Name: quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

تم دعم تطوير هذه التقنية من خلال الأموال المقدمة من خطة البحث والتطوير الرئيسية الوطنية لوزارة العلوم والتكنولوجيا (2018YF0902604) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية التابعة لصندوق أبحاث الصين للعلماء الشباب الدوليين (22050410270) والصناديق الخارجية لمعاهد شنتشن للتكنولوجيا المتقدمة (DWKF20190001). نود أن نقدم خالص امتناننا للآنسة تشن شينيي لمساعدتها في التدقيق اللغوي للوثيقة وإدارة المختبر.

1. إعداد لوحات سرب التدرج
<ol><li>إعداد وسط سرب ملاحظة: انظر قسم المناقشة للحصول على مقارنة موجزة بين مختلف اللزوجة المتوسطة؛ تم استخدام 0.7٪ (ث / v) تركيز أجار من وسط السرب في هذا البروتوكول.<ol>
<li>تحضير مسحوق مرق Lysogeny (LB) مع أجار في قارورتين مخروطيتين ؛ تحتوي كل قارورة على 2 غرام من الترب...

<ol>
	<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+swarming:+a+re-examination+of+cell-movement+patterns.">Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.</a> Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+environmental+factors+influence+the+importance+of+the+phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+swarming.">Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).</li><li>Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+plant-associated+bacteria.">Swarming motility in plant-associated bacteria.</a> Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).</li><li>Jones, H. E., Park, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+medium+composition+on+the+growth+and+swarming+of+Proteus.">The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus.</a> Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).</li><li>Su, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+viscosity+of+healthy+and+diseased+human+mucins+on+the+motility+of+Helicobacter+pylori.">Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori.</a> Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Funfhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+and+biofilm+formation+of+Paenibacillus+larvae,+the+etiological+agent+of+American+Foulbrood+of+honey+bees+(Apis+mellifera).">Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera).</a> Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).</li><li>Armbruster, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+ability+of+compounds+to+induce+swarming.">Testing the ability of compounds to induce swarming.</a> Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).</li><li>Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+development+of+swarming+communities+of+Bacillus+subtilis+168+and+a+natural+wild+type:+critical+effects+of+surfactin+and+the+composition+of+the+medium.">Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).</li><li>Ingham, C. J., Ben Jacob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+and+complex+pattern+formation+in+Paenibacillus+vortex+studied+by+imaging+and+tracking+cells.">Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells.</a> BMC Microbiology. 8, 36 (2008).</li><li>Shimada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+local+cell+density+on+concentric+ring+colony+formation+by+bacterial+species+Bacillus+subtilis.">Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).</li><li>Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulated+swarming+motility+and+migratory+behavior+in+bacteria.">Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria.</a> Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).</li><li>Lindum, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acyl-L-homoserine+lactone+autoinducers+control+production+of+an+extracellular+lipopeptide+biosurfactant+required+for+swarming+motility+of+Serratia+liquefaciens+MG1.">N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).</li><li>Wang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+swarming+and+virulence+factor+expression+in+Proteus+mirabilis+by+resveratrol.">Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol.</a> Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).</li><li>Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enzymatic+production+of+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP+by+the+diguanylate+cyclase+YdeH+from+E.+coli.">Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).</li><li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+requires+the+MotAB+stator.">Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator.</a> Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).</li><li>Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cellular+differentiation+and+single+cell+imaging+of+Vibrio+parahaemolyticus+swimmer+and+swarmer+cells.">Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).</li><li>Bru, J. L., Siryaporn, A., H&#248;yland-Kroghsbo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+bacterial+swarms+and+the+collective+stress+response.">Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).</li><li>H&#246;lscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+spatial+segregation+in+surface+colonizing+microbial+populations.">Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).</li><li>Yeung, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+ring+patterns+in+bacterial+colonies+exposed+to+ultraviolet+radiation.">Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation.</a> Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).</li><li>Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+behavior,+growth,+and+swarming+formation+of+Escherichia+coli+and+Staphylococcus+aureus+in+culture+medium+modified+with+silver+nanoparticles.">Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles.</a> Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis.">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li><li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility.">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+swarming+motility,+biosurfactant+synthesis,+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li></ol>

يمكن أن يكون التحقيق في حركة الاحتشاد البكتيري على ألواح التدرج شبه الصلبة مهمة صعبة18،19،20 ، لأنها تنطوي على عوامل متعددة مثل لزوجة الركيزة والرطوبة والمكونات المتوسطة. من بين هذه العوامل ، يلعب تركيز الأجار دورا حاسما في تحديد الارتداد ?...

تشير حركية الاحتشاد البكتيري إلى الهجرة الجماعية للخلايا البكتيرية عبر سطح المادة. بالإضافة إلى ألواح الأجار شبه الصلبة المعدة خصيصا في المختبر1، لوحظ هذا النمط الظاهري أيضا على بعض الركائز الرخوة مثل الأنسجة الحيوانية2 والأسطح المائية3 وجذور النباتات4. في حين يعتبر السطح شبه الصلب أحد الشروط الأساسية لاحتشاد البكتيريا، فإن بعض الأنواع تتطلب أيضا وسيطا غنيا بالطاقة لدعم حركتها الكثيفة5. يعمل دوران السوط على كل من السباحة والسباحة الحركية - تصف السباحة الحركة أحادية الخلية داخل بيئة سائلة ، في حين أن السرب هو الحركة المتزامنة لمجموعة ميكروبية عبر الأسطح شبه الصلبة.
لزوجة الركيزة تؤثر على الحركة البكتيرية. وقد أظهرت الدراسات التي أجريت على الميكروبات المسببة للأمراض، مثل هيليكوباكتر بيلوري، أن حركية العامل الممرض تتغير اعتمادا على لزوجة طبقة الميوسين، التي تتأثر بالتحمض البيئي في المضيف البشري6. لتكرار هذه البيئات ، فإن الدراسات السابقة التي استخدمت تركيز أجار أعلى من 0.3٪ (ث / v) تقيد حركة السباحة البكتيرية لإحداث تحول تدريجي في الاحتشاد السطحي. إن استخدام تركيز الأجار فوق 1٪ (ث / ف) يمنع حركة الاحتشاد للعديد من الأنواع 7. أنماط المستعمرة التي تشكلت على السطح متنوعة ، بما في ذلك mat8 عديمة الميزات ، عين الثور 9 ، التشعبات 10 ، والدوامة11.
وعلى الرغم من أن أهمية هذه الأنماط لا تزال غير واضحة، يبدو أن هذه الأنماط تعتمد على الإشارات البيئية والكيميائية12. تغطي الإشارات البيئية جوانب مختلفة ، بما في ذلك درجة الحرارة والملوحة والضوء ودرجة الحموضة ، في حين تشمل الإشارات الكيميائية وجود جزيئات استشعار النصاب الميكروبي ، والمنتجات الثانوية الكيميائية الحيوية ، والمواد المغذية. يمكن أن تؤثر جزيئات إشارات استشعار النصاب الذاتي مثل AHL (N-hexanoyl-L homoserine lactone) على الحشود السطحية من خلال تنظيم إنتاج الفاعل بالسطح13,14. ريسفيراترول ، وهو مركب فيتواليكسين ، يمكن أن يحد من حركة الاحتشاد البكتيري 15.
في هذا العمل ، نقوم بالتحقيق في تأثير تركيزات التدرج من ريسفيراترول على سلالة الإشريكية القولونية K12 من النوع البري ونحقق في حركية السرب المستحثة بأرابينوز لأنواع E. coli K12-YdeH و Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. يتم تحفيز إنتاج إنزيم YdeH بواسطة arabinose عبر مروج araBAD ، مما يؤدي إلى اضطراب c-di-GMP الخلوي ويؤثر على حركية الاحتشاد البكتيري 16,17. تتم دراسة سلوك الاحتشاد المستحث هذا باستخدام ألواح سرب التدرج أرابينوز مع سلالات E. coli K12-YdeH و P. aeruginosa PAO1-YdeH.
يتم تحضير ألواح السرب المتدرجة عن طريق تصلب وسط مزدوج الطبقة على التوالي (الشكل 1B). تتكون الطبقة السفلية من الوسط المضاف مع المحفز ، ويسكب على جانب واحد من طبق بتري مدعوم. عند تصلب الطبقة السفلية ، يتم إرجاع طبق بتري إلى سطح مستو ، حيث تتم إضافة الطبقة العليا التي تحتوي على الوسط بدون المحفز من الجانب الآخر من اللوحة. بعد أن يتم تصلب ألواح السرب بالكامل ، يتم إنتاج آبار الاحتفاظ المرتبة بشكل متساوي القياس عن طريق ثقوب مملة على ألواح السرب بعد تخطيط ثابت (الشكل 1C) أو عن طريق طباعة الآبار باستخدام نموذج مطبوع ثلاثي الأبعاد لغطاء اللوحة يحتوي على أوتاد أثناء عملية المعالجة المتوسطة (الشكل التكميلي S1). يستخدم نظام التصوير الهلامي لالتقاط مورفولوجيات السرب في نقاط زمنية مختلفة (الشكل 2). يوفر تحليل الاحتشاد السطحي باستخدام برنامج ImageJ (الشكل التكميلي S2) نتائج كمية لعملية الاحتشاد السطحي (الشكل 3).
وبالتالي ، نقترح طريقة بسيطة لاختبار حركة السرب السطحي داخل نطاق تركيز من المحرضات. يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار استجابات تركيز متعددة للمحفزات الأخرى عن طريق خلط المحفز في وسط الطبقة السفلية ويمكن تطبيقها على الأنواع المتحركة الأخرى (على سبيل المثال ، Bacillus subtilis ، Salmonella enterica ، Proteus mirabilis ، Yersinia enterocolitica). يمكن أن يوفر هذا النهج نتائج نوعية وكمية موثوقة لفحص محفز كيميائي واحد ، ويمكن استخدام لوحات منفصلة لتقييم المزيد من المحفزات الكيميائية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8180</td>
			<td>25 g, &#8805; 85% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>D103272</td>
			<td>AR, &#62; 99% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Arabinose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A106195</td>
			<td>98% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM90-15</td>
			<td>Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resveratrol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>R107315</td>
			<td>99% (GC), 25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S805275</td>
			<td>AR, 99.5% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM130F</td>
			<td>Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>Blue pard</td>
			<td>LRH-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 5200multi imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>5200CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates

حركة الاحتشاد البكتيري هي نمط ظاهري ميكروبيولوجي شائع تستخدمه المجتمعات البكتيرية للهجرة فوق الأسطح شبه الصلبة. في التحقيقات المتعلقة بحركية السرب المستحثة ، قد لا يتمكن التركيز المحدد للمحفز من الإبلاغ عن الأحداث التي تحدث ضمن نطاق التركيز الأمثل للحصول على الاستجابات المطلوبة من الأنواع. تستخدم الصفائح شبه الصلبة التي تحتوي على تركيزات متعددة بشكل شائع للتحقيق في الاستجابة داخل نطاق تركيز المحرض. ومع ذلك ، فإن الألواح شبه الصلبة المنفصلة تزيد من الاختلافات في اللزوجة المتوسطة ومحتوى الرطوبة داخل كل لوحة بسبب وقت التصلب غير المنتظم.
تصف هذه الورقة طريقة من خطوة واحدة لاختبار حركة الاحتشاد السطحي في وقت واحد على لوحة تدرج واحدة ، حيث تسمح آبار الاختبار المرتبة بشكل متساوي القياس بالاكتساب المتزامن للاستجابات متعددة التركيزات. في هذا العمل ، تم تقييم الاحتشاد السطحي للإشريكية القولونية K12 و Pseudomonas aeruginosa PAO1 استجابة لتدرج تركيز المحفزات مثل ريسفيراترول وأرابينوز. بشكل دوري ، تم تصوير مورفولوجيات السرب باستخدام نظام تصوير لالتقاط عملية احتشاد السطح بأكملها.
تم الحصول على القياس الكمي لمورفولوجيا السرب باستخدام برنامج ImageJ ، مما يوفر معلومات قابلة للتحليل لمنطقة السرب. تقدم هذه الورقة طريقة بسيطة لصفيحة سرب التدرج توفر معلومات نوعية وكمية حول تأثيرات المحفزات على الحشود السطحية ، والتي يمكن توسيعها لدراسة آثار المحفزات الأخرى على مجموعة أوسع من الأنواع البكتيرية المتحركة.

يوضح الشكل 1B سير العمل الذي يتكون من إعداد ألواح سرب متدرجة ، والتلقيح ، والحضانة. لإنشاء ألواح سباحة متدرجة ، يتم سكب وسط الطبقة السفلية في أطباق مدعومة عند ~ 4.3 درجة من المستوى الأفقي (الشكل التكميلي S3) ، متبوعا بصب وسط الطبقة العليا بعد تصلب الطبقة السفلية بالكام?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

هنا ، نصف استخدام لوحات التدرج المحفزة لتقييم حركة الاحتشاد البكتيري مع الحصول في نفس الوقت على استجابات تركيز متعددة.

قياس حركة احتشاد السطح البكتيري على ألواح التدرج المحفزة

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

يتتبع البروتوكول في وقت واحد استجابات الحشود البكتيرية لتركيزات محفزات مختلفة على أجار شبه صلب. ويتحقق ذلك بطريقة فعالة من حيث التكلفة. تنفي تقنية الفحص عالية الإنتاجية هذه الحاجة إلى أجار بتركيزات محفزة مختلفة لمراقبة الاستجابات الكيميائية الدقيقة.تم تصميم هذه التقنية لفحص الأدوية وأيضا لمراقبة استجابات SD لمسببات الأمراض الدقيقة. أيضا ، يمكن استخدامه لدراسة الاستجابات الدقيقة لمختلف الإشارات الكيميائية الحيوية في المضيف البشري. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على التاكسي الكيميائي البكتيري.سوف تستجيب البكتيريا لتركيزات مختلفة من الجاذبات الكيميائية المعروفة باسم chemotaxis الإيجابية أو المواد الطاردة الكيميائية المعروفة باسم chemotaxis السلبية. يعد الإعداد المعد بعناية ضروريا لتجنب الاختلافات بين زاوية الجل في الطبقة السفلية لمنع مشكلة التكاثر. للبدء ، ضع علامة على أطباق بتري 13 × 13 سم مربع مع البقع وأسماء المحرضات.ثم ادعم الأطباق على حافة الأغطية. أضف محلول أرابينوز إلى وسط الطبقة السفلية الدافئ. أضف 40 ملليلتر من الطبقة السفلية الدافئة المتوسطة.اسمح لوسط الطبقة السفلية بالشفاء المكشوف لمدة ساعة واحدة داخل غطاء التدفق الرقائقي دون عائق. بمجرد تصلب الطبقة السفلية بالكامل ، قم بإزالة الأغطية ووضع أطباق Petri داخل غطاء تدفق صفائحي. أضف 40 ملليلتر من وسط الطبقة العليا الدافئ باستخدام مرشح ماصة آلي.عالج الألواح ذات الطبقة المزدوجة المغطاة وغير المضطربة لمدة ساعة واحدة ، ثم قم بتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة. ضع الورق A4 المميز تحت لوحة تدرج صلبة جيدا. ادفع الجانب الأوسع من طرف ماصة سعة 100 ميكرولتر إلى السطح المتوسط شبه الصلب في الموضع المحدد واضغط على طرف الماصة حتى يصل إلى الجزء السفلي من وسط الطبقة العليا.عندما يلمس الطرف الجزء السفلي ، توقف عن تطبيق أي قوة رأسية على الطرف وقم بتدوير الطرف برفق لعزل محتوى البئر الأسطواني. حرك طرف الماصة أفقيا على طول مسافة صغيرة للسماح بتدفق الهواء إلى المكان الضيق الموضوعة جانبا. اضغط على الطرف بإصبع السبابة لمنع تدفق الغاز داخل الطرف.اسحب الطرف للخارج عموديا ، مع الحفاظ على محتوى البئر في الطرف أثناء سحبه للخارج. أضف 80 ميكرولتر من ثقافة النمو بين عشية وضحاها إلى كل بئر. أخرج ألواح السرب من الحاضنة واحدة تلو الأخرى كل 12 ساعة وضعها في نظام التصوير الهلامي.حدد وضع التصوير الهلامي ، وقم بتعريض لوحة السرب للضوء الأبيض ، واضبط البعد البؤري للحصول على رؤية واضحة للأسراب. تعزيز سطوع الأسراب للمراقبة الدقيقة عن طريق ضبط وقت التعرض إلى 300 مللي ثانية. اضبط العتبة لتقليل التداخل من ضوء الخلفية.احفظ ملف الصورة لمزيد من التحليل. سجل وقت التصوير ونوع المحفز واتجاه التدرج والسلالات في ملف txt. انقر على معالجة، ثم على الظلال لتحسين حدة الصورة.انقر فوق العملية متبوعة بدفعة لمعالجة الصورة. ثم قم بمعالجة صورة كمرجع بالنقر فوق عملية وظلال وجنوب. انقر فوق معالجة، دفعة، ماكرو لفتح نافذة العملية الدفعية.ابحث عن الأوامر المعروضة في النافذة. اكتب عنوان مجلد الصور الأصلية في عنوان ملف الإخراج بالنقر فوق عملية في النافذة عملية الدفعية. استخدم أداة تتبع العصا لتحديد الأسراب بشكل فردي وانقر نقرا مزدوجا فوق أداة تتبع العصا لضبط التسامح حتى يتناسب الخط الذي تم إنشاؤه مع حدود السرب بشكل صحيح.انقر على تحليل، ثم قياس لتصدير قيمة المنطقة. تم اختبار E.coli K12 YdeH على ألواح تدرج أرابينوز المستخدمة لإثبات عملية احتشاد السطح مع التداخل الذي يحدث بين الآبار المجاورة. مكنت لوحة تحتوي على ثلاثة آبار اختبار من تشكيل حدود غير متداخلة.تم تعزيز حركة الاحتشاد P.aeruginosa PAO1 YdeH مع زيادة تركيز أرابينوز من أدنى تركيز ، ولكن تم تقييده تدريجيا بتركيزات أعلى من أرابينوز. أظهرت سلالات E.coli K12 من النوع البري التي تم اختبارها على ألواح تدرج ريسفيراترول ضمن نطاق تركيز صفر إلى 400 ميكرولتر تقييدا متواضعا لحركية الاحتشاد مع زيادة تركيز ريسفيراترول. تم تحديد مناطق السرب كميا بواسطة برنامج ImageJ.عرض منحنى الاحتشاد استجابات التركيز المتعددة. الجزء الأكثر أهمية في هذا الإجراء هو تصنيع لوحة سرب مزدوجة الطبقة مع نطاق تركيز محدد من المحرضات. تمكن هذه الطريقة الباحثين من التحقيق في احتشاد السطح المستحث ضمن نطاق تركيز محدد وتحديد آثار المحفزات والمكونات الأخرى على الاحتشاد.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

تقييم جدوى اتحاد البكتيرية الاصطناعية على واجهة المضيف-ميكروب القناة الهضمية في المختبر

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

عزل جلوميرولي و في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

تصور سطح T-خلية مستقبلات ديناميات رباعية الأبعاد باستخدام شعرية الضوء ورقة المجهر

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

مقايسة حركية بلاناية لقياس خصائص المنتجات الطبيعية ذات الخواص الحيوية

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

تجزئة الخلايا لخلايا U937 عن طريق تنقية التدرج بكثافة isopycnic

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

التعديلات الخاصة بالميوزين في المختبر المضان المقايسات الحركية المستندة إلى المجهر

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

كثافة التدرج الطرد الفائق للتحقيق في إعادة تدوير الغدد الصماء في خلايا الثدييات

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

التنميط المتعدد بدون صانعي التدرج أو أنظمة التجزئة

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...