Name: applications of rna interference in american cockroach
Uploaded: 2021-12-17T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 y 31572325 a C.R., Sh.L.), por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong (Grant No. 2021B1515020044 y 2020A1515011267 a C.R.), por el Departamento de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Guangdong (Grant Nos. 2019B090905003 y 2019A0102006), por el Departamento de Ciencia y Tecnología en Guangzhou (Grant No. 202102020110), por el Programa de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (Subvención No. KQTD20180411143628272 a Sh.L.).

La línea de P. americana fue proporcionada inicialmente por el Dr. Huiling Hao. Esta especie se ha mantenido con endogamia durante 30 años9.
1. Eclosión y alimentación de P. americana
<ol><li>Recolecte ootecas frescas (inmediatamente después de la puesta de huevos) de P. americana e incube en la incubadora oscura a 25 ° C y 60% de humedad durante ~ 25 días. Luego aumente la temperatura y la humedad a 30 ° C y 75% 3 d...

<ol>
	<li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum:+Parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi.">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PloS One. 7 (10), 47431 (2012).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+and+RNA+interference+of+cockroach+phototransduction+indicate+three+opsins+and+suggest+a+major+role+for+TRPL+channels.">Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels.</a> Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).</li><li>Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+supports+a+role+for+Nanchung-Inactive+in+mechanotransduction+by+the+cockroach,+Periplaneta+americana,+tactile+spine.">RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine.</a> Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).</li><li>Immonen, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EAG+channels+expressed+in+microvillar+photoreceptors+are+unsuited+to+diurnal+vision.">EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision.</a> The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+and+functional+landscapes+of+developmental+plasticity+in+the+American+cockroach.">The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach.</a> Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grainy+head+signaling+regulates+epithelium+development+and+ecdysis+in+Blattella+germanica.">Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica.</a> Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).</li><li>Lozano, J., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+repressive+function+of+Kr&#252;ppel+homolog+1+on+insect+metamorphosis+in+hemimetabolous+and+holometabolous+species.">Conserved repressive function of Kr&#252;ppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species.</a> Scientific Reports. 1, 163 (2011).</li><li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection.">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference-based+specific+and+efficient+gene+inactivation+in+the+brain.">CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).</li><li>Garbutt, J. S., Bell&#233;s, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success:+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica.">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li><li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger:+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference.">Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).</li><li>Lemonds, T. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DISE-inducing+shRNAs+by+monitoring+cellular+responses.">Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses.</a> Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).</li><li>Vent&#243;s-Alfonso, A., Ylla, G., Monta&#241;es, J. C., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT1+promotes+genome+methylation+and+early+embryo+development+in+cockroaches.">DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches.</a> iScience. 23 (12), 101778 (2020).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo.">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).</li><li>Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interfering+RNA:+A+new+tool+for+gene+therapy.">interfering RNA: A new tool for gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).</li></ol>

Este informe describió una estrategia metodológica de ARNi paso a paso en P. americana; Cabe destacar que también se puede aplicar a otras cucarachas (Blattella germanica, por ejemplo) y muchos otros insectos con cambios menores. Sin embargo, la eficiencia de silenciamiento génico del ARNi no siempre es lo suficientemente alta, con una desventaja obvia en comparación con la estrategia de eliminaciónde genes 13. El siguiente efecto residual a nivel de gen puede interferir co...

La interferencia de ARN (RNAi), un mecanismo conservado evolutivamente, se convierte gradualmente en una herramienta genética inversa esencial para inhibir la expresión génica en muchos organismos1, ya que Andrew Fire y Craig Mello2 desarrollaron la estrategia de silencio genético mediado por ARN de doble cadena (dsRNA). El dsRNA se escinde en fragmentos de 21-23 nucleótidos, pequeños ARN interferentes (siRNAs), por la enzima Dicer en las células para activar la vía del ARNi. Luego, los siRNAs se incorporan al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que se acopla al ARNm objetivo, causa la escisión del ARNm y finalmente resulta en la pérdida de la funcióndel gen 3,4,5. Entre las especies de insectos, hasta ahora se han reportado muchos experimentos sistémicos de ARNi en muchos órdenes de insectos, como Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera y Blattodea 5,6,7,8.
Las cucarachas (Blattaria) son una familia de insectos esenciales en estudios de desarrollo y metamórficos con sus ciclos de crecimiento rápido, fuerte adaptabilidad al medio ambiente y alta plasticidad de desarrollo9. Antes de descubrir que el ARNi era compatible con las cucarachas, las investigaciones anteriores solo se centraron en la prevención y el control de las cucarachas debido a la escasez de técnicas de manipulación genética en las cucarachas. La estructura única de la cucaracha ootheca hizo que fuera un desafío realizar la eliminación de genes basada en inyección de embriones con el sistema CRISPR-Cas9. Además, la mayoría de los tejidos de las cucarachas (como P. americana) muestran una respuesta arNi sistémica robusta, lo que permite la rápida generación de fenotipos disfuncionales mediante la inyección de uno o más dsRNAsdirigidos 9,10,11. Estas características hicieron del ARNi una técnica indispensable en la investigación funcional génica en P. americana.
A pesar de que se ha informado del uso de ARNi en la investigación de genes funcionales en P. americana , no se disponía de una descripción detallada o paso a paso. Este informe proporciona una guía operativa paso a paso para el ARNi en P. americana, útil para el estudio de la función génica en otras cucarachas. Además, esta guía no se limita a Blattodea y se puede aplicar a muchos otros insectos con modificaciones menores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>701 N 10 &#181;L Syr (26s/51/2)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>PN:80300</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Ningbo Jiangnan Instrument Factory</td>
			<td>RXZ-380A-LED</td>
			<td>For cockroaches hatching and feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-injection pump</td>
			<td>Alcott Biotechnology</td>
			<td>ALC-IP600</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTOPO-Blunt Cloning Kit</td>
			<td>Aidlab Biotechnology</td>
			<td>CV16</td>
			<td>For Gene clonging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quantitative Real-Time PCR Systems</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX Connect</td>
			<td>For qRT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RiboMAX Express RNAi System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1700</td>
			<td>For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 &#956;g/&#956;L), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cyclers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>S1000</td>
			<td>For DNA amplification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of rna interference in american cockroach

Las cucarachas, una plaga sanitaria, son especies esenciales en el desarrollo de insectos y estudios metamórficos debido a su fácil alimentación y características hemimetábolas. Junto con secuencias genómicas bien anotadas, estas ventajas han hecho de la cucaracha americana, Periplaneta americana, un importante modelo de insecto hemimetábolo. Limitado por la escasez de estrategia de knockout, el knockdown de genes efectivo basado en la interferencia de ARN (RNAi) se convierte en una técnica indispensable en la investigación de genes funcionales de P. americana. El presente protocolo describe las técnicas de operación de ARNi en P. americana. El protocolo incluye (1) la selección de la P. americana en las etapas de desarrollo adecuadas, (2) la preparación para el ajuste de la inyección, (3) la inyección de dsRNA y (4) la detección de la eficiencia de derribo de genes. El ARNi es una poderosa herramienta genética inversa en P. americana. La mayoría de los tejidos de P. americana son sensibles al dsRNA extracelular. Su simplicidad permite a los investigadores obtener rápidamente fenotipos disfuncionales bajo una o múltiples inyecciones de dsRNA dirigidas, lo que permite a los investigadores utilizar mejor la P. americana para estudios de desarrollo y metamórficos.

La Figura 1 muestra una inyección exitosa. La jeringa de microinyección con una aguja de micro diámetro debe colocarse horizontalmente en el amplificador (Figura 1A). La aguja se inserta a través del espacio entre dos somitas abdominales horizontalmente contra la epidermis (Figura 1B). Asegúrese de que el líquido entre en el abdomen de P. americana . El ángulo demasiado pronunciado de la aguja dañará los ?...

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Applications of RNA Interference in American Cockroach

El presente protocolo describe las pautas paso a paso para las técnicas de operación de ARNi en P. americana.

Aplicaciones de la interferencia de ARN en cucarachas americanas

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous ...

El protocolo proporciona una forma sencilla de estudiar las cucarachas americanas. Una plaga sanitaria común y un insecto beneficioso para la medicina tradicional china. Ayudará a explorar los mecanismos moleculares de múltiples actividades de la vida de las cucarachas americanas al derribar genes específicos.La principal ventaja de esta tecnología es que puede derribar genes en cucarachas americanas u otros insectos similares que no son adecuados para la edición de genes. Esta tecnología se puede utilizar para explorar diversos campos, como la regulación genética y epigenética, el proceso de desarrollo de tejidos, la regeneración de apéndices, el comportamiento de apareamiento y otros lados interesantes de la cucaracha americana. Esta tecnología es fácil de operar y versátil.Sugerimos mantener a los animales sanos durante el tratamiento de inyección de DSRA. Creo que los novatos pueden dominar fácilmente esta técnica después de varias sesiones de práctica. Para comenzar, separe las ninfas eclosionadas de las ootecas con un tamiz de apertura de cuatro milímetros.Elija el blanco recién malteado P.americana con un tubo de vidrio. Coloque el P.americana en recipientes nuevos y espere la etapa correcta para el tratamiento. En el sistema de reacción, agregue 10 microlitros de tampón T7 2X, 2 microlitros de la mezcla de enzimas T7 Express y dos microgramos de producto de PCR.Finalmente, componga el volumen total a 20 microlitros con agua destilada doble. Mezcle suavemente boca abajo manualmente e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos, luego 70 grados Celsius durante 10 minutos. Diluir 4 microgramos por solución de RNasa A de microlitro con agua DEPC en una proporción de 1 a 200.Luego agregue 1 microlitro de una unidad por microlitro RQ1 RNase Free Dnase y 1 microlitro de solución diluida de RNasa A diluida al sistema. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Luego agregue el 10% del volumen total de acetato de sodio y tres volúmenes del volumen total de isopropanol.Mezcle suavemente boca abajo manualmente, luego colóquelo en hielo durante cinco minutos y centrífique a 13, 000 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Retire el sobrenadante con una pipeta. A continuación, lave el residuo con etanol al 75%, con un 25% de agua tratada con DEPC, luego centrífuga a 13, 000 g durante 5 minutos a 4 grados centígrados.Retire el sobrenadante nuevamente, seque al aire el pellet durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego disuelva el ARN de doble cadena con aproximadamente 100 microlitros de agua DEPC y diluya hasta la concentración final de 2 microgramos por microlitro. Configure el programa en la bomba de microinyección para asegurarse de que el volumen de cada inyección sea consistente.Luego limpie la jeringa llenándola con agua DEPC de 8 a 10 veces. Instale la jeringa de 10 microlitros en la bomba de microinyección. Luego inicie la bomba y llene la jeringa con 10 microlitros de solución de ARN de doble cadena.Anestesia las cucarachas con dióxido de carbono, luego recógelas suavemente con pinzas y entrega la cucaracha hacia la aguja a mano. A continuación, inserte la aguja a través del espacio entre dos somitas abdominales horizontalmente contra la epidermis. Inyecte la solución de ARN de doble cadena en la cucaracha asegurándose de que la punta de la aguja esté lo más cerca posible de la epidermis para evitar dañar los órganos internos.Finalmente, saque la punta de la aguja. Coloque las cucarachas inyectadas en recipientes limpios de bioensayo. Espere unos 10 a 20 minutos para que se recuperen de los efectos del dióxido de carbono.Etiquete los envases con la fecha de inyección, tipo y dosis de ARN de doble cadena y edad de la P.americana. Se seleccionaron genes Ddc o DOPA descarboxilasa y Dpp o decapentapléjicos como dos ejemplos para observar el fenotipo de las cucarachas malteadas después de la inyección de ARN de doble cadena y dsMocK que no tiene diana en los animales se tomó como control negativo. La eficiencia del ARNi se detectó mediante PCR qRT.Los genes fueron derribados significativamente con un valor de P de menos de 0,01 para dsDdc y menos de 0,05 para dsDpp. P.americana con genes Ddc de derribo tenía la epidermis blanca debido a la melanización bloqueada. En el experimento con inyecciones de dsDpp, el ARNi interrumpió la regeneración de las extremidades.Los insectos deben estar sanos e inyectados sin daño. Esta tecnología proporciona una forma sencilla de explorar las funciones genéticas de los insectos que no se pueden editar genéticamente, como la cucaracha americana.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Análisis de la transcripción por ARN naciente de FISH<em&gt; En Vivo</em&gt; Células trofoblásticas gigantes o<em&gt; In Vitro</em&gt; Los cultivos a corto plazo de Ectoplacental Cono explantes

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Investigación

Biología del Desarrollo

A Modified Trier Social Stress Test for Vulnerable Mexican American Adolescents

Una Prueba de Estrés Social Modificada de Trier para Adolescentes Mexicanos Vulnerables

The Trier Social Stress Test (TSST) is a well validated and widely used social stressor that has been shown to induce a 2-4 fold increase in cortisol, the ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Procesamiento de tejido cardiaco humano hacia la matriz extracelular autoensamblada hidrogel para aplicaciones In Vivo y In Vitro

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Ingeniería Genética de Organoides Intestinales de Ratón Primario utilizando Vectores Virales de Transducción de Nanopartículas Magnéticas para Seccionamiento Congelado

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization

Delgada película compuesto silicio elastómeros para aplicaciones de piel y cultivo celular: fabricación y caracterización

In this protocol, we present methods to fabricate thin elastomer composite films for advanced cell culture applications and for the development of skin ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Basado en el ARN la reprogramación de fibroblastos primarios de humanos en células madre pluripotentes inducidas

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Disección, cultivo y análisis de células de cresta neural craneal primarias de ratón para el estudio de la delaminación y migración de células de cresta neuronal

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Preparación de pequeñas bibliotecas de ARN para la secuenciación de embriones de ratón tempranos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Un protocolo para la inmunohistoquímica y la distribución in situ de ARN dentro del embrión temprano de Drosophila

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...