Name: measurement of oxygen consumption rate in acute striatal slices from adult mice
Uploaded: 2022-06-08T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice at JoVE.com

Vi takker Wangchen Tsering og Pamela Walter for deres kritiske lesning og redigering av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 til CJL og NS098393 til HZ) og Institutt for nevrovitenskap ved Thomas Jefferson University (Startup Funds til HZ).

Alle prosedyrene, inkludert dyrearbeid, ble utført i henhold til nasjonale og internasjonale retningslinjer og ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved Thomas Jefferson University. Mannlige FVB/NTac mus i alderen 3 til 14 måneder ble brukt. Følgende trinn ble utført i en ikke-steril setting, men det bør utvises forsiktighet for å holde alt så rent som mulig.
MERK: Metoden som presenteres her ble etablert og brukt i forskningen rapportert av Zhi et al.24....

<ol>
	<li>Hauser, D. N., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+Parkinson's+disease+and+monogenic+parkinsonism.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism.</a> Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).</li><li>Swerdlow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+mitochondrial+cascades+in+Alzheimer's+disease.">Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).</li><li>Lou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+consumption+deficit+in+Huntington+disease+mouse+brain+under+metabolic+stress.">Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress.</a> Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).</li><li>Amo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+decrease+caused+by+loss+of+PINK1+is+not+due+to+proton+leak,+but+to+respiratory+chain+defects.">Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects.</a> Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).</li><li>Clark, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+pink1+is+required+for+mitochondrial+function+and+interacts+genetically+with+parkin.">Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).</li><li>Cooper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+rescue+of+mitochondrial+deficits+in+iPSC-derived+neural+cells+from+patients+with+familial+Parkinson's+disease.">Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease.</a> Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).</li><li>Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PINK1+causes+mitochondrial+functional+defects+and+increased+sensitivity+to+oxidative+stress.">Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).</li><li>Gispert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+phenotype+in+aged+PINK1-deficient+mice+is+accompanied+by+progressive+mitochondrial+dysfunction+in+absence+of+neurodegeneration.">Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration.</a> PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).</li><li>Heeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+PINK1+affects+mitochondrial+metabolism,+calcium+homeostasis+and+energy+maintenance.">Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance.</a> Journal of Cell Science. 124, 1115-1125 (2011).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pink1+regulates+the+oxidative+phosphorylation+machinery+via+mitochondrial+fission.">Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).</li><li>Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+expression+of+Parkinson's+disease-related+mitochondrial+abnormalities+in+PINK1+knockout+rats.">Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats.</a> Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).</li><li>Morais, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1+loss-of-function+mutations+affect+mitochondrial+complex+I+activity+via+NdufA10+ubiquinone+uncoupling.">PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling.</a> Science. 344 (6180), 203-207 (2014).</li><li>Morais, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease+mutations+in+PINK1+result+in+decreased+Complex+I+activity+and+deficient+synaptic+function.">Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function.</a> EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).</li><li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements.">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li><li>Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+measuring+cellular+bioenergetics+using+extracellular+flux.">Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux.</a> Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).</li><li>Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+respiration+and+bioenergetic+status+of+mitochondria+in+primary+cerebellar+granule+neuronal+cultures+exposed+continuously+to+glutamate.">In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells,+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells.">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).</li><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+self-referencing+oxygen-selective+microelectrode:+detection+of+transmembrane+oxygen+flux+from+single+cells.">The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells.</a> TheJournal of Experimental Biology. 202, 211-218 (1999).</li><li>Sure, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+assay+for+respiration+in+isolated+brain+microvessels+reveals+impaired+mitochondrial+function+in+the+aged+mice.">A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice.</a> Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).</li><li>Schuh, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+microplate-based+respirometry+for+hippocampal+slices+and+analysis+of+respiratory+capacity.">Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity.</a> Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).</li><li>Zhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PINK1+causes+age-dependent+decrease+of+dopamine+release+and+mitochondrial+dysfunction.">Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction.</a> Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).</li><li>Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mitochondrial+analysis+in+acute+brain+sections+from+adult+rats+reveals+mitochondrial+dysfunction+in+a+rat+model+of+migraine.">Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).</li><li>Qi, G., Mi, Y., Yin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+brain+metabolic+function+ex+vivo+with+acute+mouse+slice+punches.">Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).</li><li>Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assessing+tissue+respiration+in+anatomically+defined+brain+regions.">A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).</li></ol>

Metoden vi utviklet tillot en XF-analysator å bli brukt til å måle OCR i striatale skiver fra voksne mus over et tidsrom på 4 timer. Denne metoden gir en ny måte å måle cellulær bioenergetikk i slag skåret ut fra anatomisk definerte hjernestrukturer. Siden vevsprøvene som analyseres er ganske små, kan de metabolske parametrene til bestemte hjerneområder involvert i en sykdom undersøkes. I tillegg etterligner bruk av akutte skiver nærmere det fysiologiske cellulære miljøet, som ikke kan oppnås med isolert...

Mitokondriell dysfunksjon har vært involvert i flere nevrologiske sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom og Alzheimers sykdom 1,2,3. PD-modeller som PINK1 knockout (KO) mus og rotter viser nedsatt mitokondriell funksjon 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitokondrier isolert fra striatum (STR) eller hele hjernen til alderen PINK1 KO mus viser defekter i kompleks I 7,10,12,13. Direkte måling av oksygenforbrukshastigheten (OCR) er en av de vanligste metodene for å evaluere mitokondriell funksjon siden OCR er kombinert med ATP-produksjon, hovedfunksjonen til mitokondrier14. Derfor kan måling av OCR i sykdomsmodeller eller pasientavledede prøver / vev bidra til å undersøke hvordan mitokondriell dysfunksjon fører til sykdom.
For tiden er det flere måter å måle mitokondriell OCR på, inkludert Clark-elektroden og andre O 2-elektroder, O2 fluorescerende fargestoff og den ekstracellulære flussanalysatoren 15,16,17,18,19. Som en fordel tillater O2 elektrodebaserte metoder at forskjellige underlag enkelt kan tilsettes. De er imidlertid utilstrekkelige til samtidig å måle flere prøver. Sammenlignet med tradisjonelle O2 elektrodebaserte metoder, tilbyr den ekstracellulære fluksanalysatoren, et vanlig verktøy for OCR i cellekulturer eller rensede mitokondrier, forbedret gjennomstrømning 15,18,20. Likevel brukes alle disse metodene vanligvis til å måle OCR i isolerte mitokondrier eller cellekulturer 6,16,17,19,20,21. Isolering av mitokondrier forårsaker utilsiktet skade, og ekstraherte mitokondrier eller cellekulturer er mindre fysiologisk relevante enn intakte hjerneskiver22. Selv når mikroelektroder brukes i skiver, er de mindre følsomme og vanskeligere å betjene enn i dyrkede celler23.
For å møte disse utfordringene utviklet vi en metode ved hjelp av XF24 ekstracellulær fluksanalysator, som gjør det mulig å analysere flere metabolske parametere fra akutte striatale hjerneskiver av mus24. Denne teknikken gir kontinuerlig direkte kvantifisering av mitokondriell respirasjon via OCR. Kort fortalt plasseres små deler av striatale hjerneskiver i brønner på øyplaten, og analysatoren bruker oksygen- og protonfluorescerende baserte biosensorer for å måle OCR og ekstracellulær forsuringshastighet, henholdsvis 17,21,25.
En av de unike egenskapene til analysatoren er de fire injeksjonsbrønnene, som tillater fortsatt måling av OCR mens sekvensielt injiserer opptil fire forbindelser eller reagenser; Dette muliggjør måling av flere cellulære respirasjonsparametere, for eksempel basal mitokondriell OCR, ATP-bundet OCR og maksimal mitokondriell OCR. Forbindelsene som ble injisert under målingene for protokollen vist her, var arbeidskonsentrasjoner på 10 mM pyruvat i den første løsningsbrønnen (port A), 20 μM oligomycin i den andre løsningsbrønnen (port B), 10 μM karbonylcyanid 4-(trifluormetoksy) fenylhydrazon (FCCP) i den tredje brønnen (port C) og 20 μM antimycin A i den fjerde brønnen (port D), basert på Fried et al.25. Det må bemerkes at disse konsentrasjonene var arbeidskonsentrasjoner, og stamløsninger på henholdsvis 10x, 11x, 12x og 13x ble injisert i løsningsportene A til D. Hensikten med å bruke hver løsning var som følger: 1) Pyruvat var nødvendig siden uten det ville tilsetningen av FCCP ha en redusert OCR-respons forårsaket av en begrensning av tilgjengelige substrater; 2) Oligomycin hemmer ATP-syntase og tillater måling av ATP-koblet respirasjon; 3) FCCP kobler oksidasjon fra fosforylering og tillater måling av maksimal mitokondriell kapasitet; 4) Antimycin A hemmer kompleks III i elektrontransportkjeden og tillater derfor måling av OCR som ikke er knyttet til mitokondriene.
Konsentrasjonen av oligomycin som ble brukt ble bestemt ut fra følgende årsaker: 1) Den anbefalte dosen av oligomycin for de fleste celletyper (isolerte mitokondrier eller cellekulturer) er 1,5 μM. Av erfaring brukes vanligvis 3x-10x av dissosierte celledosen til skiveeksperimentene, siden det kan være en gradient, og penetrasjonen av løsningen i skivene tar tid. Derfor bør konsentrasjonen ligge i området 5 μM til 25 μM. 2) En konsentrasjon på 20 μM ble valgt basert på Fried et al.25. Høyere konsentrasjoner ble ikke forsøkt på grunn av oligomycins uspesifikke toksisitet. 3) I rapporten fra Underwood et al.26 gjorde forfatterne et titreringseksperiment for oligomycin og fant at doser på 6,25, 12,5, 25 og 50 μg / ml resulterte i lignende inhibering. Den høyere konsentrasjonen av oligomycin (50 μg/ml) hemmet ikke mer, men hadde større varians. 4) I vår observasjon synes den avgjørende faktoren å være oligomycins penetrerende evne. Det er vanskelig for oligomycin å trenge inn i vevet, og det er derfor det tar minst 7 til 8 sykluser for å nå platået, maksimal respons. Så lenge den når platået, antas inhiberingen å være maksimal.
En viktig teknisk utfordring ved å tilpasse den ekstracellulære fluksanalysatoren for måling av OCR i striatale skiver er å forhindre vevshypoksi. Siden bufferen ikke ble oksygenert under hele måleperioden (ca. 4 timer), var hypoksi et sentralt tema. Dette gjelder spesielt for tykkere vevsprøver, der oksygen ikke kan diffundere gjennom prøvene. For å overvinne dette problemet ble skiver seksjonert med en tykkelse på 150 μm, slik at omgivende oksygen kunne trenge inn i midten av hjerneskivene. I tillegg ble 4 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) tilsatt den pre-oksygenerte kunstige cerebrospinalvæskebufferen (ACSF), noe som gjorde det lettere å bestemme maksimal OCR, som tidligere antydet23. Vi undersøkte om cellene var i live. Først ble Hoechst 33258 (10 μM) og propidiumjodid (10 μM) brukt til å undersøke om cellene var sunne under disse forholdene. Vi undersøkte deretter om medium spiny nevroner var funksjonelt sunne ved hjelp av patch-clamp-opptak. Vi vurderte videre om dopaminterminaler (DA) i striatale skiver var funksjonelt sunne ved å måle DA-frigjøring ved hjelp av hurtigskanningsvolammetri. Resultatene viste at striatale skiver som ikke var oksygenert (ACSF/BSA-gruppen) var like friske som den oksygenerte kontrollgruppen24.
Vi testet deretter forskjellige kombinasjoner av skivetykkelse og slagstørrelse for å bestemme optimale striatale skiveforhold for fluksrespirasjonsanalysen. Dorsale striatale skiver med forskjellige tykkelser (150 μm og 200 μm) og stansestørrelser (1,0 mm, 1,5 mm og 2,0 mm i diameter) ble brukt til OCR-analyse ved hjelp av analysatoren. Striatale skiver som var 150 μm tykke med en slagstørrelse på 1,5 mm i diameter hadde den høyeste koblingseffektiviteten og OCR innenfor et optimalt område for analysatoren24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accumet AB150 pH benchtop meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB150</td>
			<td>To measure pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A8674</td>
			<td>To inhibit complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6003</td>
			<td>To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2920</td>
			<td>To uncouple mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>To dissovle compounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H3375</td>
			<td>To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified non-CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-683-230D</td>
			<td>To hydrate plates at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>O4876</td>
			<td>To inhibit mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td>sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3616</td>
			<td>To inhibit complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103681-100</td>
			<td>Solution for seahorse calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 FluxPaks</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>101174-100</td>
			<td>Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens,&#160; calibrant solution and calibration plates; assay kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2256</td>
			<td>To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel biopsy punches</td>
			<td>Miltex</td>
			<td></td>
			<td>Device used to punch slices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Eppendrof</td>
			<td>0030700102</td>
			<td>Used for slice punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>To slice brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific Precision</td>
			<td>282-115</td>
			<td>To heat buffer and solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rate in acute striatal slices from adult mice

Mitokondrier spiller en viktig rolle i cellulær ATP-produksjon, reaktiv oksygenartregulering og Ca2+ konsentrasjonskontroll. Mitokondriell dysfunksjon har vært involvert i patogenesen av flere nevrodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom og Alzheimers sykdom. For å studere rollen til mitokondrier i modeller av disse sykdommene, kan vi måle mitokondriell respirasjon via oksygenforbruk (OCR) som en proxy for mitokondriell funksjon. OCR har allerede blitt målt i cellekulturer, så vel som isolerte mitokondrier. Disse teknikkene er imidlertid mindre fysiologisk relevante enn å måle OCR i akutte hjerneskiver. For å overvinne denne begrensningen utviklet forfatterne en ny metode ved hjelp av en Seahorse XF-analysator for å måle OCR direkte i akutte striatale skiver fra voksne mus. Teknikken er optimalisert med fokus på striatum, et hjerneområde involvert i PD og Huntingtons sykdom. Analysatoren utfører en levende celleanalyse ved hjelp av en 24-brønns plate, som tillater samtidig kinetisk måling av 24 prøver. Metoden bruker sirkulære stansede biter av striatale hjerneskiver som prøver. Vi demonstrerer effektiviteten av denne teknikken ved å identifisere en lavere basal OCR i striatale skiver av en musemodell av PD. Denne metoden vil være av bred interesse for forskere som arbeider innen PD og Huntingtons sykdom.

Det første trinnet i denne studien var å optimalisere skivetykkelsen og stansestørrelsen som ble brukt til å fjerne en del av striatum fra skiven (figur 3A). En skive på 150 μm tykkelse og en 1,5 mm slagstørrelse ga de beste resultatene bestemt av koblingseffektiviteten (Figur 3B-C). Som vist i figur 3B, er OCR relativt stabil i 5 timer med mindre enn 10% nedkjøring. I tillegg ble det brukt ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice at JoVE.com

Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice

Oksygenforbruk (OCR) er en vanlig proxy for mitokondriell funksjon og kan brukes til å studere ulike sykdomsmodeller. Vi utviklet en ny metode ved hjelp av en Seahorse XF analysator for å direkte måle OCR i akutte striatale skiver fra voksne mus som er mer fysiologisk relevant enn andre metoder.

Måling av oksygenforbruk i akutte striatale skiver fra voksne mus

Mitochondria play an important role in cellular ATP production, reactive oxygen species regulation, and Ca2+ concentration control. Mitochondrial ...

Vi utviklet en ny metode ved hjelp av en XF-analysator for sjøhest for å måle oksygenforbruket direkte. Men vanlig proxy for mitokondriell funksjon i akutt lysbildeskive fra voksne mus. Denne metoden måler en cellulær av energetikk i punkteringer fra anatomisk definerte hjernestrukturer.Ved å bruke akutte skiver etterligner man det fysiologiske cellemiljøet som ikke kan oppnås på måter isolerte mitokondrielle eller kulturceller. Denne metoden vil være av bred interesse for forskere som arbeider innen Parkinsons sykdom og Huntingtons sykdom. For å begynne, åpne det ekstracellulære fluksanalysesettet og fjern både sensorpatronen og verktøyplaten.Plasser deretter sensorkassetten til side og ikke berør sensorene. Deretter legger du til 600 mikroliter kalibreringsløsning til hver vegg på bruksplaten. Plasser sensorpatronen på toppen av utstyrsplaten og senk sensorene i kalibreringsløsningen, slik at det trekantede hakket på verktøy- og sensorpatronplaten er riktig justert.Deretter forsegler du det ekstracellulære fluksanalysesettet med tetningsfilm for å forhindre fordampning av kalibreringsløsningen og plasserer den deretter i en 37 grader Celsius inkubator som ikke er supplert med karbondioksid eller oksygen, over natten. Åpne maljen fange mikroplate og ta ut eyelet plate for vev sitter. Varm deretter et passende volum av pre-oksygenert modifisert kunstig cerebral spinalvæskebuffer til 37 grader Celsius i et 50 milliliter rør.Deretter legger du BSA til en endelig konsentrasjon på fire milligram per milliliter for å forberede respirasjonsbufferen. Tilsett 625 mikroliter respirasjonsbuffer til hver brønn på maljeplaten forsiktig, samtidig som du unngår å riste platen, slik at ingen luftbobler er tilstede i bufferen til hver brønn. Umiddelbart dissekere hjernen i 10 milliliter iskald pre-oksygenert skjæreløsning.Deretter bruker du en vibratomseksjon koronale striatale skiver, etter produsentens instruksjon med en tykkelse på 150 mikrometer i iskald pre-oksygenert skjæreløsning. Deretter gjenoppretter skivene i 50 ml oksygenert kunstig cerebral spinalvæske. Og hold dem i oppløsning i opptil 30 minutter ved romtemperatur.Etter utvinning, overfør skivene til en 35 x 10 millimeter petriskål med fem millimeter respirasjonsbuffer. Ved hjelp av en biopsi i rustfritt stål skape et sirkulært stykke vev i ønsket område av den skivede hjernen ved forsiktig å trykke ned stansen mens du holder skiven i bufferen. Fjern deretter resten av vevet, løft stansen bort og fjern det sirkulære stykket vev inn i bufferen.Deretter kutter du enden av en milliliter pipettespiss for å lage et hull med en ettpunkts fem til topunkts null millimeter diameter og bruk den til å holde og overføre den stansede skiven til toppen av fangstskjermen. Sug ett stykke stanset hjernevev og legg vevet forsiktig på maskesiden av fangstskjermen, et sirkulært stykke plast med nettet festet til den ene siden. Bruk et papirlommetørk forsiktig fangstskjermen og fjern fuktigheten, noe som gjør at vevet blir klebrig og festet til midten av nettet.Deretter holder du opptaksskjermen skivesiden ned med pinsett og legger den i en av brønnene på den rugende maljeplaten. Inkuber deretter maljeplaten ved 37 grader Celsius i en inkubator i minst 30 minutter for å tillate temperatur og pH-likevekt før du kjører analysen. Fortynn de ønskede forbindelsene og modifisert kunstig cerebral spinalvæske uten BSA til den endelige lagerkonsentrasjonen av arbeidskonsentrasjonen for henholdsvis port A til D.Last forsiktig 75 mikroliter av de fortynnede forbindelsene inn i de passende injeksjonsportene på sensorpatronen ved å plassere spissene halvveis inn i injeksjonsportene i en 45 graders vinkel med spissen mot veggen på injeksjonsporten, da fullstendig innsetting kan forårsake sammensatt lekkasje gjennom porten. Etterpå trekker du spissene forsiktig ut av portene uten å skape luftbobler, og du må ikke banke på noen del av sylinderampullen for å unngå å lindre luftbobler. Inspiser deretter injeksjonsportene visuelt for jevn lasting, slik at all væske er i porten og at det ikke er resterende dråper på toppen av sylinderampullen.Etter å ha plassert sensorpatronen på bruksplaten, sett den inn i en inkubator i 30 minutter for å la den varme opp til 37 grader Celsius mens den håndteres forsiktig ved bare å holde på verktøyplaten og bevege seg så lite som mulig. Last først analysemalen i programvaren, og trykk deretter på den grønne startknappen. Legg deretter sensorpatronen på utstyrsplaten i instrumentbrettet, slik at platen sitter riktig og er flat, og legg den legemiddelfylte sensorkassetten inn i analysatoren for kalibrering.Følg deretter instruksjonene på skjermen for å kalibrere. Og balansere sensorene. Når likevektstrinnet er fullført, fjern kalibreringsplaten og erstatt den med maljeplaten som inneholder maske- og vevskivene.Mål deretter oksygenforbruket i hver brønn på platen, ved hjelp av analyseprotokollene som beskrevet i manuskriptet. Deretter analyserer du måledataene for oksygenforbrukshastighet og koblingseffektivitetsdataene. Oksygenforbruk for ulike tykkelser og hullstørrelser på skiver i kontrollgruppen viste stabil basal respirasjon over hele målingen og var proporsjonal med volumet på skiven.Videre var oksygenforbruket relativt stabilt i fem timer med mindre enn 10% nedkjøring. Mitokondriell koblingseffektivitet ble sammenlignet, og skiven på 150 mikrometer tykkelse og en 1,5 millimeter slagstørrelse viste den høyeste koblingseffektiviteten. Oksygenforbruket ble målt for unge og gamle grupper av Pink1 knockout og deres aldersmatchede villtypemus.Det basale oksygenforbruket var likt i både knockout- og villtypegruppene for unge mus. Men det gikk ned for knockoutmusene i den gamle gruppen. Imidlertid ble mitokondriell dysfunksjon i knockoutmusene observert for den unge aldersgruppen, indikert av den reduserte koblingseffektiviteten forårsaket av knockout av Pink1.De kritiske trinnene i denne protokollen inkluderer å forberede hjerneskiver, overføre dem til toppen av fangstskjermen, plassere lysbilder i brønner og holde dem festet til fangstskjermen under målingene.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Presynaptiske Dopamin Dynamics i striatale banene Brain Slices med Fast-scan Syklisk Voltammetry

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse Imaging av Neuroblast Migrasjon i Akutt Skiver av Adult Mouse forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Utarbeidelse av Akutt subventricular sone Slices for kalsium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual Elektrofysiologiske Opptak av Synaptically-fremkalt Astroglial og Neuronal Responses i akutt hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellulær Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i striatale Astrocytter fra voksne mus Bruke genetisk kodet Kalsium Indikatorer

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Gransking av Synaptic Tagging / Capture and Cross-fangst ved hjelp Akutt hippocampus Slices fra Gnagere

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Forberede frisk Retinal skiver fra voksne sebrafisk for Ex Vivo Imaging eksperimenter

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Vurdering av lang tids depresjon induksjon i voksen lillehjernen skiver

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...