Name: quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

De ontwikkeling van deze techniek werd ondersteund door de fondsen van het National Key R & D-plan van het ministerie van Wetenschap en Technologie (2018YF0902604), National Natural Science Foundation of China's Research Fund for International Young Scientists (22050410270) en Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001). We willen graag onze oprechte dank uitspreken aan Miss Chen Xinyi voor haar hulp bij het proeflezen van het document en laboratoriumbeheer.

1. Bereiding van gradiënt zwermplaten
<ol><li>Bereiding van zwermmedium OPMERKING: Zie de discussiesectie voor een korte vergelijking van verschillende mediumviscositeiten; In dit protocol werd 0,7% (w/v) agarconcentratie van zwermmedium gebruikt.<ol>
<li>Bereid Lysogeny bouillon (LB) poeder met agar in twee conische kolven; elke kolf bevat 2 g trypton, 2 g natriumchloride, 1 g gistextract en 1,4 g agar. Voeg dubbel gedestilleerd water (ddH2O) toe en roer de suspensie met een magnetische...

<ol>
	<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+swarming:+a+re-examination+of+cell-movement+patterns.">Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.</a> Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+environmental+factors+influence+the+importance+of+the+phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+swarming.">Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).</li><li>Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+plant-associated+bacteria.">Swarming motility in plant-associated bacteria.</a> Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).</li><li>Jones, H. E., Park, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+medium+composition+on+the+growth+and+swarming+of+Proteus.">The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus.</a> Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).</li><li>Su, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+viscosity+of+healthy+and+diseased+human+mucins+on+the+motility+of+Helicobacter+pylori.">Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori.</a> Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Funfhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+and+biofilm+formation+of+Paenibacillus+larvae,+the+etiological+agent+of+American+Foulbrood+of+honey+bees+(Apis+mellifera).">Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera).</a> Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).</li><li>Armbruster, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+ability+of+compounds+to+induce+swarming.">Testing the ability of compounds to induce swarming.</a> Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).</li><li>Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+development+of+swarming+communities+of+Bacillus+subtilis+168+and+a+natural+wild+type:+critical+effects+of+surfactin+and+the+composition+of+the+medium.">Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).</li><li>Ingham, C. J., Ben Jacob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+and+complex+pattern+formation+in+Paenibacillus+vortex+studied+by+imaging+and+tracking+cells.">Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells.</a> BMC Microbiology. 8, 36 (2008).</li><li>Shimada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+local+cell+density+on+concentric+ring+colony+formation+by+bacterial+species+Bacillus+subtilis.">Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).</li><li>Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulated+swarming+motility+and+migratory+behavior+in+bacteria.">Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria.</a> Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).</li><li>Lindum, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acyl-L-homoserine+lactone+autoinducers+control+production+of+an+extracellular+lipopeptide+biosurfactant+required+for+swarming+motility+of+Serratia+liquefaciens+MG1.">N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).</li><li>Wang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+swarming+and+virulence+factor+expression+in+Proteus+mirabilis+by+resveratrol.">Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol.</a> Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).</li><li>Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enzymatic+production+of+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP+by+the+diguanylate+cyclase+YdeH+from+E.+coli.">Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).</li><li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+requires+the+MotAB+stator.">Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator.</a> Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).</li><li>Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cellular+differentiation+and+single+cell+imaging+of+Vibrio+parahaemolyticus+swimmer+and+swarmer+cells.">Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).</li><li>Bru, J. L., Siryaporn, A., H&#248;yland-Kroghsbo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+bacterial+swarms+and+the+collective+stress+response.">Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).</li><li>H&#246;lscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+spatial+segregation+in+surface+colonizing+microbial+populations.">Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).</li><li>Yeung, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+ring+patterns+in+bacterial+colonies+exposed+to+ultraviolet+radiation.">Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation.</a> Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).</li><li>Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+behavior,+growth,+and+swarming+formation+of+Escherichia+coli+and+Staphylococcus+aureus+in+culture+medium+modified+with+silver+nanoparticles.">Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles.</a> Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis.">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li><li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility.">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+swarming+motility,+biosurfactant+synthesis,+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li></ol>

Onderzoek naar bacteriële zwermmotiliteit op semisolide gradiëntplaten kan een uitdagende taak zijn18,19,20, omdat het meerdere factoren omvat, zoals substraatviscositeit, vochtigheid en mediumcomponenten. Onder deze factoren speelt de agarconcentratie een beslissende rol bij het bepalen van microbiële terugkeer naar zwemmende of zwermmotiliteit. Naarmate de agarconcentratie toeneemt van 0,3% (w/v) naar 1% (w/v), zal de bacte...

Bacteriële zwermmotiliteit verwijst naar de collectieve migratie van bacteriële cellen over het oppervlak van een stof. Naast semisolide agarplaten die speciaal in het laboratorium zijn bereid1, wordt dit fenotype ook waargenomen op sommige zachte substraten zoals dierlijke weefsels2, gehydrateerde oppervlakken3 en plantenwortels4. Hoewel een halfvast oppervlak wordt beschouwd als een van de fundamentele voorwaarden voor bacteriële zwermen, hebben sommige soorten ook een energierijk medium nodig om hun zwermmotiliteit te ondersteunen5. Flagellarotatie drijft zowel zwemmende als zwermende motiliteit-zwemmen beschrijft de eencellige motiliteit in een vloeibare omgeving, terwijl zwermen de synchrone beweging is van een microbiële populatie over semisolide oppervlakken.
Substraatviscositeit beïnvloedt bacteriële motiliteit; studies van pathogene microben, zoals Helicobacter pylori, hebben aangetoond dat de beweeglijkheid van de ziekteverwekker verandert afhankelijk van de viscositeit van de mucinelaag, die wordt beïnvloed door omgevingsverzuring in de menselijke gastheer6. Om deze omgevingen te repliceren, beperken eerdere studies met een agarconcentratie van meer dan 0,3% (w / v) de bacteriële zwemmotiliteit om een geleidelijke verschuiving naar oppervlaktezwermen te bewerkstelligen. Het gebruik van een agarconcentratie van meer dan 1% (w/v) voorkomt de zwermmotiliteit van veel soorten7. De koloniepatronen die op het oppervlak worden gevormd, zijn divers, waaronder featureless mat8, bull's eye9, dendrieten10 en vortex11.
Hoewel de relevantie van dergelijke patronen onduidelijk blijft, lijken die patronen afhankelijk te zijn van omgevings- en chemische signalen12. Omgevingssignalen hebben betrekking op verschillende aspecten, waaronder temperatuur, zoutgehalte, licht en pH, terwijl chemische signalen de aanwezigheid van microbiële quorumdetectiemoleculen, biochemische bijproducten en voedingsstoffen omvatten. Auto-induceer quorum sensing signaling molecules zoals AHL (N-hexanoyl-L homoserine lacton) kunnen oppervlaktezwermen beïnvloeden door de productie van oppervlakteactieve stof13,14 te reguleren. Resveratrol, een fytoalexineverbinding, zou bacteriële zwermmotiliteit kunnen beperken15.
In het huidige werk onderzoeken we het effect van gradiëntconcentraties van resveratrol op de wild-type Escherichia coli K12-stam en onderzoeken we arabinose-induceerbare zwermmotiliteit van gemanipuleerde E. coli K12-YdeH- en Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH-soorten. De productie van het YdeH-enzym wordt geïnduceerd door arabinose via de araBAD-promotor, wat resulteert in cellulaire c-di-GMP-verstoring en de bacteriële zwermmotiliteit beïnvloedt16,17. Dit induceerbare zwermgedrag wordt bestudeerd met behulp van arabinose gradiënt zwermplaten met E. coli K12-YdeH en P. aeruginosa PAO1-YdeH stammen.
De gradiëntzwermplaten worden bereid door achtereenvolgens dubbellaags medium te stollen (figuur 1B). De onderste laag bestaat uit het medium dat met de inductor is toegevoegd en aan één kant van een gestut petrischaaltje wordt gegoten. Na de stolling van de onderste laag wordt de petrischaal teruggebracht naar een plat oppervlak, waar de bovenste laag met het medium zonder de inductor vanaf de andere kant van de plaat wordt toegevoegd. Nadat de zwermplaten volledig zijn gestold, worden isometrisch gerangschikte houderputten geproduceerd door gaten op de zwermplaten te boren volgens een vaste lay-out (figuur 1C) of door de putten te bedrukken met behulp van een 3D-geprint model van het plaatdeksel met haringen tijdens het medium uithardingsproces (aanvullende figuur S1). Een gelbeeldvormingssysteem wordt gebruikt om de zwermende morfologieën op verschillende tijdstippen vast te leggen (figuur 2). Analyse van oppervlaktezwermen met behulp van ImageJ-software (aanvullende figuur S2) levert kwantitatieve resultaten op van het oppervlaktezwermproces (figuur 3).
Daarom stellen we een eenvoudige methode voor om de oppervlaktezwermmotiliteit te testen binnen een concentratiebereik van inductoren. Deze methode kan worden gebruikt om meerdere concentratieresponsen van andere inductoren te testen door de inductor in het medium van de onderste laag te mengen en kan worden toegepast op andere beweeglijke soorten (bijv. Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Deze aanpak zou betrouwbare kwalitatieve en kwantitatieve resultaten kunnen opleveren voor het screenen van een enkele chemische inductor, en afzonderlijke platen kunnen worden gebruikt om meer chemische inductoren te evalueren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8180</td>
			<td>25 g, &#8805; 85% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>D103272</td>
			<td>AR, &#62; 99% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Arabinose</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A106195</td>
			<td>98% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM90-15</td>
			<td>Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resveratrol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>R107315</td>
			<td>99% (GC), 25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S805275</td>
			<td>AR, 99.5% (GC), 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dishes</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>B-SLPYM130F</td>
			<td>Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>Blue pard</td>
			<td>LRH-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 5200multi imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>5200CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying bacterial surface swarming motility on inducer gradient plates

Bacteriële zwermmotiliteit is een veel voorkomend microbiologisch fenotype dat bacteriële gemeenschappen gebruiken om over semisolide oppervlakken te migreren. Bij onderzoeken naar geïnduceerde zwermmotiliteit kan de specifieke concentratie van een inductor mogelijk geen gebeurtenissen melden die zich voordoen binnen het optimale concentratiebereik om de gewenste reacties van een soort uit te lokken. Semisolide platen met meerdere concentraties worden vaak gebruikt om de respons binnen een inductorconcentratiebereik te onderzoeken. Afzonderlijke halfvaste platen verhogen echter de variaties in de gemiddelde viscositeit en het vochtgehalte in elke plaat als gevolg van de niet-uniforme stollingstijd.
Dit artikel beschrijft een eenstapsmethode om tegelijkertijd de zwermmotiliteit van het oppervlak te testen op een enkele gradiëntplaat, waarbij de isometrisch gerangschikte testputten de gelijktijdige verwerving van multiconcentratieresponsen mogelijk maken. In het huidige werk werd de oppervlaktezwerm van Escherichia coli K12 en Pseudomonas aeruginosa PAO1 geëvalueerd als reactie op een concentratiegradiënt van inductoren zoals resveratrol en arabinose. Periodiek werden de zwermmorfologieën in beeld gebracht met behulp van een beeldvormingssysteem om het hele oppervlaktezwermproces vast te leggen.
De kwantitatieve meting van de zwermmorfologieën werd verkregen met behulp van ImageJ-software, die analyseerbare informatie van het zwermgebied verschafte. Dit artikel presenteert een eenvoudige gradiënt zwermplaatmethode die kwalitatieve en kwantitatieve informatie biedt over de effecten van de inductoren op oppervlaktezwermen, die kan worden uitgebreid om de effecten van andere inductoren op een breder scala van beweeglijke bacteriesoorten te bestuderen.

De workflow bestaande uit de voorbereiding van gradiëntzwermplaten, inenting en incubatie wordt weergegeven in figuur 1B. Om gradiëntgezwommen platen te genereren, wordt het medium van de onderste laag in gestutte schotels gegoten op ~ 4,3 ° van het horizontale vlak (aanvullende figuur S3), gevolgd door het gieten van het medium van de bovenste laag nadat de onderste laag volledig is gestold. De samenstelling van het dubbellaagse medium is weergegeven in tabel 1</...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates at JoVE.com

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Hier beschrijven we het gebruik van inducergradiëntplaten om bacteriële zwermmotiliteit te evalueren en tegelijkertijd meerdere concentratieresponsen te verkrijgen.

Kwantificering van de zwermmotiliteit van het bacteriële oppervlak op gradiëntplaten van inductoren

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Het protocol volgt tegelijkertijd bacteriële zwermreacties op verschillende inductorconcentraties op een semisolide agar. Dit wordt op een kosteneffectieve manier bereikt. Deze screeningstechniek met hoge doorvoer ontkracht de behoefte van agar met verschillende inductorconcentraties om de microchemotactische reacties te observeren.De techniek is ontworpen voor medicijnscreening en ook om de micropathogene SD-responsen te observeren. Ook kan het worden gebruikt om microresponsen op verschillende biochemische signalen in de menselijke gastheer te bestuderen. Deze methode kan inzicht geven in bacteriële chemotaxis.Bacteriën zullen reageren op verschillende concentraties van chemische lokstoffen die bekend staan als positieve chemotaxis of chemische insectenwerende middelen die bekend staan als negatieve chemotaxis. Een zorgvuldig voorbereide opstelling is essentieel om variaties tussen de gelhoek van de onderste laag te voorkomen om het reproduceerbaarheidsprobleem te voorkomen. Label om te beginnen vierkante petrischalen van 13 bij 13 centimeter met vlekken en inductornamen.Zet vervolgens de gerechten omhoog over de rand van de deksels. Voeg arabinose-oplossing toe aan het medium van de onderste laag. Voeg 40 milliliter warm bodemlaagmedium toe.Laat het medium van de onderste laag een uur onbedekt uitharden in een laminaire stromingskap ongestoord. Zodra de onderste laag volledig is gestold, verwijdert u de deksels en legt u de petrischalen in een laminaire stroomkap. Voeg 40 milliliter warm medium van de bovenste laag toe met behulp van een gemotoriseerd pipetfilter.Laat de dubbellaagse platen een uur lang afgedekt en ongestoord uitharden en bewaar ze vervolgens 24 uur bij vier graden Celsius. Leg het gemarkeerde A4-papier onder een goed gestold verloopplaat. Duw de bredere zijde van een pipetpunt van 100 microliter op de gemarkeerde positie in het halfvaste mediumoppervlak en druk op de pipetpunt totdat deze de bodem van het medium van de bovenste laag bereikt.Wanneer de punt de onderkant raakt, stop dan met het uitoefenen van verticale kracht op de punt en draai de punt voorzichtig om de inhoud van de cilindrische put te isoleren. Beweeg de pipetpunt horizontaal over een kleine afstand om luchtstroom in de smalle plaats mogelijk te maken. Druk met de wijsvinger op de punt om de gasstroom in de punt te blokkeren.Trek de punt verticaal naar buiten, houd de put in de punt terwijl je hem eruit trekt. Voeg 80 microliter van de nachtelijke groeicultuur toe aan elke put. Haal de zwermplaten elke 12 uur één voor één uit de couveuse en plaats ze in het gelbeeldvormingssysteem.Selecteer de gelbeeldvormingsmodus, stel de zwermplaat bloot aan wit licht en pas de brandpuntsafstand aan om een duidelijk beeld van zwermen te krijgen. Verbeter de helderheid van de zwermen voor nauwkeurige observatie door de belichtingstijd aan te passen tot 300 milliseconden. Pas de drempel aan om interferentie van het achtergrondlicht tot een minimum te beperken.Sla het afbeeldingsbestand op voor verdere analyse. Noteer de beeldtijd, het type inductor, de gradiëntoriëntatie en de spanningen in een txt-bestand. Klik op Verwerken en vervolgens op Schaduwen om de scherpte van de afbeelding te verbeteren.Klik op Verwerken gevolgd door Batch om de afbeelding te verwerken. Verwerk vervolgens een afbeelding als referentie door op Proces, Schaduwen en Zuid te klikken. Klik op Proces, Batch, Macro om het venster Batchproces te openen.Zoek naar de opdrachten die in het venster worden weergegeven. Typ het mapadres van de oorspronkelijke afbeeldingen in het adres van het uitvoerbestand door te klikken op Verwerken in het venster Batchproces. Gebruik het gereedschap voor het traceren van de toverstaf om zwermen afzonderlijk te selecteren en dubbelklik op het gereedschap voor het traceren van de toverstaf om de tolerantie aan te passen totdat de gegenereerde lijn correct op de zwermgrens past.Klik op Analyseren en vervolgens op Meten om de gebiedswaarde te exporteren. E.coli K12 YdeH werd getest op arabinose gradiëntplaten die werden gebruikt om het oppervlaktezwermproces aan te tonen met overlap tussen aangrenzende putten. Een plaat met drie testputten maakte de vorming van niet-overlappende grenzen mogelijk.P.aeruginosa PAO1 YdeH zwermmotiliteit werd bevorderd met verhoogde arabinoseconcentratie vanaf de laagste concentratie, maar geleidelijk beperkt met hogere concentraties arabinoseconcentraties. E.coli K12 wildtype stammen getest op resveratrol gradiëntplaten binnen het nul tot 400 microliter concentratiebereik vertoonden een bescheiden beperking van de zwermmotiliteit met toenemende resveratrolconcentratie. Zwermgebieden werden gekwantificeerd door ImageJ-software.De zwermcurve vertoonde de meervoudige concentratiereacties. Het meest cruciale onderdeel van deze procedure is het vervaardigen van een dubbellaagse zwermplaat met een specifiek concentratiebereik van inductoren. Deze methode stelt onderzoekers in staat om de geïnduceerde oppervlaktezwerm binnen een specifiek concentratiebereik te onderzoeken en de effecten van andere inductoren en componenten op zwermen te kwantificeren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Beoordelen van de levensvatbaarheid van een synthetische bacteriële Consortium op de In Vitro -Interface van het Gut-Host-microbe

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolatie van de Glomeruli en In Vivo Labeling van glomerulaire cel oppervlakte-eiwitten

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Een planaire beweeglijkheidstest om de biomodulating eigenschappen van natuurlijke producten te meten

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Celfractionering van U937-cellen door isopycnic density gradient purification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Dichtheidsgradiënt Ultracentrifugatie voor onderzoek naar endocytische recycling in zoogdiercellen

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...