OCR-Analyse mit dem Analysator wurden dorsale Striatalscheiben mit unterschiedlichen Dicken (150 μm und 200 μm) und Stanzgrößen (1,0 mm, 1,5 mm und 2,0 mm Durchmesser) verwendet. Striatalscheiben, die 150 μm dick waren und eine Stanzgröße von 1,5 mm Durchmesser hatten, hatten die höchste Kopplungseffizienz und OCRs in einem optimalen Bereich für den Analysator24.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Accumet AB150 pH benchtop meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB150</td>
			<td>To measure pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A8674</td>
			<td>To inhibit complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6003</td>
			<td>To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2920</td>
			<td>To uncouple mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>To dissovle compounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H3375</td>
			<td>To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified non-CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-683-230D</td>
			<td>To hydrate plates at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>O4876</td>
			<td>To inhibit mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td>sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3616</td>
			<td>To inhibit complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103681-100</td>
			<td>Solution for seahorse calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 FluxPaks</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>101174-100</td>
			<td>Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens,&#160; calibrant solution and calibration plates; assay kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2256</td>
			<td>To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel biopsy punches</td>
			<td>Miltex</td>
			<td></td>
			<td>Device used to punch slices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Eppendrof</td>
			<td>0030700102</td>
			<td>Used for slice punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>To slice brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific Precision</td>
			<td>282-115</td>
			<td>To heat buffer and solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rate in acute striatal slices from adult mice

Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle bei der zellulären ATP-Produktion, der reaktiven Regulierung der Sauerstoffspezies und der Ca2 + - Konzentrationskontrolle. Mitochondriale Dysfunktion wurde mit der Pathogenese mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich der Parkinson-Krankheit (PD), der Huntington-Krankheit und der Alzheimer-Krankheit. Um die Rolle der Mitochondrien in Modellen dieser Krankheiten zu untersuchen, können wir die mitochondriale Atmung über die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) als Proxy für die mitochondriale Funktion messen. OCR wurde bereits erfolgreich in Zellkulturen sowie isolierten Mitochondrien gemessen. Diese Techniken sind jedoch physiologisch weniger relevant als die Messung der OCR in akuten Hirnschnitten. Um diese Einschränkung zu überwinden, entwickelten die Autoren eine neue Methode mit einem Seahorse XF-Analysator, um die OCR in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen direkt zu messen. Die Technik ist optimiert mit einem Fokus auf das Striatum, ein Gehirnareal, das an PD und der Huntington-Krankheit beteiligt ist. Der Analysator führt einen Live-Cell-Assay mit einer 24-Well-Platte durch, der die gleichzeitige kinetische Messung von 24 Proben ermöglicht. Die Methode verwendet kreisförmig gestanzte Stücke von striatalen Hirnschnitten als Proben. Wir demonstrieren die Wirksamkeit dieser Technik, indem wir eine niedrigere basale OCR in striatalen Schnitten eines Mausmodells von PD identifizieren. Diese Methode wird für Forscher, die auf dem Gebiet der PD und der Huntington-Krankheit arbeiten, von großem Interesse sein.

Der erste Schritt dieser Studie bestand darin, die Schichtdicke und die Stanzgröße zu optimieren, die verwendet wurden, um einen Abschnitt des Striatums aus der Scheibe zu entfernen (Abbildung 3A). Eine Scheibe mit einer Dicke von 150 μm und einer Stanzgröße von 1,5 mm lieferte die besten Ergebnisse, die durch die Kopplungseffizienz bestimmt wurden (Abbildung 3B-C). Wie in Abbildung 3B gezeigt,...

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Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice

Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) ist ein gängiger Proxy für die mitochondriale Funktion und kann zur Untersuchung verschiedener Krankheitsmodelle verwendet werden. Wir haben eine neue Methode entwickelt, die einen Seahorse XF-Analysator verwendet, um die OCR in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen direkt zu messen, die physiologisch relevanter ist als andere Methoden.

Messung des Sauerstoffverbrauchs in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen

Mitochondria play an important role in cellular ATP production, reactive oxygen species regulation, and Ca2+ concentration control. Mitochondrial ...

Wir haben eine neue Methode entwickelt, bei der wir einen XF-Analysator für Seepferdchen verwenden, um den Sauerstoffverbrauch direkt zu messen. Aber gemeinsamer Proxy für die mitochondriale Funktion in akutem Objektträgerschnitt von erwachsenen Mäusen. Diese Methode misst eine Zelle durch Energetik in Punktionen von anatomisch definierten Gehirnstrukturen.Die Verwendung akuter Scheiben ahmt die physiologische zelluläre Umgebung genauer nach, was nicht auf die Weise erreicht werden kann, wie mitochondriale oder Kulturzellen isoliert werden. Diese Methode wird für Forscher, die auf dem Gebiet der Parkinson-Krankheit und der Huntington-Krankheit arbeiten, von großem Interesse sein. Öffnen Sie zunächst das extrazelluläre Flussmittel-Assay-Kit und entfernen Sie sowohl die Sensorkassette als auch die Utility-Platte.Legen Sie dann die Sensorkassette beiseite und berühren Sie die Sensoren nicht. Als nächstes fügen Sie 600 Mikroliter kalibrierte Lösung zu jeder Wand der Versorgungsplatte hinzu. Legen Sie die Sensorkassette auf die Gebrauchsplatte und tauchen Sie die Sensoren in die Kalibrierlösung, um sicherzustellen, dass die dreieckige Kerbe der Versorgungs- und Sensorpatronenplatte korrekt ausgerichtet ist.Verschließen Sie anschließend das extrazelluläre Flussmittel-Assay-Kit mit Dichtungsfolie, um eine Verdunstung der kalibrierten Lösung zu verhindern, und legen Sie es dann über Nacht in einen 37 Grad Celsius-Inkubator, der nicht mit Kohlendioxid oder Sauerstoff ergänzt wurde. Öffnen Sie die Ösenfänger-Mikroplatte und nehmen Sie die Ösenplatte für das Gewebesitzen heraus. Erwärmen Sie dann ein geeignetes Volumen des voroxygenierten modifizierten künstlichen Rückenmarksflüssigkeitspuffers in einem 50-Milliliter-Schlauch auf 37 Grad Celsius.Als nächstes fügen Sie BSA zu einer Endkonzentration von vier Milligramm pro Milliliter hinzu, um den Atempuffer vorzubereiten. Fügen Sie 625 Mikroliter Atempuffer vorsichtig zu jedem Vertiefungsraum der Ösenplatte hinzu, während Sie ein Schütteln der Platte vermeiden, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen im Puffer jedes Brunnens vorhanden sind. Sezieren Sie das Gehirn sofort in 10 Milliliter eiskalter voroxygenierter Schneidlösung.Dann mit einem Vibratomabschnitt koronale Striatalscheiben, nach den Anweisungen des Herstellers bei einer Dicke von 150 Mikrometer in eiskalter voroxygenierter Schneidlösung. Als nächstes gewinnen Sie die Scheiben in 50 Millilitern sauerstoffhaltiger künstlicher Gehirnrückenmarksflüssigkeit zurück. Und bewahren Sie sie bis zu 30 Minuten bei Raumtemperatur in Lösung auf.Nach der Gewinnung die Scheiben in eine 35 x 10 Millimeter große Petrischale mit fünf Millimetern Atempuffer geben. Mit einem Edelstahl-Biopsiestempel erzeugen Sie ein kreisförmiges Stück Gewebe im gewünschten Bereich des geschnittenen Gehirns, indem Sie den Stempel vorsichtig nach unten drücken, während Sie die Scheibe im Puffer halten. Entfernen Sie dann den Rest des Gewebes, heben Sie den Schlag weg und entfernen Sie das kreisförmige Stück Gewebe in den Puffer.Als nächstes schneiden Sie das Ende einer Pipettenspitze von einem Milliliter ab, um ein Loch mit einem Durchmesser von einem Punkt fünf bis zwei Punkt null Millimeter zu machen, und verwenden Sie es, um die gestanzte Scheibe zu halten und an die Oberseite des Aufnahmebildschirms zu übertragen. Saugen Sie ein Stück gestanztes Hirngewebe ab und legen Sie das Gewebe vorsichtig auf die Netzseite des Aufnahmebildschirms, ein kreisförmiges Stück Kunststoff, an dem das Netz an einer Seite befestigt ist. Trocknen Sie den Fangschirm mit einem Papiertaschentuch vorsichtig ab und entfernen Sie die Feuchtigkeit, wodurch das Gewebe klebrig wird und an der Mitte des Netzes befestigt wird.Als nächstes halten Sie die Capture-Screen-Scheibe mit einer Pinzette nach unten und legen Sie sie in eine der Vertiefungen der Inkubationsösenplatte. Inkubieren Sie dann die Ösenplatte bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator für mindestens 30 Minuten, um ein Gleichgewicht zwischen Temperatur und pH-Wert zu ermöglichen, bevor Sie den Assay durchführen. Verdünnen Sie die gewünschten Verbindungen und modifizierten künstlichen zerebralen Rückenmarksflüssigkeiten ohne BSA auf die endgültige Stammkonzentration der Arbeitskonzentration für die Ports A bzw. D.Ziehen Sie 75 Mikroliter der verdünnten Verbindungen vorsichtig in die entsprechenden Einspritzanschlüsse der Sensorkartusche vor, indem Sie die Spitzen in einem Winkel von 45 Grad zur Hälfte in die Einspritzöffnungen mit der Spitze an der Wand des Einspritzanschlusses platzieren, da ein vollständiges Einsetzen zu einem Auslaufen von Verbindungen durch den Anschluss führen kann. Ziehen Sie anschließend die Spitzen vorsichtig aus den Anschlüssen heraus, ohne Luftblasen zu erzeugen, und tippen Sie nicht auf einen Teil der Patrone, um Luftblasen nicht zu lindern. Überprüfen Sie dann visuell die Einspritzöffnungen auf gleichmäßiges Laden, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Flüssigkeit im Anschluss befindet und keine Resttropfen auf der Oberseite der Patrone vorhanden sind.Nachdem Sie die Sensorpatrone auf die Gebrauchsplatte gelegt haben, legen Sie sie für 30 Minuten in einen Inkubator, damit sie sich bei vorsichtiger Handhabung auf 37 Grad Celsius erwärmen kann, indem Sie sie nur auf der Gebrauchsplatte festhalten und so wenig wie möglich bewegen. Laden Sie zuerst die Assay-Vorlage in die Software und drücken Sie dann den grünen Startknopf. Legen Sie dann die Sensorpatrone auf der Gebrauchsplatte in das Instrumentenfach ein, stellen Sie sicher, dass die Platte korrekt sitzt und flach ist, und laden Sie die mit Medikamenten gefüllte Sensorpatrone zur Kalibrierung in den Analysator.Folgen Sie anschließend den Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Kalibrierung durchzuführen. Und die Sensoren ausgleichen. Sobald der Balanceschritt abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kalibrierplatte und ersetzen Sie sie durch die Ösenplatte, die das Netz und die Gewebescheiben enthält.Messen Sie dann die Sauerstoffverbrauchsrate in jeder Vertiefung der Platte unter Verwendung der Assay-Protokolle, wie im Manuskript beschrieben. Anschließend analysieren Sie die Messdaten der Sauerstoffverbrauchsrate und die Daten zum Kopplungswirkungsgrad. Die Sauerstoffverbrauchsraten für verschiedene Dicken und Stanzgrößen von Scheiben in der Kontrollgruppe zeigten eine stabile Basalatmung über die gesamte Messung und waren proportional zum Volumen der Scheibe.Darüber hinaus waren die Sauerstoffverbrauchsraten für fünf Stunden relativ stabil mit weniger als 10% Abbau. Der mitochondriale Kopplungswirkungsgrad wurde verglichen und die Scheibe bei der Dicke von 150 Mikrometern und einer Stanzgröße von 1,5 Millimetern zeigte die höchste Kopplungseffizienz. Die Sauerstoffverbrauchsraten wurden für junge und alte Gruppen von Pink1-Knockout und ihre altersangepassten Wildtyp-Mäuse gemessen.Die basale Sauerstoffverbrauchsrate war sowohl in der Knockout- als auch in der Wildtyp-Gruppe für junge Mäuse ähnlich. Es nahm jedoch für die Knockout-Mäuse in der alten Gruppe ab. Die mitochondriale Dysfunktion bei den Knockout-Mäusen wurde jedoch für die junge Altersgruppe beobachtet, was auf die verminderte Kopplungseffizienz durch den Knockout von Pink1 hindeutet.Zu den kritischen Schritten in diesem Protokoll gehören die Vorbereitung von Gehirnschnitten, die Übertragung auf die Oberseite des Erfassungsbildschirms, das Platzieren von Objektträgern in Vertiefungen und das Aufbewahren am Erfassungsbildschirm während der Messungen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Präsynaptische Dynamics in striatalen Hirnschnitten mit Fast-Scan-Cyclovoltammetrie

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Abbildungsintrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Untersuchung von Synaptic Tagging / Erfassung und Lang Capture mit akuten Schnitten des Hippocampus von Nagetiere

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Zubereitung frische retinalen Scheiben von Erwachsenen Zebrafisch für Ex Vivo Imaging-Experimente

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...