Name: measurement of oxygen consumption rate in acute striatal slices from adult mice
Uploaded: 2022-06-08T12:40:00
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Agradecemos a Wangchen Tsering y Pamela Walter por su lectura crítica y edición de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) (NS054773 a C.J. L. y NS098393 a H.Z.) y el Departamento de Neurociencia de la Universidad Thomas Jefferson (Startup Funds a H.Z.).

Todos los procedimientos, incluido el trabajo con animales, se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas nacionales e internacionales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Thomas Jefferson. Se utilizaron ratones machos FVB/NTac a la edad de 3 a 14 meses. Los siguientes pasos se realizaron en un entorno no estéril, pero se debe tener precaución para mantener todo lo más limpio posible.
NOTA: El método aquí presentado fue establecido y utilizado en...

<ol>
	<li>Hauser, D. N., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+Parkinson's+disease+and+monogenic+parkinsonism.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism.</a> Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).</li><li>Swerdlow, R. 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M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+expression+of+Parkinson's+disease-related+mitochondrial+abnormalities+in+PINK1+knockout+rats.">Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats.</a> Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).</li><li>Morais, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1+loss-of-function+mutations+affect+mitochondrial+complex+I+activity+via+NdufA10+ubiquinone+uncoupling.">PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling.</a> Science. 344 (6180), 203-207 (2014).</li><li>Morais, V. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+microplate-based+respirometry+for+hippocampal+slices+and+analysis+of+respiratory+capacity.">Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity.</a> Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).</li><li>Zhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PINK1+causes+age-dependent+decrease+of+dopamine+release+and+mitochondrial+dysfunction.">Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction.</a> Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).</li><li>Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mitochondrial+analysis+in+acute+brain+sections+from+adult+rats+reveals+mitochondrial+dysfunction+in+a+rat+model+of+migraine.">Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).</li><li>Qi, G., Mi, Y., Yin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+brain+metabolic+function+ex+vivo+with+acute+mouse+slice+punches.">Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).</li><li>Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assessing+tissue+respiration+in+anatomically+defined+brain+regions.">A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).</li></ol>

El método que desarrollamos permitió utilizar un analizador XF para medir OCR en rodajas estriatales de ratones adultos durante un período de tiempo de 4 h. Este método proporciona una nueva forma de medir la bioenergética celular en punzones extirpados de estructuras cerebrales definidas anatómicamente. Dado que las muestras de tejido que se analizan son bastante pequeñas, se pueden investigar los parámetros metabólicos de áreas cerebrales específicas involucradas en una enfermedad. Además, el uso de rebanad...

La disfunción mitocondrial se ha implicado en varias enfermedades neurológicas, incluida la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Alzheimer 1,2,3. Los modelos de DP como los ratones y ratas PINK1 knockout (KO) muestran una función mitocondrial deteriorada 4,5,6,7,8,9,10,11. Las mitocondrias aisladas del cuerpo estriado (STR) o del cerebro entero del ratón PINK1 KO envejecido presentan defectos en el complejo I 7,10,12,13. La medición directa de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) es uno de los métodos más comunes para evaluar la función mitocondrial, ya que la OCR se combina con la producción de ATP, la función principal de las mitocondrias14. Por lo tanto, medir el OCR en modelos de enfermedad o muestras / tejidos derivados del paciente puede ayudar a investigar cómo la disfunción mitocondrial conduce a la enfermedad.
Actualmente, hay varias formas de medir el OCR mitocondrial, incluido el electrodo Clark y otros electrodos O2, el tinte fluorescente O2 y el analizador de flujo extracelular 15,16,17,18,19. Como ventaja, los métodos basados en electrodos O2 permiten agregar fácilmente varios sustratos. Sin embargo, son insuficientes para medir simultáneamente varias muestras. En comparación con los métodos tradicionales basados en electrodos de O2, el analizador de flujo extracelular, una herramienta comúnmente utilizada para OCR en cultivos celulares o mitocondrias purificadas, ofrece un rendimiento mejorado 15,18,20. Sin embargo, todos estos métodos se suelen aplicar para medir el OCR en mitocondrias aisladas o cultivos celulares 6,16,17,19,20,21. El aislamiento de las mitocondrias causa daños inadvertidos, y las mitocondrias extraídas o los cultivos celulares son menos relevantes fisiológicamente que las rebanadas cerebrales intactas22. Incluso cuando se utilizan microelectrodos en rodajas, son menos sensibles y más difíciles de operar que en células cultivadas23.
Para enfrentar estos desafíos, desarrollamos un método utilizando el analizador de flujo extracelular XF24, que permite el análisis de múltiples parámetros metabólicos a partir de cortes cerebrales estriatales agudos de ratones24. Esta técnica proporciona una cuantificación directa continua de la respiración mitocondrial a través del OCR. En resumen, pequeñas secciones de rebanadas de cerebro estriatal se colocan en los pocillos de la placa de los islotes, y el analizador utiliza biosensores basados en oxígeno y protones fluorescentes para medir la tasa de OCR y acidificación extracelular, respectivamente 17,21,25.
Una de las características únicas del analizador son los cuatro pozos de inyección, que permiten la medición continua de OCR mientras se inyecta secuencialmente hasta cuatro compuestos o reactivos; esto permite la medición de varios parámetros de respiración celular, como el OCR mitocondrial basal, el OCR ligado al ATP y el OCR mitocondrial máximo. Los compuestos inyectados durante las mediciones para el protocolo que se muestra aquí fueron concentraciones de trabajo de piruvato de 10 mM en el primer pozo de solución (puerto A), 20 μM de oligomicina en el segundo pozo de solución (puerto B), 10 μM de cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) en el tercer pozo (puerto C), y 20 μM de antimicina A en el cuarto pozo (puerto D), basado en Fried et al.25. Cabe señalar que estas concentraciones eran concentraciones de trabajo, y las soluciones madre de 10x, 11x, 12x y 13x se inyectaron en los puertos de solución A a D, respectivamente. El propósito de usar cada solución fue el siguiente: 1) El piruvato era necesario ya que, sin él, la adición de FCCP tendría una respuesta de OCR disminuida causada por una limitación de los sustratos disponibles; 2) La oligomicina inhibe la ATP sintasa y permite la medición de la respiración ligada al ATP; 3) FCCP desacopla la oxidación de la fosforilación y permite la medición de la capacidad mitocondrial máxima; 4) La antimicina A inhibe el complejo III en la cadena de transporte de electrones y, por lo tanto, permite la medición de OCR no vinculado a las mitocondrias.
La concentración de oligomicina utilizada se determinó en base a las siguientes razones: 1) La dosis recomendada de oligomicina para la mayoría de los tipos celulares (mitocondrias aisladas o cultivos celulares) es de 1,5 μM. Por experiencia, generalmente se usan 3x-10x de la dosis de células disociadas para los experimentos de rebanadas, ya que puede haber un gradiente, y la penetración de la solución en las rebanadas lleva tiempo. Por lo tanto, la concentración debe estar en el rango de 5 μM a 25 μM. 2) Se seleccionó una concentración de 20 μM basada en Fried et al.25. No se probaron concentraciones más altas debido a la toxicidad inespecífica de la oligomicina. 3) En el informe de Underwood et al.26, los autores realizaron un experimento de titulación de oligomicina y encontraron que las dosis de 6,25, 12,5, 25 y 50 μg/ml dieron lugar a una inhibición similar. La mayor concentración de oligomicina (50 μg/ml) no inhibió más, pero tuvo una mayor varianza. 4) En nuestra observación, el factor determinante parece ser la capacidad de penetración de la oligomicina. Es difícil que la oligomicina penetre en el tejido, y es por eso que se necesitan al menos de 7 a 8 ciclos para alcanzar la meseta, la respuesta máxima. Mientras alcance la meseta, se supone que la inhibición es máxima.
Un desafío técnico clave de la adaptación del analizador de flujo extracelular para medir el OCR en rodajas estriatales es prevenir la hipoxia tisular. Dado que el tampón no se oxigenó durante toda la duración de las mediciones (aproximadamente 4 h), la hipoxia fue un problema central. Esto es especialmente cierto para las muestras de tejido más gruesas, donde el oxígeno no puede difundirse a través de las muestras. Para superar este problema, las rebanadas se seccionaron a 150 μm de espesor, de modo que el oxígeno ambiental pudiera penetrar en la mitad de las rebanadas cerebrales. Además, se agregaron 4 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) al tampón de líquido cefalorraquídeo artificial preoxigenado (ACSF), lo que facilitó la determinación de OCR máximo, como se sugirió anteriormente23. Examinamos si las células estaban vivas. En primer lugar, se utilizaron Hoechst 33258 (10 μM) y yoduro de propidio (10 μM) para examinar si las células estaban sanas en estas condiciones. Luego examinamos si las neuronas espinosas medianas estaban funcionalmente sanas mediante el registro de pinza de parche. Además, evaluamos si los terminales de dopamina (DA) en las rebanadas estriatales eran funcionalmente saludables midiendo la liberación de DA mediante voltamperometría de escaneo rápido. Los resultados mostraron que las rebanadas estriatales que no estaban oxigenadas (grupo ACSF/BSA) eran tan saludables como el grupo control oxigenado24.
Luego probamos diferentes combinaciones de grosor de la rebanada y tamaño de punzón para determinar las condiciones óptimas de la rebanada estriatal para el ensayo de respiración de flujo. Se utilizaron rodajas estriatales dorsales con diferentes espesores (150 μm y 200 μm) y tamaños de punzonado (1,0 mm, 1,5 mm y 2,0 mm de diámetro) para el análisis de OCR utilizando el analizador. Las rodajas estriatales que tenían un grosor de 150 μm con un tamaño de punzonado de 1,5 mm de diámetro tenían la mayor eficiencia de acoplamiento y OCR dentro de un rango óptimo para el analizador24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accumet AB150 pH benchtop meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB150</td>
			<td>To measure pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A8674</td>
			<td>To inhibit complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6003</td>
			<td>To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2920</td>
			<td>To uncouple mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>To dissovle compounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H3375</td>
			<td>To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified non-CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-683-230D</td>
			<td>To hydrate plates at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>O4876</td>
			<td>To inhibit mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td>sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3616</td>
			<td>To inhibit complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103681-100</td>
			<td>Solution for seahorse calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 FluxPaks</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>101174-100</td>
			<td>Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens,&#160; calibrant solution and calibration plates; assay kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2256</td>
			<td>To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel biopsy punches</td>
			<td>Miltex</td>
			<td></td>
			<td>Device used to punch slices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Eppendrof</td>
			<td>0030700102</td>
			<td>Used for slice punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>To slice brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific Precision</td>
			<td>282-115</td>
			<td>To heat buffer and solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rate in acute striatal slices from adult mice

Las mitocondrias juegan un papel importante en la producción celular de ATP, la regulación de especies reactivas de oxígeno yel control de la concentración de Ca 2+. La disfunción mitocondrial se ha implicado en la patogénesis de múltiples enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Alzheimer. Para estudiar el papel de las mitocondrias en los modelos de estas enfermedades, podemos medir la respiración mitocondrial a través de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) como un proxy de la función mitocondrial. El OCR ya se ha medido con éxito en cultivos celulares, así como en mitocondrias aisladas. Sin embargo, estas técnicas son menos relevantes fisiológicamente que la medición de OCR en cortes cerebrales agudos. Para superar esta limitación, los autores desarrollaron un nuevo método utilizando un analizador Seahorse XF para medir directamente el OCR en cortes estriatales agudos de ratones adultos. La técnica está optimizada con un enfoque en el cuerpo estriado, un área del cerebro involucrada en la EP y la enfermedad de Huntington. El analizador realiza un ensayo de células vivas utilizando una placa de 24 pocillos, que permite la medición cinética simultánea de 24 muestras. El método utiliza piezas perforadas circularmente de cortes de cerebro estriatal como muestras. Demostramos la efectividad de esta técnica mediante la identificación de un OCR basal inferior en rodajas estriatales de un modelo de ratón de EP. Este método será de amplio interés para los investigadores que trabajan en el campo de la EP y la enfermedad de Huntington.

El primer paso de este estudio fue optimizar el grosor de la rebanada y el tamaño del punzón utilizado para extirpar una sección del cuerpo estriado de la rebanada (Figura 3A). Una rebanada de 150 μm de espesor y un tamaño de punzonado de 1,5 mm dieron los mejores resultados determinados por la eficiencia de acoplamiento (Figura 3B-C). Como se muestra en la Figura 3B, el OCR es relativamente es...

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Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice

La tasa de consumo de oxígeno (OCR) es un indicador común de la función mitocondrial y se puede utilizar para estudiar diferentes modelos de enfermedades. Desarrollamos un nuevo método utilizando un analizador Seahorse XF para medir directamente el OCR en rodajas estriatales agudas de ratones adultos que es más relevante fisiológicamente que otros métodos.

Medición de la tasa de consumo de oxígeno en rodajas estriatales agudas de ratones adultos

Mitochondria play an important role in cellular ATP production, reactive oxygen species regulation, and Ca2+ concentration control. Mitochondrial ...

Desarrollamos un nuevo método utilizando un analizador XF de caballito de mar para medir directamente la tasa de consumo de oxígeno. Pero el proxy común para la función mitocondrial en la rebanada de deslizamiento agudo de ratones adultos. Este método mide una célula por energía en punciones de estructuras cerebrales definidas anatómicamente.El uso de rebanadas agudas imita más de cerca el entorno celular fisiológico que no se puede lograr de las formas aisladas mitocondriales o células de cultivo. Este método será de amplio interés para los investigadores que trabajan en el campo de la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington. Para comenzar, abra el kit de ensayo de flujo extracelular y retire tanto el cartucho del sensor como la placa de utilidad.A continuación, coloque el cartucho del sensor a un lado y no toque los sensores. A continuación, agregue 600 microlitros de solución calibrada a cada pared de la placa de utilidad. Coloque el cartucho del sensor en la parte superior de la placa de utilidad y sumerja los sensores en la solución de calibración, asegurándose de que la muesca triangular de la placa del cartucho de la utilidad y del sensor estén correctamente alineadas.Después, selle el kit de ensayo de flujo extracelular con una película de sellado para evitar la evaporación de la solución calibrada y luego colóquelo en una incubadora de 37 grados Celsius no suplementada con dióxido de carbono u oxígeno, durante la noche. Abra la microplaca de captura de ojales y saque la placa del ojal para sentar el tejido. Luego caliente un volumen apropiado de tampón de líquido cefalorraquídeo artificial modificado preoxigenado a 37 grados Celsius en un tubo de 50 mililitros.A continuación, agregue BSA a una concentración final de cuatro miligramos por mililitro para preparar el tampón de respiración. Agregue 625 microlitros de tampón de respiración a cada pocillo de la placa del ojal con cuidado mientras evita agitar la placa, asegurándose de que no haya burbujas de aire presentes en el tampón de cada pozo. Diseccionar inmediatamente el cerebro en 10 mililitros de solución de corte preoxigenada helada.Luego, utilizando una sección de vibratomo cortes estriatales coronales, siguiendo las instrucciones del fabricante a un espesor de 150 micrómetros en solución de corte preoxigenada helada. A continuación, recupere las rebanadas en 50 mililitros de líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado. Y manténgalos en solución hasta por 30 minutos a temperatura ambiente.Después de la recuperación, transfiera las rodajas a una placa de Petri de 35 por 10 milímetros con cinco milímetros de tampón de respiración. Usando un punzón de biopsia de acero inoxidable, cree una pieza circular de tejido en el área deseada del cerebro cortado presionando suavemente el punzón mientras mantiene la rebanada en el tampón. Luego retire el resto del tejido, levante el punzón y retire la pieza circular de tejido en el tampón.A continuación, corte el extremo de una punta de pipeta de un mililitro para hacer un agujero con un diámetro de un milímetro de punto cinco a dos punto cero y úselo para sostener y transferir la rebanada perforada a la parte superior de la pantalla de captura. Succione una pieza de tejido cerebral perforado y coloque cuidadosamente el tejido en el lado de malla de la pantalla de captura, una pieza circular de plástico con la malla unida a un lado. Usando un pañuelo de papel, seque suavemente la pantalla de captura y elimine la humedad, lo que permite que el tejido se vuelva pegajoso y se adhiera al centro de la malla.A continuación, sostenga la pantalla de captura con pinzas y colóquela en uno de los pocillos de la placa del ojal de incubación. Luego incube la placa del ojal a 37 grados Celsius en una incubadora durante al menos 30 minutos para permitir el equilibrio de la temperatura y el pH antes de ejecutar el ensayo. Diluir los compuestos deseados y modificar el líquido cefalorraquídeo artificial sin BSA a la concentración final de la concentración de trabajo para los puertos A a D, respectivamente.Precargue suavemente 75 microlitros de los compuestos diluidos en los puertos de inyección apropiados del cartucho del sensor colocando las puntas a la mitad de los puertos de inyección en un ángulo de 45 grados con la punta contra la pared del puerto de inyección, ya que la inserción completa puede causar fugas de compuestos a través del puerto. Después, retire las puntas de los puertos con cuidado sin crear burbujas de aire y no toque ninguna parte del cartucho para evitar aliviar las burbujas de aire. A continuación, inspeccione visualmente los puertos de inyección para una carga uniforme, asegurándose de que todo el líquido esté en el puerto y que no haya gotas residuales en la parte superior del cartucho.Después de colocar el cartucho del sensor en la placa de utilidad, colóquelo en una incubadora durante 30 minutos para permitir que se caliente hasta 37 grados centígrados mientras se maneja con cuidado al sujetar solo la placa de servicio y moverse lo menos posible. Primero cargue la plantilla de ensayo en el software y luego presione el botón verde de inicio. Luego cargue el cartucho del sensor en la placa de utilidad en la bandeja de instrumentos, asegurándose de que la placa se asiente correctamente y esté plana, cargando el cartucho del sensor lleno de drogas en el analizador para su calibración.Después, siga las instrucciones en la pantalla para calibrar. Y equilibrar los sensores. Una vez que se haya realizado el paso de equilibrio, retire la placa de calibración y reemplácela con la placa del ojal que contiene la malla y las rodajas de tejido.Luego mida la tasa de consumo de oxígeno en cada pozo de la placa, utilizando los protocolos de ensayo como se describe en el manuscrito. A continuación, analice los datos de medición de la tasa de consumo de oxígeno y los datos de eficiencia de acoplamiento. Las tasas de consumo de oxígeno para diferentes espesores y tamaños de punzonado de rodajas en el grupo de control mostraron una respiración basal estable durante toda la medición y fueron proporcionales al volumen de la rebanada.Además, las tasas de consumo de oxígeno fueron relativamente estables durante cinco horas con menos del 10% de agotamiento. Se comparó la eficiencia de acoplamiento mitocondrial y la rebanada con un grosor de 150 micrómetros y un tamaño de punzón de 1,5 milímetros mostró la mayor eficiencia de acoplamiento. Las tasas de consumo de oxígeno se midieron para los grupos jóvenes y viejos de Pink1 knockout y sus ratones de tipo salvaje de la misma edad.La tasa de consumo de oxígeno basal fue similar tanto en los grupos knockout como en los de tipo salvaje para ratones jóvenes. Sin embargo, disminuyó para los ratones knockout en el grupo antiguo. Sin embargo, la disfunción mitocondrial en los ratones knockout se observó para el grupo de edad joven, indicada por la disminución de la eficiencia de acoplamiento causada por el knockout de Pink1.Los pasos críticos en este protocolo incluyen preparar cortes de cerebro, transferirlos a la parte superior de la pantalla de captura, colocar diapositivas en pozos y mantenerlos unidos a la pantalla de captura durante las mediciones.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Preparación de la aguda rodajas de hipocampo de ratas y ratones transgénicos para el estudio de las alteraciones sinápticas durante el envejecimiento y la patología amiloide

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Investigación

Neurociencias

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Dinámica presináptica de dopamina estriatal en rodajas de cerebro de voltametría cíclica rápida de exploración

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Preparación de agudos Slices zona subventricular for Imaging Calcio

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging intracelular de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en estriatal astrocitos de ratones adultos a través de indicadores de calcio codificados genéticamente-

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Investigación de sináptica Tagging / Captura y Cruz de captura utilizando aguda hipocampo rebanadas de Roedores

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparación frescas rebanadas retinales de pez cebra adulto para Ex Vivo de experimentos

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Evaluación de la inducción a largo plazo de la depresión en rodajas de cerebelosores adultos

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...