Name: measurement of oxygen consumption rate in acute striatal slices from adult mice
Uploaded: 2022-06-08T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice at JoVE.com

우리는 Wangchen Tsering과 Pamela Walter가이 원고를 비판적으로 읽고 편집 한 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773에서 C.J. L., NS098393에서 H.Z.까지)와 Thomas Jefferson University의 신경 과학과 (Startup Funds to H.Z.)의 지원을 받았습니다.

동물 작업을 포함한 모든 절차는 국내 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 토마스 제퍼슨 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 3 내지 14개월의 나이에 수컷 FVB/NTac 마우스를 사용하였다. 다음 단계는 멸균되지 않은 환경에서 수행되었지만 가능한 한 모든 것을 깨끗하게 유지하도록주의해야합니다.
참고 : 여기에 제시된 방법은 Zhi et al.24에 ?...

<ol>
	<li>Hauser, D. N., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+Parkinson's+disease+and+monogenic+parkinsonism.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism.</a> Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).</li><li>Swerdlow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+mitochondrial+cascades+in+Alzheimer's+disease.">Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).</li><li>Lou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+consumption+deficit+in+Huntington+disease+mouse+brain+under+metabolic+stress.">Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress.</a> Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).</li><li>Amo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+decrease+caused+by+loss+of+PINK1+is+not+due+to+proton+leak,+but+to+respiratory+chain+defects.">Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects.</a> Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).</li><li>Clark, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+pink1+is+required+for+mitochondrial+function+and+interacts+genetically+with+parkin.">Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).</li><li>Cooper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+rescue+of+mitochondrial+deficits+in+iPSC-derived+neural+cells+from+patients+with+familial+Parkinson's+disease.">Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease.</a> Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).</li><li>Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PINK1+causes+mitochondrial+functional+defects+and+increased+sensitivity+to+oxidative+stress.">Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).</li><li>Gispert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+phenotype+in+aged+PINK1-deficient+mice+is+accompanied+by+progressive+mitochondrial+dysfunction+in+absence+of+neurodegeneration.">Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration.</a> PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).</li><li>Heeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+PINK1+affects+mitochondrial+metabolism,+calcium+homeostasis+and+energy+maintenance.">Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance.</a> Journal of Cell Science. 124, 1115-1125 (2011).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pink1+regulates+the+oxidative+phosphorylation+machinery+via+mitochondrial+fission.">Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).</li><li>Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+expression+of+Parkinson's+disease-related+mitochondrial+abnormalities+in+PINK1+knockout+rats.">Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats.</a> Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).</li><li>Morais, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1+loss-of-function+mutations+affect+mitochondrial+complex+I+activity+via+NdufA10+ubiquinone+uncoupling.">PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling.</a> Science. 344 (6180), 203-207 (2014).</li><li>Morais, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease+mutations+in+PINK1+result+in+decreased+Complex+I+activity+and+deficient+synaptic+function.">Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function.</a> EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).</li><li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements.">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li><li>Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+measuring+cellular+bioenergetics+using+extracellular+flux.">Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux.</a> Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).</li><li>Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+respiration+and+bioenergetic+status+of+mitochondria+in+primary+cerebellar+granule+neuronal+cultures+exposed+continuously+to+glutamate.">In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells,+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells.">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).</li><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+self-referencing+oxygen-selective+microelectrode:+detection+of+transmembrane+oxygen+flux+from+single+cells.">The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells.</a> TheJournal of Experimental Biology. 202, 211-218 (1999).</li><li>Sure, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+assay+for+respiration+in+isolated+brain+microvessels+reveals+impaired+mitochondrial+function+in+the+aged+mice.">A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice.</a> Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).</li><li>Schuh, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+microplate-based+respirometry+for+hippocampal+slices+and+analysis+of+respiratory+capacity.">Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity.</a> Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).</li><li>Zhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PINK1+causes+age-dependent+decrease+of+dopamine+release+and+mitochondrial+dysfunction.">Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction.</a> Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).</li><li>Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mitochondrial+analysis+in+acute+brain+sections+from+adult+rats+reveals+mitochondrial+dysfunction+in+a+rat+model+of+migraine.">Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).</li><li>Qi, G., Mi, Y., Yin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+brain+metabolic+function+ex+vivo+with+acute+mouse+slice+punches.">Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).</li><li>Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assessing+tissue+respiration+in+anatomically+defined+brain+regions.">A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).</li></ol>

우리가 개발 한 방법을 사용하면 XF 분석기를 사용하여 4 시간의 시간 동안 성인 마우스의 줄무늬 조각에서 OCR을 측정 할 수있었습니다. 이 방법은 해부학적으로 정의 된 뇌 구조에서 절제 된 펀치에서 세포 생물 에너지를 측정하는 새로운 방법을 제공합니다. 분석되는 조직 샘플이 다소 작기 때문에 질병에 관련된 특정 뇌 영역의 대사 매개 변수를 조사 할 수 있습니다. 또한, 급성 슬라이스를 사?...

미토콘드리아 기능 장애는 파킨슨 병 (PD), 헌팅턴 병 및 알츠하이머 병 1,2,3을 포함한 여러 신경 질환에 연루되어 있습니다. PINK1 녹아웃 (KO) 마우스 및 래트와 같은 PD 모델은 손상된 미토콘드리아 기능 4,5,6,7,8,9,10,11을 나타낸다. 노화된 PINK1 KO 마우스의 선조체(STR) 또는 전뇌로부터 분리된 미토콘드리아는 복합체 I 7,10,12,13에서 결함을 나타낸다. 산소 소모율(OCR)을 직접 측정하는 것은 OCR이 미토콘드리아(14)의 주요 기능인 ATP 생산과 결합되기 때문에 미토콘드리아 기능을 평가하는 가장 일반적인 방법 중 하나이다. 따라서 질병 모델 또는 환자 유래 샘플 / 조직에서 OCR을 측정하면 미토콘드리아 기능 장애가 어떻게 질병으로 이어지는지 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.
현재, 클라크 전극 및 다른 O2 전극,O2 형광 염료, 및 세포외 플럭스 분석기 15,16,17,18,19를 포함하는 미토콘드리아 OCR을 측정하는 몇 가지 방법이 있다. 이점으로서,O2 전극-기반 방법은 다양한 기판이 용이하게 첨가될 수 있게 한다. 그러나 여러 샘플을 동시에 측정하기에는 충분하지 않습니다. 전통적인O2 전극 기반 방법과 비교할 때, 세포 배양 또는 정제 된 미토콘드리아에서 OCR에 일반적으로 사용되는 도구 인 세포 외 플럭스 분석기는 향상된 처리량 15,18,20을 제공합니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 모든 방법은 단리된 미토콘드리아 또는 세포 배양물6,16,17,19,20,21에서 OCR을 측정하기 위해 일반적으로 적용된다. 미토콘드리아의 분리는 의도하지 않은 손상을 일으키고, 추출된 미토콘드리아 또는 세포 배양물은 온전한 뇌 조각(22)보다 생리학적으로 덜 관련된다. 미세전극이 슬라이스에 사용되는 경우에도, 이들은 배양된 세포(23)에서보다 덜 민감하고 작동하기가 더 어렵다.
이러한 도전들을 충족시키기 위해, 우리는 XF24 세포외 플럭스 분석기를 사용하는 방법을 개발했는데, 이는 마우스(24)의 급성 삼중항 뇌 조각으로부터의 다중 대사 파라미터의 분석을 가능하게 한다. 이 기술은 OCR을 통해 미토콘드리아 호흡의 지속적인 직접 정량화를 제공합니다. 간단히 말해서, 삼중 뇌 조각의 작은 부분은 췌도 판의 우물에 배치되며, 분석기는 산소 및 양성자 형광 기반 바이오 센서를 사용하여 OCR 및 세포 외 산성화 속도를 각각17,21,25로 측정합니다.
분석기의 독특한 특징 중 하나는 최대 네 개의 화합물 또는 시약을 순차적으로 주입하면서 OCR을 계속 측정 할 수있는 네 개의 주입 웰입니다. 이것은 기저 미토콘드리아 OCR, ATP 연결 OCR 및 최대 미토콘드리아 OCR과 같은 여러 세포 호흡 파라미터의 측정을 가능하게 한다. 여기에 제시된 프로토콜에 대한 측정 동안 주입된 화합물은 첫 번째 용액 웰(포트 A)에서 10 mM 피루베이트, 두 번째 용액 웰(포트 B)에서 20 μM 올리고마이신, 세 번째 웰(포트 C)에서 10 μM 카보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP), 및 네 번째 웰(포트 D)에서 20 μM 안티마이신 A의 작동 농도를 작동시키고, Fried et al.25에 근거하여. 이들 농도는 작동 농도였고, 10x, 11x, 12x 및 13x의 스톡 용액은 용액 포트 A를 내지 D에 각각 주입하였다는 점에 유의해야 한다. 각 용액을 사용하는 목적은 다음과 같았다: 1) 피루베이트가 없었기 때문에, FCCP의 첨가는 이용가능한 기질의 제한에 의해 야기된 감소된 OCR 반응을 가질 것이기 때문에 필요하였다; 2) 올리고마이신은 ATP 신타제를 억제하고 ATP 연결된 호흡의 측정을 허용한다; 3) FCCP는 인산화로부터 산화를 해제하고 최대 미토콘드리아 용량의 측정을 허용한다; 4) 안티마이신 A는 전자 수송 사슬에서 콤플렉스 III을 억제하고, 따라서, 미토콘드리아에 연결되지 않은 OCR의 측정을 허용한다.
사용된 올리고마이신의 농도는 다음과 같은 이유에 기초하여 결정되었다: 1) 대부분의 세포 유형(단리된 미토콘드리아 또는 세포 배양물)에 대한 올리고마이신의 권장 투여량은 1.5 μM이다. 경험에 비추어 볼 때, 해리 된 세포 용량의 보통 3x-10x는 구배가있을 수 있고 슬라이스 내의 용액의 침투에는 시간이 걸리기 때문에 슬라이스 실험에 사용됩니다. 따라서, 농도는 5 μM 내지 25 μM의 범위이어야 한다. 2) A 20 μM 농도는 Fried et al.25에 기초하여 선택되었다. 더 높은 농도는 올리고마이신의 비특이적 독성으로 인해 시도되지 않았다. 3) Underwood et al.26의 보고서에서 저자들은 올리고마이신에 대한 적정 실험을 수행했으며 6.25, 12.5, 25 및 50 μg / mL의 용량이 유사한 억제를 초래한다는 것을 발견했습니다. 올리고마이신 농도가 높을수록 (50 μg/mL) 더 많이 억제되지는 않았지만 더 큰 차이가 있었다. 4) 우리의 관찰에서, 결정 인자는 올리고마이신의 침투 능력 인 것으로 보인다. 올리고마이신이 조직에 침투하는 것은 어렵고, 그래서 최대 반응인 고원에 도달하는 데 적어도 7 내지 8 사이클이 걸리는 이유이다. 고원에 도달하는 한, 억제는 최대로 가정된다.
줄무늬 조각에서 OCR을 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 적용하는 주요 기술적 과제는 조직 저산소증을 예방하는 것입니다. 완충액이 측정의 전체 기간 (약 4 시간) 동안 산소화되지 않았기 때문에, 저산소증은 중심 문제였다. 이것은 산소가 샘플 전체에 걸쳐 확산 될 수없는 두꺼운 조직 샘플의 경우 특히 그렇습니다. 이 문제를 극복하기 위해 슬라이스를 150 μm 두께로 절개하여 주변 산소가 뇌 조각의 중간에 침투 할 수 있도록했습니다. 또한, 4 mg / mL 소 혈청 알부민 (BSA)을 사전 산소화 된 인공 뇌척수액 (ACSF) 완충액에 첨가하여 이전에 제안 된 바와 같이 최대 OCR의 결정을 용이하게했습니다23. 우리는 세포가 살아 있는지 여부를 조사했습니다. 먼저, Hoechst 33258 (10 μM) 및 요오드화 프로피듐 (10 μM)을 사용하여 세포가 이러한 조건에서 건강한지 여부를 조사했습니다. 그런 다음 중간 스파이니 뉴런이 패치 클램프 기록을 사용하여 기능적으로 건강한지 여부를 조사했습니다. 우리는 또한 삼중 절편에서 도파민 (DA) 말단이 빠른 스캔 전압전류법을 사용하여 DA 방출을 측정함으로써 기능적으로 건강한지 여부를 평가했습니다. 결과는 산소화되지 않은 줄무늬 조각 (ACSF / BSA 그룹)이 산소화 된 대조군24만큼 건강하다는 것을 보여주었습니다.
그런 다음 슬라이스 두께와 펀치 크기의 다양한 조합을 테스트하여 플럭스 호흡 분석을위한 최적의 스트리아 슬라이스 조건을 결정했습니다. 두께(150 μm 및 200 μm) 및 펀치 크기(직경 1.0 mm, 1.5 mm 및 2.0 mm)가 상이한 Dorsal striatal 슬라이스를 분석기를 사용한 OCR 분석에 사용하였다. 직경 1.5mm의 펀치 크기로 두께가 150μm인 스트리아탈 슬라이스는 분석기(24)에 대해 최적의 범위 내에서 가장 높은 결합 효율 및 OCR을 가졌다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accumet AB150 pH benchtop meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB150</td>
			<td>To measure pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A8674</td>
			<td>To inhibit complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6003</td>
			<td>To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2920</td>
			<td>To uncouple mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>To dissovle compounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H3375</td>
			<td>To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified non-CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-683-230D</td>
			<td>To hydrate plates at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>O4876</td>
			<td>To inhibit mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td>sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3616</td>
			<td>To inhibit complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103681-100</td>
			<td>Solution for seahorse calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 FluxPaks</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>101174-100</td>
			<td>Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens,&#160; calibrant solution and calibration plates; assay kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2256</td>
			<td>To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel biopsy punches</td>
			<td>Miltex</td>
			<td></td>
			<td>Device used to punch slices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Eppendrof</td>
			<td>0030700102</td>
			<td>Used for slice punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>To slice brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific Precision</td>
			<td>282-115</td>
			<td>To heat buffer and solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rate in acute striatal slices from adult mice

미토콘드리아는 세포 ATP 생산, 반응성 산소 종 조절 및Ca2+ 농도 조절에 중요한 역할을 합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 파킨슨 병 (PD), 헌팅턴 병 및 알츠하이머 병을 포함한 여러 신경 퇴행성 질환의 발병기전에 연루되어 있습니다. 이러한 질병의 모델에서 미토콘드리아의 역할을 연구하기 위해, 우리는 미토콘드리아 기능의 대리자로서 산소 소모율 (OCR)을 통해 미토콘드리아 호흡을 측정 할 수 있습니다. OCR은 이미 세포 배양물뿐만 아니라 단리된 미토콘드리아에서도 성공적으로 측정되었다. 그러나 이러한 기술은 급성 뇌 조각에서 OCR을 측정하는 것보다 생리 학적으로 관련성이 적습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 저자들은 Seahorse XF 분석기를 사용하여 성인 마우스의 급성 줄무늬 조각에서 OCR을 직접 측정하는 새로운 방법을 개발했습니다. 이 기술은 PD 및 헌팅턴 병과 관련된 뇌 영역 인 선조체에 중점을두고 최적화되어 있습니다. 분석기는 24웰 플레이트를 사용하여 살아있는 세포 분석을 수행하며, 이를 통해 24개의 샘플에 대한 동시 동역학적 측정이 가능합니다. 이 방법은 원형 펀치 조각의 삼중항 뇌 조각을 샘플로 사용합니다. 우리는 PD의 마우스 모델의 줄무늬 슬라이스에서 더 낮은 기저 OCR을 확인함으로써이 기술의 효과를 입증합니다. 이 방법은 PD 및 헌팅턴 병 분야에서 일하는 연구자들에게 광범위한 관심사가 될 것입니다.

이 연구의 첫 번째 단계는 슬라이스에서 선조체의 섹션을 소비하는 데 사용되는 슬라이스 두께와 펀치 크기를 최적화하는 것이 었습니다 (그림 3A). 150μm 두께의 슬라이스와 1.5mm 펀치 크기로 커플링 효율에 의해 결정된 최상의 결과를 제공했습니다(그림 3B-C). 도 3B에 도시된 바와 같이, OCR은 10% 미만의 런?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice at JoVE.com

Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice

산소 소비율 (OCR)은 미토콘드리아 기능에 대한 일반적인 프록시이며 다른 질병 모델을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 Seahorse XF 분석기를 사용하여 다른 방법보다 생리 학적으로 관련성이 높은 성인 마우스의 급성 줄무늬 조각에서 OCR을 직접 측정하는 새로운 방법을 개발했습니다.

성인 마우스의 급성 스트리아탈 슬라이스의 산소 소비율 측정

Mitochondria play an important role in cellular ATP production, reactive oxygen species regulation, and Ca2+ concentration control. Mitochondrial ...

우리는 해마 XF 분석기를 사용하여 산소 소모율을 직접 측정하는 새로운 방법을 개발했습니다. 그러나 성인 마우스로부터의 급성 슬라이드 슬라이스에서 미토콘드리아 기능에 대한 일반적인 프록시. 이 방법은 해부학적으로 정의 된 뇌 구조에서 펑크에있는 에너지에 의해 세포를 측정합니다.급성 슬라이스를 사용하는 것은 미토콘드리아 또는 배양 세포를 분리하는 방법을 달성할 수 없는 생리학적 세포 환경을 더 밀접하게 모방한다. 이 방법은 파킨슨 병과 헌팅턴 병 분야에서 일하는 연구자들에게 광범위한 관심사가 될 것입니다. 시작하려면 세포외 플럭스 분석 키트를 열고 센서 카트리지와 유틸리티 플레이트를 모두 제거하십시오.그런 다음 센서 카트리지를 따로 놓고 센서를 만지지 마십시오. 그런 다음 유틸리티 플레이트의 각 벽에 600 마이크로 리터의 교정 용액을 추가하십시오. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 위에 놓고 센서를 교정 솔루션에 잠기면 유틸리티와 센서 카트리지 플레이트의 삼각형 노치가 올바르게 정렬되었는지 확인합니다.그 후, 검량액의 증발을 방지하기 위해 세포외 플럭스 분석 키트를 밀봉 필름으로 밀봉한 다음, 이산화탄소 또는 산소가 보충되지 않은 섭씨 37도 배양기에 하룻밤 동안 보관한다. 아일렛 캡처 마이크로 플레이트를 열고 조직 앉기를 위해 아일렛 플레이트를 꺼냅니다. 그런 다음 적절한 부피의 사전 산소화 된 변형 된 인공 뇌척수액 완충액을 50 밀리리터 튜브에서 섭씨 37도까지 따뜻하게하십시오.다음으로 BSA를 밀리리터 당 네 밀리그램의 최종 농도에 첨가하여 호흡 완충액을 준비하십시오. 625 마이크로리터의 호흡 완충액을 아일렛 플레이트의 각 웰에 조심스럽게 첨가하면서 플레이트를 흔들지 않도록 하여 각 웰의 버퍼에 기포가 존재하지 않도록 합니다. 즉시 얼음처럼 차가운 사전 산소화 된 절단 용액 10 밀리리터로 뇌를 해부하십시오.이어서, 비브라톰 섹션 코로나 스트리아탈 슬라이스를 사용하여, 얼음처럼 차가운 예비산소화 절단 용액에서 150 마이크로미터의 두께로 제조자의 지시에 따라. 다음으로, 50 밀리리터의 산소화 된 인공 뇌척수액에서 조각을 회수하십시오. 그리고 실온에서 최대 30 분 동안 용액에 보관하십시오.회복 후, 조각을 5 밀리미터의 호흡 버퍼가있는 35 x 10 밀리미터 페트리 접시로 옮깁니다. 스테인레스 스틸 생검 펀치를 사용하여 슬라이스를 버퍼에 유지하면서 펀치를 부드럽게 눌러 슬라이스 된 뇌의 원하는 영역에 원형 조직 조각을 만듭니다. 그런 다음 나머지 조직을 제거하고 펀치를 들어 올려 원형 조직 조각을 버퍼로 제거하십시오.그런 다음 한 밀리리터 피펫 팁의 맨 끝을 잘라 한 점 다섯 ~ 두 점 제로 밀리미터 직경의 구멍을 만들고 펀치 된 슬라이스를 잡고 캡처 화면 상단으로 옮기는 데 사용합니다. 펀치 된 뇌 조직의 한 조각을 흡입하고 조심스럽게 캡처 스크린의 메쉬 측면, 한쪽에 메쉬가 부착 된 원형 플라스틱 조각에 조직을 놓습니다. 종이 티슈를 사용하여 캡처 화면을 부드럽게 말리고 습기를 제거하여 조직이 끈적 거리고 메쉬 중앙에 부착되도록합니다.그런 다음 캡처 화면 슬라이스를 핀셋으로 아래로 잡고 인큐베이팅 아일렛 플레이트의 웰 중 하나에 놓습니다. 그런 다음 아일렛 플레이트를 섭씨 37도에서 적어도 30분 동안 인큐베이터에서 인큐베이션하여 분석을 실행하기 전에 온도 및 pH 평형화를 허용한다. BSA가 없는 원하는 화합물 및 변형된 인공 뇌척수액을 포트 A 내지 D에 대한 작업 농도의 최종 스톡 농도로 각각 희석한다.희석된 화합물 75 마이크로리터를 주입 포트의 벽에 대해 팁과 함께 45도 각도로 주입 포트 내로 반쯤 배치하여 센서 카트리지의 적절한 주입 포트에 부드럽게 예비로딩하면, 완전히 삽입하면 포트를 통한 화합물 누출이 발생할 수 있습니다. 그런 다음 기포를 만들지 않고 포트에서 팁을 조심스럽게 꺼내고 카트리지의 어느 부분도 탭하지 마십시오. 그런 다음 주입 포트를 육안으로 검사하여 모든 액체가 포트에 있고 카트리지 위에 잔류 방울이 없는지 확인하십시오.센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 위에 놓은 후 30분 동안 인큐베이터에 넣어 섭씨 37도까지 가열할 수 있도록 하면서 유틸리티 플레이트를 잡고 가능한 한 적게 움직여 조심스럽게 취급합니다. 먼저 소프트웨어에 분석 템플릿을 로드한 다음 녹색 시작 버튼을 누릅니다. 그런 다음 유틸리티 플레이트의 센서 카트리지를 계측기 트레이에 로드하여 플레이트가 올바르게 장착되고 평평한지 확인하고 약물로 채워진 센서 카트리지를 분석기에 로드하여 교정하십시오.그런 다음 화면의 지시 사항을 따라 보정하십시오. 그리고 센서의 평형을 유지하십시오. 평형 단계가 완료되면 교정 플레이트를 제거하고 메쉬 및 조직 조각이 들어있는 아일렛 플레이트로 교체하십시오.그런 다음 원고에 기재된 바와 같은 분석 프로토콜을 사용하여 플레이트의 각 웰에서 산소 소모율을 측정하십시오. 다음으로, 산소 소모율 측정 데이터와 커플링 효율 데이터를 분석한다. 대조군에서 슬라이스의 상이한 두께 및 펀치 크기에 대한 산소 소모율은 전체 측정에 걸쳐 안정한 기저 호흡을 나타냈고, 슬라이스의 부피에 비례하였다.또한, 산소 소모율은 10 % 미만의 런다운으로 다섯 시간 동안 상대적으로 안정적이었습니다. 미토콘드리아 결합 효율을 비교하였고 150 마이크로미터 두께와 1.5 밀리미터 크기의 펀치에서 슬라이스가 가장 높은 결합 효율을 보였다. 산소 소모율은 Pink1 녹아웃의 젊은 및 노인 그룹과 그들의 연령 일치 야생형 마우스에 대해 측정되었다.기저 산소 소모율은 어린 마우스에 대한 녹아웃 및 야생형 그룹 모두에서 유사하였다. 그러나 이전 그룹의 녹아웃 마우스에 대해서는 감소하였다. 그러나, 넉아웃 마우스에서의 미토콘드리아 기능장애는 젊은 연령 그룹에 대해 관찰되었고, Pink1의 녹아웃에 의한 감소된 결합 효율에 의해 나타난다.이 프로토콜의 중요한 단계에는 두뇌 조각을 준비하고, 캡처 화면 상단으로 전송하고, 슬라이드를 웰에 배치하고, 측정 중에 캡처 화면에 부착하는 것이 포함됩니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

노화와 아밀로이드 병리 동안 시냅틱 얼터 레이션의 연구에 대한 고양이와 트렌스 제닉 마우스의 급성 Hippocampal 조각의 준비

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

연구

신경과학

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

빠른 스캔 순환 Voltammetry와 Striatal 뇌 조각의 Presynaptic 도파민 역학

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

이미징 세포 내 칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt; 유전자 인코딩 된 칼슘 표시기를 사용하여 성인 마우스의 선조체 성상의 신호

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

설치류에서 급성 해마 조각을 사용하여 시냅스 태그 / 캡처 및 크로스 캡처 조사

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Ex Vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

성인 소뇌 슬라이스에 장기 우울증 유도의 평가

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...