Name: quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

Udviklingen af denne teknik blev støttet af midlerne fra Ministeriet for Videnskab og Teknologis National Key R&D-plan (2018YF0902604), National Natural Science Foundation of China's Research Fund for International Young Scientists (22050410270) og Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001). Vi vil gerne tilbyde vores oprigtige taknemmelighed til frøken Chen Xinyi for hendes hjælp til korrekturlæsning af dokumentet og laboratorieledelsen.

1. Forberedelse af gradientsværmplader
<ol><li>Forberedelse af sværmmedium BEMÆRK: Se diskussionsafsnittet for en kort sammenligning af forskellige mellemstore viskositeter; 0,7% (w/v) agarkoncentration af sværmmedium blev anvendt i denne protokol.<ol>
<li>Forbered Lysogeny bouillon (LB) pulver med agar i to koniske kolber; hver kolbe indeholder 2 g trypton, 2 g natriumchlorid, 1 g gærekstrakt og 1,4 g agar. Tilsæt dobbeltdestilleret vand (ddH2O) og rør suspensionen ved hjælp af e...

<ol>
	<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+swarming:+a+re-examination+of+cell-movement+patterns.">Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.</a> Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+environmental+factors+influence+the+importance+of+the+phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+swarming.">Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).</li><li>Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+plant-associated+bacteria.">Swarming motility in plant-associated bacteria.</a> Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).</li><li>Jones, H. E., Park, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+medium+composition+on+the+growth+and+swarming+of+Proteus.">The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus.</a> Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).</li><li>Su, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+viscosity+of+healthy+and+diseased+human+mucins+on+the+motility+of+Helicobacter+pylori.">Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori.</a> Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Funfhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+and+biofilm+formation+of+Paenibacillus+larvae,+the+etiological+agent+of+American+Foulbrood+of+honey+bees+(Apis+mellifera).">Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera).</a> Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).</li><li>Armbruster, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+ability+of+compounds+to+induce+swarming.">Testing the ability of compounds to induce swarming.</a> Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).</li><li>Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+development+of+swarming+communities+of+Bacillus+subtilis+168+and+a+natural+wild+type:+critical+effects+of+surfactin+and+the+composition+of+the+medium.">Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).</li><li>Ingham, C. J., Ben Jacob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+and+complex+pattern+formation+in+Paenibacillus+vortex+studied+by+imaging+and+tracking+cells.">Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells.</a> BMC Microbiology. 8, 36 (2008).</li><li>Shimada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+local+cell+density+on+concentric+ring+colony+formation+by+bacterial+species+Bacillus+subtilis.">Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).</li><li>Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulated+swarming+motility+and+migratory+behavior+in+bacteria.">Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria.</a> Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).</li><li>Lindum, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acyl-L-homoserine+lactone+autoinducers+control+production+of+an+extracellular+lipopeptide+biosurfactant+required+for+swarming+motility+of+Serratia+liquefaciens+MG1.">N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).</li><li>Wang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+swarming+and+virulence+factor+expression+in+Proteus+mirabilis+by+resveratrol.">Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol.</a> Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).</li><li>Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enzymatic+production+of+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP+by+the+diguanylate+cyclase+YdeH+from+E.+coli.">Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).</li><li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+requires+the+MotAB+stator.">Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator.</a> Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).</li><li>Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cellular+differentiation+and+single+cell+imaging+of+Vibrio+parahaemolyticus+swimmer+and+swarmer+cells.">Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).</li><li>Bru, J. L., Siryaporn, A., H&#248;yland-Kroghsbo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+bacterial+swarms+and+the+collective+stress+response.">Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).</li><li>H&#246;lscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+spatial+segregation+in+surface+colonizing+microbial+populations.">Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).</li><li>Yeung, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+ring+patterns+in+bacterial+colonies+exposed+to+ultraviolet+radiation.">Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation.</a> Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).</li><li>Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+behavior,+growth,+and+swarming+formation+of+Escherichia+coli+and+Staphylococcus+aureus+in+culture+medium+modified+with+silver+nanoparticles.">Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles.</a> Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis.">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li><li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility.">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+swarming+motility,+biosurfactant+synthesis,+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li></ol>

Undersøgelse af bakteriel sværmende bevægelighed på halvfaste gradientplader kan være en udfordrende opgave18,19,20, da den involverer flere faktorer såsom substratviskositet, fugtighed og mellemstore komponenter. Blandt disse faktorer spiller agarkoncentration en afgørende rolle i bestemmelsen af mikrobiel tilbagevenden til enten svømning eller sværmende bevægelighed. Da agarkoncentrationen stiger fra 0,3 % (w/v) til ...

Bakteriel sværmende bevægelighed refererer til den kollektive migration af bakterieceller over overfladen af et stof. Ud over halvfaste agarplader, der er specielt fremstillet i laboratoriet1, observeres denne fænotype også på nogle bløde substrater såsom animalsk væv2, hydrerede overflader3 og planterødder4. Mens en halvfast overflade betragtes som en af de grundlæggende betingelser for bakteriesværmning, kræver nogle arter også et energirigt medium for at understøtte deres sværmende bevægelighed5. Flagella rotationskræfter både svømning og sværmende motilitetssvømning beskriver den encellede bevægelighed i et flydende miljø, mens sværmning er den synkrone bevægelse af en mikrobiel population på tværs af halvfaste overflader.
Substratviskositet påvirker bakteriel bevægelighed; undersøgelser af patogene mikrober, såsom Helicobacter pylori, har vist, at patogenets bevægelighed ændres afhængigt af mucinlagets viskositet, som påvirkes af miljøforsuring i den menneskelige vært6. For at replikere disse miljøer begrænser tidligere undersøgelser ved hjælp af agarkoncentration over 0,3% (w / v) bakteriel svømmemotilitet for at gennemføre et gradvist skift til overfladesværmning. Anvendelsen af agarkoncentration over 1 % (w/v) forhindrer sværmende bevægelighed hos mange arter7. Kolonimønstrene dannet på overfladen er forskellige, herunder funktionsløs mat8, bull's eye9, dendritter10 og hvirvel11.
Selv om relevansen af sådanne mønstre fortsat er uklar, synes disse mønstre at være afhængige af miljømæssige og kemiske signaler12. Miljømæssige signaler dækker forskellige aspekter, herunder temperatur, saltholdighed, lys og pH, mens kemiske signaler omfatter tilstedeværelsen af mikrobielle quorum sensing molekyler, biokemiske biprodukter og næringsstoffer. Autoinducer quorum sensing signalmolekyler såsom AHL (N-hexanoyl-L homoserin lacton) kan påvirke overflade sværmning ved at regulere produktionen af overfladeaktivt stof13,14. Resveratrol, en phytoalexinforbindelse, kan begrænse bakteriel sværmende bevægelighed15.
I det foreliggende arbejde undersøger vi effekten af gradientkoncentrationer af resveratrol på vildtype Escherichia coli K12 stamme og undersøger arabinose-inducerbar sværmende bevægelighed af konstruerede E. coli K12-YdeH og Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH arter. Produktionen af YdeH-enzymet induceres af arabinose via araBAD-promotoren, hvilket resulterer i cellulær c-di-GMP-forstyrrelse og påvirker bakteriesværmningsmotiliteten16,17. Denne inducerbare sværmningsadfærd studeres ved hjælp af arabinose gradient sværmplader med E. coli K12-YdeH og P. aeruginosa PAO1-YdeH stammer.
Gradientsværmpladerne fremstilles ved successivt størkning af dobbeltlagsmedium (figur 1B). Bundlaget består af mediet tilsat med induktoren, hældt på den ene side af en proppet petriskål. Ved størkning af bundlaget returneres petriskålen til en plan overflade, hvor det øverste lag, der indeholder mediet uden induktoren, tilsættes fra den anden side af pladen. Efter at sværmpladerne er fuldstændig størknet, produceres isometrisk arrangerede holdebrønde ved boring af huller på sværmpladerne efter et fast layout (figur 1C) eller ved at præge brøndene ved hjælp af en 3D-trykt model af pladedækslet, der indeholder pinde under mediumhærdningsprocessen (supplerende figur S1). Et gelbilleddannelsessystem bruges til at fange de sværmende morfologier på forskellige tidspunkter (figur 2). Analyse af overfladesværmning ved hjælp af ImageJ-software (supplerende figur S2) giver kvantitative resultater af overfladesværmningsprocessen (figur 3).
Således foreslår vi en simpel metode til at teste overfladesværmende bevægelighed inden for et koncentrationsområde af induktorer. Denne metode kan bruges til at teste flere koncentrationsresponser fra andre induktorer ved at blande induktoren i bundlagsmediet og kan anvendes på andre bevægelige arter (f.eks . Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Denne tilgang kan give pålidelige kvalitative og kvantitative resultater til screening af en enkelt kemisk induktor, og der kan anvendes separate plader til at evaluere flere kemiske induktorer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8180</td>
			<td>25 g, &#8805; 85% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>D103272</td>
			<td>AR, &#62; 99% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Arabinose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A106195</td>
			<td>98% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM90-15</td>
			<td>Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resveratrol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>R107315</td>
			<td>99% (GC), 25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S805275</td>
			<td>AR, 99.5% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM130F</td>
			<td>Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>Blue pard</td>
			<td>LRH-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 5200multi imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>5200CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates

Bakteriel sværmende bevægelighed er en almindelig mikrobiologisk fænotype, som bakteriesamfund bruger til at migrere over halvfaste overflader. I undersøgelser af induceret sværmende bevægelighed kan en specifik koncentration af en inducer muligvis ikke rapportere hændelser, der forekommer inden for det optimale koncentrationsområde for at fremkalde de ønskede reaktioner fra en art. Halvfaste plader indeholdende flere koncentrationer anvendes almindeligvis til at undersøge responsen inden for et inducerkoncentrationsområde. Imidlertid øger separate halvfaste plader variationer i medium viskositet og fugtindhold i hver plade på grund af uensartet størkningstid.
Dette papir beskriver en et-trins metode til samtidig at teste overfladesværmende bevægelighed på en enkelt gradientplade, hvor de isometrisk arrangerede testbrønde muliggør samtidig erhvervelse af multikoncentrationsresponser. I det foreliggende arbejde blev overfladesværmen af Escherichia coli K12 og Pseudomonas aeruginosa PAO1 evalueret som reaktion på en koncentrationsgradient af induktorer såsom resveratrol og arabinose. Med jævne mellemrum blev sværmmorfologierne afbildet ved hjælp af et billeddannelsessystem til at fange hele overfladesværmningsprocessen.
Den kvantitative måling af sværmmorfologierne blev erhvervet ved hjælp af ImageJ-software, der gav analyserbar information om sværmområdet. Dette papir præsenterer en simpel gradient sværmplademetode, der giver kvalitativ og kvantitativ information om induktorernes virkninger på overfladesværmning, som kan udvides til at studere virkningerne af andre induktorer på en bredere vifte af bevægelige bakteriearter.

Arbejdsgangen bestående af fremstilling af gradientsværmplader, podning og inkubation er vist i figur 1B. For at generere gradient svømmede plader hældes bundlagsmediet i proppede tallerkener på ~ 4,3 ° fra det vandrette plan (supplerende figur S3) efterfulgt af hældning af det øverste lagmedium, efter at bundlaget er fuldstændigt størknet. Sammensætningen af dobbeltlagsmediet er vist i tabel 1. Derefter pipetteres bakteriekultur, der dyrkes natte...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Her beskriver vi brugen af inducergradientplader til at evaluere bakteriel sværmningsmotilitet og samtidig opnå flere koncentrationsresponser.

Kvantificering af bakteriel overflade sværmende bevægelighed på induktorgradientplader

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Protokollen sporer samtidig bakterielle sværmende reaktioner på forskellige induktorkoncentrationer på en halvfast agar. Dette opnås på en omkostningseffektiv måde. Denne screeningsteknik med høj gennemstrømning negerer behovet for agar med forskellige inducerkoncentrationer for at observere de mikrokemotaktiske reaktioner.Teknikken er designet til lægemiddelscreening og også til at observere mikropatogen SD-responser. Det kan også bruges til at studere mikroresponser på forskellige biokemiske signaler i den menneskelige vært. Denne metode kan give indsigt i bakteriel kemotaxis.Bakterier vil reagere på forskellige koncentrationer af kemiske tiltrækningsmidler kendt som positive kemotaxis eller kemiske afskrækningsmidler kendt som negativ kemotaxis. En omhyggeligt forberedt opsætning er afgørende for at undgå variationer mellem gelvinklen på det nederste lag for at forhindre reproducerbarhedsproblemet. Til at begynde med skal du mærke 13 ved 13 centimeter firkantede petriskåle med pletter og inducernavne.Støt derefter opvasken op over kanten af lågene. Tilsæt arabinoseopløsning til varmt bundlagsmedium. Tilsæt 40 ml varmt bundlagsmedium.Lad bundlagsmediet hærde utildækket i en time inde i en laminær flowhætte uforstyrret. Når bundlaget er størknet helt, skal du fjerne lågene og lægge petriskålene inde i en laminær flowhætte. Tilsæt 40 ml varmt øvre lagmedium ved hjælp af et motoriseret pipettefilter.Hærd de dobbeltlagsplader, der er dækket og uforstyrret i en time, og opbevar dem derefter ved fire grader Celsius i 24 timer. Anbring det markerede A4-papir under en godt størknet gradientplade. Skub den bredere side af en 100 mikroliter pipettespids ind i den halvfaste mediumoverflade i den markerede position, og tryk på pipettespidsen, indtil den når bunden af det øverste lagmedium.Når spidsen rører bunden, skal du stoppe med at påføre enhver lodret kraft på spidsen og forsigtigt dreje spidsen for at isolere indholdet af den cylindriske brønd. Flyt pipettespidsen vandret langs en lille afstand for at tillade luftstrøm ind i det smalle sted, der er afsat. Tryk på spidsen med pegefingeren for at blokere gasstrømmen inde i spidsen.Træk spidsen lodret ud, og hold brøndindholdet i spidsen, mens du trækker den ud. Tilsæt 80 mikroliter af vækstkulturen natten over i hver brønd. Tag sværmpladerne ud af inkubatoren en ad gangen hver 12. time og læg dem i gelbilleddannelsessystemet.Vælg gelbilleddannelsestilstand, udsæt sværmpladen for hvidt lys, og juster brændvidden for at få et klart overblik over sværme. Forbedr sværmens lysstyrke for præcis observation ved at justere eksponeringstiden til 300 millisekunder. Juster tærsklen for at minimere interferens fra baggrundslyset.Gem billedfilen til yderligere analyse. Optag billedbehandlingstid, inducertype, gradientretning og stammer i en txt-fil. Klik på Behandl og derefter på Skygger for at forbedre billedets skarphed.Klik på Proces efterfulgt af Batch for at behandle billedet. Behandl derefter et billede som reference ved at klikke på Proces, Skygger og Syd. Klik på Proces, Batch, Makro for at åbne vinduet Batchproces.Se efter de kommandoer, der vises i vinduet. Indtast mappeadressen på de originale billeder i outputfiladressen ved at klikke på Proces i vinduet Batchproces. Brug stavsporingsværktøjet til at vælge sværme individuelt, og dobbeltklik på stavsporingsværktøjet for at justere tolerancen, indtil den genererede linje passer korrekt til sværmgrænsen.Klik på Analysér, og mål derefter for at eksportere arealværdien. E.coli K12 YdeH blev testet på arabinose gradientplader, der blev brugt til at demonstrere overfladesværmningsprocessen med overlapning mellem tilstødende brønde. En plade med tre testbrønde muliggjorde dannelsen af ikke-overlappende grænser.P.aeruginosa PAO1 YdeH sværmende bevægelighed blev fremmet med øget arabinosekoncentration fra den laveste koncentration, men gradvist begrænset med højere koncentrationer arabinosekoncentrationer. E.coli K12 vildtypestammer testet på resveratrolgradientplader inden for koncentrationsområdet nul til 400 mikroliter viste en beskeden begrænsning af sværmende bevægelighed med stigende resveratrolkoncentration. Sværmområder blev kvantificeret af ImageJ-software.Sværmende kurve viste de mange koncentrationsreaktioner. Den mest afgørende del af denne procedure er fremstilling af en dobbeltlags sværmplade med et specifikt koncentrationsområde af induktorer. Denne metode gør det muligt for forskere at undersøge den inducerede overflade sværmning inden for et bestemt koncentrationsområde og kvantificere virkningerne af andre induktorer og komponenter på sværmning.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Vurdering af levedygtigheden af en syntetisk bakteriel konsortium på In Vitro Gut Host-mikrobe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolering af Glomeruli og In Vivo mærkning af glomerulær celle overflade proteiner

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-Cell Receptor Dynamics Fire-Dimensionelt Ved hjælp af gitter light-sheet mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

En planarian motilitet assay at måle biomodulerende egenskaber af naturlige produkter

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Cellefraktionering af U937-celler ved isopycnic densitetsgradientrensning

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosin-specifikke tilpasninger af In vitro Fluorescens Mikroskopi-Baserede Motilitet Assays

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Tæthedsgradient ultracentrifugering til undersøgelse af endoytisk genanvendelse i pattedyrceller

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysomprofilering uden gradueringsproducenter eller fraktioneringssystemer

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...