Name: applications of rna interference in american cockroach
Uploaded: 2021-12-17T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions n° 32070500, 31620103917, 31330072 et 31572325 à C.R., Sh.L.), par la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (subvention n° 2021B1515020044 et 2020A1515011267 à C.R.), par le Département des sciences et de la technologie de la province du Guangdong (subventions n° 2019B0905003 et 2019A0102006), par le Département des sciences et de la technologie de Guangzhou (subvention n° 202102020110), par le Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 à Sh.L.).

La ligne de P. americana a été initialement fournie par le Dr Huiling Hao. Cette espèce est maintenue avec la consanguinité depuis 30 ans9.
1. Éclosion et alimentation de P. americana
<ol><li>Recueillir les oothèques fraîches (immédiatement après la ponte) de P. americana et incuber dans l’incubateur sombre à 25 °C et 60 % d’humidité pendant environ 25 jours. Augmentez ensuite la température et l’humidité...

<ol>
	<li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum:+Parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi.">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PloS One. 7 (10), 47431 (2012).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+and+RNA+interference+of+cockroach+phototransduction+indicate+three+opsins+and+suggest+a+major+role+for+TRPL+channels.">Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels.</a> Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).</li><li>Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+supports+a+role+for+Nanchung-Inactive+in+mechanotransduction+by+the+cockroach,+Periplaneta+americana,+tactile+spine.">RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine.</a> Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).</li><li>Immonen, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EAG+channels+expressed+in+microvillar+photoreceptors+are+unsuited+to+diurnal+vision.">EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision.</a> The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+and+functional+landscapes+of+developmental+plasticity+in+the+American+cockroach.">The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach.</a> Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grainy+head+signaling+regulates+epithelium+development+and+ecdysis+in+Blattella+germanica.">Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica.</a> Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).</li><li>Lozano, J., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+repressive+function+of+Kr&#252;ppel+homolog+1+on+insect+metamorphosis+in+hemimetabolous+and+holometabolous+species.">Conserved repressive function of Kr&#252;ppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species.</a> Scientific Reports. 1, 163 (2011).</li><li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection.">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference-based+specific+and+efficient+gene+inactivation+in+the+brain.">CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).</li><li>Garbutt, J. S., Bell&#233;s, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success:+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica.">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li><li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger:+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference.">Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).</li><li>Lemonds, T. R., Liu, J., Popadi&#263;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+the+melanin+pathway+to+overall+body+pigmentation+during+ontogenesis+of+Periplaneta+americana.">The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana.</a> Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).</li><li>Jackson, A. L., Linsley, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+amidst+the+silence:+Off-target+effects+of+siRNAs.">Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs.</a> Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).</li><li>Patel, M., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DISE-inducing+shRNAs+by+monitoring+cellular+responses.">Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses.</a> Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).</li><li>Vent&#243;s-Alfonso, A., Ylla, G., Monta&#241;es, J. C., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT1+promotes+genome+methylation+and+early+embryo+development+in+cockroaches.">DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches.</a> iScience. 23 (12), 101778 (2020).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo.">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).</li><li>Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interfering+RNA:+A+new+tool+for+gene+therapy.">interfering RNA: A new tool for gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).</li></ol>

Ce rapport décrivait une stratégie méthodologique d’ARNi étape par étape chez P. americana; Il convient de noter qu’il peut également être appliqué à d’autres cafards (Blattella germanica, par exemple) et à de nombreux autres insectes présentant des modifications mineures. Cependant, l’efficacité du silençage génique de l’ARNi n’est pas toujours assez élevée, avec un inconvénient évident par rapport à la stratégie d’éliminationgénique 13. L’e...

L’interférence ARN (ARNi), un mécanisme conservé sur le plan de l’évolution, devient progressivement un outil génétique inverse essentiel pour inhiber l’expression des gènes dans de nombreux organismes1, depuis qu’Andrew Fire et Craig Mello2 ont développé la stratégie de silence génétique médié par l’ARN double brin (ARNdS). L’ARNds est clivé en fragments de 21 à 23 nucléotides, de petits ARN interférents (siRNA), par l’enzyme Dicer dans les cellules pour activer la voie de l’ARNi. Ensuite, les siRNA sont incorporés dans le complexe de silençage induit par l’ARN (RISC), qui se couple à l’ARNm cible, provoque un clivage de l’ARNm et entraîne finalement la perte de la fonction génique 3,4,5. Parmi les espèces d’insectes, de nombreuses expériences systémiques d’ARNi ont jusqu’à présent été rapportées dans de nombreux ordres d’insectes, tels que les orthoptères, les isoptères, les hémiptères, les coléoptères, les neuroptères, les diptères, les hyménoptères, les lépidoptères etles blattodea 5,6,7,8.
Les cafards (Blattaria) sont une famille d’insectes essentielle dans les études développementales et métamorphiques avec leurs cycles de croissance rapides, leur forte adaptabilité à l’environnement et leur grande plasticité développementale9. Avant de découvrir que l’ARNi était compatible avec les cafards, les recherches précédentes se concentraient uniquement sur la prévention et le contrôle des cafards en raison de la rareté des techniques de manipulation génétique chez les cafards. La structure unique de l’oothèque de cafard rendait difficile l’exécution d’un knockout génétique basé sur l’injection d’embryons avec le système CRISPR-Cas9. En outre, la plupart des tissus chez les cafards (tels que P. americana) présentent une réponse systémique robuste à l’ARNi, permettant la génération rapide de phénotypes dysfonctionnels en injectant un ou plusieurs ARNd ciblant 9,10,11. Ces caractéristiques ont fait de l’ARNi une technique indispensable dans la recherche fonctionnelle sur les gènes chez P. americana.
Même si l’utilisation de l’ARNi dans la recherche sur les gènes fonctionnels chez P. americana a été rapportée, aucune description détaillée ou étape par étape n’était disponible. Ce rapport fournit une ligne directrice opérationnelle étape par étape pour l’ARNi chez P. americana, utile pour l’étude de la fonction génique chez d’autres cafards. De plus, ce guide ne se limite pas à Blattodea et peut être appliqué à de nombreux autres insectes avec des modifications mineures.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>701 N 10 &#181;L Syr (26s/51/2)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>PN:80300</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Ningbo Jiangnan Instrument Factory</td>
			<td>RXZ-380A-LED</td>
			<td>For cockroaches hatching and feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-injection pump</td>
			<td>Alcott Biotechnology</td>
			<td>ALC-IP600</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTOPO-Blunt Cloning Kit</td>
			<td>Aidlab Biotechnology</td>
			<td>CV16</td>
			<td>For Gene clonging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quantitative Real-Time PCR Systems</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX Connect</td>
			<td>For qRT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RiboMAX Express RNAi System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1700</td>
			<td>For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 &#956;g/&#956;L), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cyclers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>S1000</td>
			<td>For DNA amplification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of rna interference in american cockroach

Les cafards, un ravageur sanitaire, sont des espèces essentielles dans les études de développement et de métamorphie des insectes en raison de leur alimentation facile et de leurs caractéristiques hémimétabrines. Ensemble avec des séquences de génome bien annotées, ces avantages ont fait du cafard américain, Periplaneta americana, un modèle important d’insecte hémimétabole. Limité par l’absence de stratégie de knock-out, l’interférence ARN efficace (ARNi) basée sur l’élimination des gènes devient une technique indispensable dans la recherche sur les gènes fonctionnels de P. americana. Le présent protocole décrit les techniques de fonctionnement de l’ARNi chez P. americana. Le protocole comprend (1) la sélection du P. americana aux stades de développement appropriés, (2) la préparation pour le réglage de l’injection, (3) l’injection d’ARNd et (4) la détection de l’efficacité de l’élimination des gènes. L’ARNi est un puissant outil génétique inverse chez P. americana. La majorité des tissus de P. americana sont sensibles à l’ARNds extracellulaire. Sa simplicité permet aux chercheurs d’obtenir rapidement des phénotypes dysfonctionnels sous une ou plusieurs injections d’ARNd ciblant, ce qui permet aux chercheurs de mieux utiliser le P. americana pour les études développementales et métamorphiques.

La figure 1 montre une injection réussie. La seringue de micro-injection avec une aiguille de micro diamètre doit être placée horizontalement sur le booster (Figure 1A). L’aiguille est insérée par l’espace entre deux somites abdominales horizontalement contre l’épiderme (Figure 1B). Assurez-vous que le liquide pénètre dans l’abdomen de P. americana . L’angle trop raide de l’aiguille endommagera...

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Applications of RNA Interference in American Cockroach

Le présent protocole décrit des lignes directrices étape par étape pour les techniques d’opération de l’ARNi chez P. americana.

Applications de l’interférence ARN chez le cafard américain

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous ...

Le protocole fournit un moyen simple d’étudier les cafards américains. Un ravageur sanitaire commun et un insecte bénéfique pour la médecine traditionnelle chinoise. Il aidera à explorer les mécanismes moléculaires de multiples activités de vie des cafards américains en détruisant des gènes spécifiques.Le principal avantage de cette technologie est qu’elle peut détruire des gènes chez les cafards américains ou d’autres insectes similaires qui ne conviennent pas à l’édition de gènes. Cette technologie peut être utilisée pour explorer divers domaines tels que la régulation génétique et épigénétique, le processus de développement des tissus, la régénération des appendices, le comportement d’accouplement et d’autres aspects intéressants du cafard américain. Cette technologie est facile à utiliser et polyvalente.Nous suggérons de garder les animaux en bonne santé pendant le traitement par injection de DSRA. Je crois que les novices peuvent facilement maîtriser cette technique après plusieurs séances d’entraînement. Pour commencer, séparez les nymphes hachées des oothèques avec un tamis à ouverture de quatre millimètres.Choisissez le P.americana blanc fraîchement malté avec un tube en verre. Placez le P.americana dans de nouveaux récipients et attendez le bon stade pour le traitement. Dans le système de réaction, ajoutez 10 microlitres de tampon T7 2X, 2 microlitres du mélange d’enzymes T7 Express et deux microgrammes de produit PCR.Enfin, augmentez le volume total à 20 microlitres avec de l’eau double distillée. Mélanger doucement à l’envers manuellement et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Diluer 4 microgrammes par microlitre de solution de RNase A avec de l’eau DEPC dans un rapport de 1 à 200.Ajoutez ensuite 1 microlitre d’une unité par microlitre RQ1 RNase Free Dnase et 1 microlitre de solution diluée de RNase A au système. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite 10% du volume total d’acétate de sodium et trois volumes du volume total d’isopropanol.Mélanger doucement à l’envers manuellement, puis placer sur de la glace pendant cinq minutes et centrifuger à 13 000 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, lavez le résidu avec de l’éthanol à 75%, avec de l’eau traitée à 25% de DEPC, puis centrifugez à 13 000 g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius.Retirez à nouveau le surnageant, séchez la pastille à l’air libre pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, dissoudre l’ARN double brin avec environ 100 microlitres d’eau DEPC et le diluer à la concentration finale de 2 microgrammes par microlitre. Configurez le programme dans la pompe à micro-injection pour vous assurer que le volume de chaque injection est constant.Nettoyez ensuite la seringue en la remplissant d’eau DEPC 8 à 10 fois. Installez la seringue de 10 microlitres sur la micro-pompe d’injection. Ensuite, démarrez la pompe et remplissez la seringue avec 10 microlitres de solution d’ARN double brin.Anesthésiez les cafards avec du dioxyde de carbone, puis ramassez-les doucement avec une pince à épiler et livrez le cafard vers l’aiguille à la main. Ensuite, insérez l’aiguille via l’espace entre deux somites abdominales horizontalement contre l’épiderme. Injectez la solution d’ARN double brin dans le cafard en veillant à ce que la pointe de l’aiguille soit aussi proche que possible de l’épiderme pour éviter d’endommager les organes internes.Enfin, retirez la pointe de l’aiguille. Mettez les cafards injectés dans des récipients d’essai biologique propres. Attendez environ 10 à 20 minutes pour les laisser se remettre des effets du dioxyde de carbone.Étiqueter les récipients avec la date d’injection, le type et la dose d’ARN double brin et l’âge du P.americana. Ddc ou DOPA décarboxylase et Dpp ou gènes décapentaplégiques ont été sélectionnés comme deux exemples pour observer le phénotype des cafards maltés après injection d’ARN double brin et dsMocK qui n’a pas de cible chez les animaux a été pris comme un témoin négatif. L’efficacité de l’ARNi a été détectée par qRT PCR.Les gènes ont été significativement détruits avec une valeur P inférieure à 0,01 pour dsDdc et inférieure à 0,05 pour dsDpp. P.americana avec les gènes Ddc knockdown avait l’épiderme blanc en raison de la mélanisation bloquée. Dans l’expérience avec des injections de dsDpp, l’ARNi a perturbé la régénération des membres.Les insectes doivent être en bonne santé et injectés sans dommage. Cette technologie fournit un moyen simple d’explorer les fonctions des gènes pour les insectes qui ne peuvent pas être modifiés par des gènes tels que le cafard américain.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Transcriptionnelle Analyse par Naissant ARN FISH<em&gt; In Vivo</em&gt; Cellules Trophoblast géants ou<em&gt; In vitro</em&gt; Cultures à court terme de ectoplacentaire Cône explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Recherche

Biologie du développement

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The Trier Social Stress Test (TSST) is a well validated and widely used social stressor that has been shown to induce a 2-4 fold increase in cortisol, the ...

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Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

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